外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)研究中的進(jìn)展

魏欣宇 王文銳 楊清玲 陳昌杰

外泌體（exosome）是一種具有脂質(zhì)雙分子層的盤狀分泌膜泡，其直徑在30～100 nm 之間。外泌體來自各種類型的細(xì)胞，包括癌細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞和多泡小體的免疫細(xì)胞［1］，故外泌體可從各種體液中分離出來，包括血液，尿液，唾液，母乳，羊水，腹水，腦脊液，膽汁和精液等。外泌體通過內(nèi)向膜出芽經(jīng)歷三個(gè)過程產(chǎn)生：細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成內(nèi)體（endosome）；內(nèi)體膜內(nèi)陷，形成多泡體（multivesicular bodies，MVB）；多泡體與質(zhì)膜融合后分泌到胞外成為外泌體［2］。外泌體在受體細(xì)胞中的MVB 處進(jìn)行反向融合，隨后釋放其攜帶的重要信號(hào)分子，在細(xì)胞間實(shí)現(xiàn)信息的傳遞［3］，形成一種新的細(xì)胞-外泌體-細(xì)胞的信息傳遞模式，介導(dǎo)體內(nèi)不同類型細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊。這些信號(hào)分子包含外泌體同源母細(xì)胞代謝物、蛋白質(zhì)、脂類和豐富的核酸分子（mRNA、tRNA、lncRNA、circRNA、microRNA 等）以及外泌體中特定細(xì)胞成分的功能性，靶向性，機(jī)制驅(qū)動(dòng)性積累［4］。

1 外泌體在疾病進(jìn)程中的作用

外泌體可參與細(xì)胞增殖、分化、血管生成和傷口愈合等許多生物學(xué)過程，也可通過癌基因或者腫瘤抑制因子在腫瘤細(xì)胞間的傳遞促進(jìn)腫瘤的發(fā)生或抵消腫瘤的進(jìn)展。已有許多研究證明在改善心功能和減輕心肌纖維化等方面，干細(xì)胞釋放的外泌體顯示出其潛在的細(xì)胞治療和心臟修復(fù)能力［5］。另外，外泌體促進(jìn)血管生成，但在炎癥條件下，單核細(xì)胞衍生的外泌體可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的凋亡，這是人類血管疾病的重要發(fā)生過程。外泌體還可調(diào)節(jié)基因表達(dá)和驅(qū)動(dòng)免疫抑制或免疫刺激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程，如腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可通過同時(shí)誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的凋亡來實(shí)現(xiàn)免疫逃避。在代謝性疾病中，腫瘤來源的外泌體作用于小鼠和人的脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞而加重機(jī)體惡病質(zhì)，促進(jìn)腫瘤及其他慢性疾病的進(jìn)展［6］。

2 外泌體在腫瘤微環(huán)境中的作用和機(jī)制

腫瘤微環(huán)境（TME）是腫瘤的發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境，其組成成分包含腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫和炎癥細(xì)胞、骨髓源性細(xì)胞以及與腫瘤建立復(fù)雜交叉關(guān)系的細(xì)胞外基質(zhì)［7］。外泌體是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分。腫瘤來源外泌體包含的腫瘤抗原和熱休克蛋白刺激免疫反應(yīng)，包含的抑制分子配體如Fas-L、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和前列腺素E2（PGE2）既可降低細(xì)胞毒性又能建立免疫抑制腫瘤微環(huán)境［8］。腫瘤來源的外泌體miRNA 在TME 中誘導(dǎo)基質(zhì)重編程，創(chuàng)造有利于腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸和化療耐藥的微環(huán)境［9］。在前列腺癌中，外泌體中攜帶的物質(zhì)促進(jìn)前列腺癌相關(guān)細(xì)胞的結(jié)締組織增生，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［10］。

2.1 外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中所起的作用和相應(yīng)機(jī)制

腫瘤轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，許多研究已經(jīng)確定了外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中的直接侵襲作用和通過促進(jìn)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)化和建立轉(zhuǎn)移前利基的特定效應(yīng)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用［11］。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體具有將轉(zhuǎn)移潛能轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的能力，可為特定器官的細(xì)胞提供腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境［12］。Chen［13］等從唾液腺腺樣囊性癌（SACC）患者血漿中分離出的外泌體中高表達(dá)lncRNA MRPL23 反義RNA 1（MRPL23-AS1），其與肺轉(zhuǎn)移和總體生存相關(guān)。MRPL23-AS1 以“外泌體分泌”方式作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加了微血管的通透性，協(xié)助體內(nèi)SACC 癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。用腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞分泌的外泌體預(yù)處理腦微環(huán)境可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的生長。腦轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織和外泌體中CEMIP 升高，CEMIP+外泌體被腦內(nèi)皮細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞攝取后上調(diào)Ptgs2，Tnf 和Ccl/Cxcl 編碼的促炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)血管周圍小生境中的內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥，促進(jìn)腦血管重塑和轉(zhuǎn)移［14］。在引發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌亞型中，上調(diào)的circLONP2 調(diào)節(jié)miR-17 的細(xì)胞內(nèi)成熟，上調(diào)的成熟miR-7 以外泌體的形式被鄰近細(xì)胞內(nèi)化而引起轉(zhuǎn)移起始能力在原發(fā)部位擴(kuò)散并加速異種器官腫瘤轉(zhuǎn)移的形成［15］。另外，最近的研究［16］表明，對放化療殺傷的垂死腫瘤細(xì)胞分泌的大量外泌體進(jìn)行RNA-Seq 檢測發(fā)現(xiàn)明顯變化的miRNAs，其中miR-194-5p 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，阻止細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期并促進(jìn)DNA 損傷反應(yīng)，增強(qiáng)TRCs 的存活，進(jìn)而調(diào)控E2F3 的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞再增殖和重新聚集。

