中藥單體及復(fù)方對肝癌細胞中NF-κB 相關(guān)信號通路的作用機制

夏弋欽，修麗梅，郭利華

1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院內(nèi)分泌科；3 云南省中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科

原發(fā)性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的五大腫瘤之一，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排第 5 位，死亡率在腫瘤相關(guān)死亡中排第 3 位［1］。我國有全球近一半的肝癌患者，2013 年我國肝癌發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平［2］。

肝癌的發(fā)生與慢性炎癥密切相關(guān)，慢性炎癥既參與腫瘤生長的調(diào)控，也是腫瘤外環(huán)境的組成部分。大部分HCC 患者都經(jīng)歷了從肝炎、肝硬化到肝臟腫瘤3 個階段，即“炎-癌轉(zhuǎn)化”過程，慢性炎癥貫穿了肝癌發(fā)生、發(fā)展的全過程，因此，任何能夠調(diào)節(jié)HCC 患者炎-癌轉(zhuǎn)化過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)的手段，都可能成為防治肝癌的有效方法。臨床肝癌的治療常以手術(shù)治療為主，輔以放化療結(jié)合的綜合治療方案，該方案雖然有一定療效，但依然存在預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高等缺點。中藥在肝癌的治療中應(yīng)用廣泛，在其應(yīng)用過程中遵循“辨證論治”原則，可根據(jù)患者病情、病癥的不同隨證加減，其副作用低、可改善患者生存質(zhì)量并延長生存時間。

核因子κB（nuclear factor-κappa B，NF-κB）是一類具有多向調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子，是抗凋亡基因表達的主要激活子［3］，其活性被認為與炎癥、細胞凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中藥單體及復(fù)方能否通過調(diào)節(jié)NF-κB 途徑調(diào)控肝癌細胞的增殖與凋亡，對于探討中藥組分抗腫瘤的分子機制具有重要意義。

1 肝癌炎-癌轉(zhuǎn)化過程中NF-κB 通路表達情況與意義

現(xiàn)代研究證實，腫瘤的發(fā)生是細胞增殖與細胞凋亡失衡所致，促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是導(dǎo)致腫瘤生長受到抑制、腫瘤細胞走向凋亡的主要原因［4］。NF-κB 的異?；罨瘯?dǎo)致細胞周期失控，使得細胞無限增殖形成腫瘤細胞。NF-κB 的常見形式為RelA（P65），在靜息狀態(tài)下，其以同源或異源二聚體的形式與NF-κB 內(nèi)源性抑制因子IκB 家族蛋白結(jié)合并存在于細胞質(zhì)中，當受到諸如細菌侵襲等因素刺激時產(chǎn)生核易位。NF-κB以P50/P65二聚體含量最多，通常所指的NF-κB即P50/P65二聚體［5-6］。Nod樣受體蛋白3（NOD-like receptor-family pyrin domain containing 3，NLRP3）是目前研究最為深入的一種炎癥小體，能通過PYD 結(jié)構(gòu)域招募凋亡相關(guān)點樣蛋白（apoptosis associatedspecκ-like protein containing a CARD，ASC）和 procaspase-1 組成炎癥復(fù)合體［7］，NLRP3 的活化主要為經(jīng)典途徑，表現(xiàn)為“二次激活”過程：第一信號激活Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）受體，促進NF-κB活化并介導(dǎo)白細胞介素1p（interleukin 1p，IL-1p）和白細胞介素 18（interleukin 18，IL-18）等前體產(chǎn)生以及上調(diào)NLRP3［8］；第二信號促進炎癥蛋白復(fù)合物組裝，活化的Caspase-1 促進白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）和IL-18 前體的剪切活化并釋放到胞外［9］，引起瀑布級聯(lián)式的炎癥反應(yīng)［10-11］。中藥被認為具有多靶點、多分子、雙向調(diào)節(jié)的作用特性，現(xiàn)階段中藥單體和復(fù)方對肝癌發(fā)展中NF-κB 相關(guān)通路的研究