2.2 外泌體與耐藥誘導(dǎo)相關(guān)研究

Boelens 等［17］發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞可通過分泌信號(hào)驅(qū)動(dòng)化療和放療耐藥，通過異型相互作用，外泌體從基質(zhì)轉(zhuǎn)移到乳腺癌細(xì)胞。外泌體中的RNA（主要是非編碼轉(zhuǎn)錄本和轉(zhuǎn)座元件）刺激模式識(shí)別受體RIG-I 激活stat1 依賴的抗病毒信號(hào)，促進(jìn)對NOTCH3 的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并擴(kuò)大治療抵抗腫瘤起始細(xì)胞。研究［18］證明在胃癌中，外泌體miR-522 主要來自于腫瘤微環(huán)境中的CAFs。順鉑和紫杉醇激活USP7/hnRNPA1 軸促進(jìn)CAFs 中miR-522的分泌，進(jìn)而降低ALOX15 的表達(dá)，減少癌細(xì)胞中脂質(zhì)ros 的積累，最終降低化療敏感性。在表皮生長因子受體2 陽性（HER-2+）乳腺癌患者中，增強(qiáng)的miR-567 可以被包裝成外泌體，整合到受體細(xì)胞中，通過靶向ATG5 抑制自噬和逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥［19］。異質(zhì)腫瘤可從外泌體中獲得耐藥表型。實(shí)驗(yàn)證明［20］，短暫暴露于化療藥物可以顯著增加Rab8 介導(dǎo)的耐藥細(xì)胞釋放含有ABCB1 的細(xì)胞外囊泡，并通過Rab5 的下調(diào)加速這些細(xì)胞外囊泡循環(huán)回到敏感腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜上。細(xì)胞間ABCB1轉(zhuǎn)移顯著增強(qiáng)，敏感的癌細(xì)胞獲得迅速但不可穩(wěn)定持續(xù)存在的抗性，以逃避化療藥物的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)放射治療有助于改變外泌體的分泌動(dòng)態(tài)，x 射線可以以劑量依賴的方式激活MCF-7 細(xì)胞外泌體的生成和分泌，細(xì)胞通過改變活性氧和外泌體活性實(shí)現(xiàn)治療反應(yīng)［21-22］。結(jié)直腸癌中，CAFs 來源的外泌體可以激活轉(zhuǎn)化生長因子factorβ（TGF-β）信號(hào)通路，而TGF-inhibitor 1 中和抗體可抑制這一作用，降低干細(xì)胞基因的克隆性和表達(dá)水平，CAFs 分泌外泌體促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性，從而增加輻射抗性［23］。癌細(xì)胞的照射促進(jìn)了tet2介導(dǎo)的miR-378 啟動(dòng)子的去甲基化，miR-378a-3p過表達(dá)及其在外泌體中的負(fù)載，誘導(dǎo)NK 細(xì)胞顆粒酶b（GZMB）分泌減少，GZMB 表達(dá)降低導(dǎo)致NK 細(xì)胞毒性降低。故外泌體miRNA-378a-3p 在癌細(xì)胞中的過表達(dá)限制了自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［24］。

2.3 外泌體誘導(dǎo)免疫作用

腫瘤來源的外泌體（TEX）參與腫瘤的免疫抑制過程。TEX 將基因組DNA、mRNA 和miRNAs等信息傳遞到免疫細(xì)胞，重新編碼應(yīng)答細(xì)胞的功能，直接或間接影響免疫細(xì)胞的發(fā)育、成熟和抗腫瘤活性［25］。現(xiàn)已證明腫瘤和免疫細(xì)胞來源的外泌體攜帶腫瘤抗原并促進(jìn)免疫，導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞活化，直接抑制腫瘤生長和對惡性腫瘤發(fā)展的抵抗［26］。在TEM 中，過表達(dá)的VEGF 和激活的VEGFR 以及磷脂酰絲氨酸由細(xì)胞和外泌體內(nèi)膜到外膜的活化均可觸發(fā)免疫抑制作用，如抑制免疫細(xì)胞Treg 對NK、NKT、CD4+、CD8+等抗原提呈細(xì)胞的抑制作用［27］。實(shí)驗(yàn)［28］證明，乳腺腫瘤細(xì)胞中上調(diào)CD73 表達(dá)的lncRNA SNHG16 可由癌細(xì)胞分泌的外泌體傳遞到Vδ1 T 細(xì)胞，SNHG16 通過海綿化吸收miR-16-5p 通過ceRNA 作用，導(dǎo)致其靶基因SMAD5 的失調(diào)，增強(qiáng)TGF-inhibitor 1/SMAD5 通路，上調(diào)Vδ1 T 細(xì)胞中CD73 的表達(dá)，證實(shí)了乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體SNHG16/miR-16-5p/SMAD5 調(diào)控軸增強(qiáng)了TGF-cada1/SMAD5 通路的激活，從而誘導(dǎo)了CD73 的表達(dá)，增強(qiáng)T 細(xì)胞功能。

3 外泌體修飾

關(guān)于外泌體在腫瘤發(fā)生和治療方面已有諸多研究，外泌體用作診斷工具主要涉及使用可控外泌體，而不是利用天然外泌體的特性。外泌體的來源細(xì)胞的特性常被改造以產(chǎn)生具有特定生物學(xué)特點(diǎn)修飾的外泌體。在腫瘤微環(huán)境中，外泌體是程序性死亡配體1（PD-L1）進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，遠(yuǎn)處的腫瘤細(xì)胞可以通過外泌體PD-L1 對激活的T 細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)程攻擊實(shí)現(xiàn)免疫逃逸［29］。對T 細(xì)胞進(jìn)行修飾，效應(yīng)CAR-T 細(xì)胞分泌的CAR 外泌體表面攜帶CAR，表達(dá)高水平的細(xì)胞毒性分子并抑制腫瘤生長，但不表達(dá)程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD1）并且重組PD-L1 治療不會(huì)降低CAR-T 細(xì)胞外泌體的抗腫瘤作用。CAR 外泌體比CAR-T 細(xì)胞的治療應(yīng)用更安全［30］。另外，外泌體還可以通過添加腫瘤靶標(biāo)配體進(jìn)行修飾或功能化，有研究為了對外泌體進(jìn)行基因修飾，使用兩種不同表面的單克隆抗體，開發(fā)了一個(gè)用于控制細(xì)胞免疫的外泌體平臺(tái)：SMART-Exo。Shi X［31］通過抗人CD3 和抗人HER2 抗體的基因展示工程化外泌體，將SMART-Exo 應(yīng)用于表達(dá)人類表皮生長因子受體2（HER2）的乳腺癌，從而導(dǎo)致SMART-Exos 雙重靶向T 細(xì)胞CD3 和乳腺癌相關(guān)的HER2 受體，通過重定向和激活細(xì)胞毒性T 細(xì)胞使其攻擊HER2+的乳腺癌細(xì)胞。設(shè)計(jì)的SMARTExos 在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出高度有效的特異性抗腫瘤活性。最近還有研究［32］提出用微流體超聲處理方法，直接生成包含成像劑的外泌體膜（EM）、癌細(xì)胞膜（CCM）和脂質(zhì)涂層聚乳酸-糖基乙酸（PLGA NP），由內(nèi)體和質(zhì)膜蛋白組成的腫瘤細(xì)胞來源的EM 包被的PLGA NPs 在體外和體內(nèi)模型中均比大小和核殼結(jié)構(gòu)相近的CCM-PLGA NPs 具有精確的同型靶向性。這種方法明顯提高了抗腫瘤的特異性。實(shí)驗(yàn)［33］證明基于工程外泌體的抗結(jié)腸癌藥物5-FU 和miR-21 共傳遞系統(tǒng)能有效的促進(jìn)細(xì)胞攝取并顯著下調(diào)5-FU 耐藥細(xì)胞中miR-21 的表達(dá)。

4 前景與展望

外泌體的生物學(xué)作用在疾病中的研究仍在進(jìn)行，并且針對其實(shí)用價(jià)值和各種病理的診斷和治療的研究數(shù)量已大幅增加。這種優(yōu)勢在于對疾病進(jìn)行檢測和監(jiān)測時(shí)，外泌體攜帶物質(zhì)的復(fù)雜性提供了一個(gè)多功能的診斷窗口。外泌體在向病變細(xì)胞運(yùn)送功能性貨物時(shí)的特征特性使其成為較好的治療載體，無論是在基礎(chǔ)水平還是應(yīng)用水平［34］。最近幾年，科研人員一直都致力于探究外泌體的臨床應(yīng)用，包括外泌體作為生物標(biāo)志物檢測疾病的高效性和特異性、改造外泌體以提高其運(yùn)載能力和外泌體在藥物方面的應(yīng)用。此外，外泌體作為細(xì)胞間的通訊媒介，其介導(dǎo)的核酸傳遞是一種很有前景的基因治療策略［35］。總之，外泌體有望在腫瘤研究中取得進(jìn)一步的進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)其在腫瘤早期檢測，診斷及治療中的臨床應(yīng)用。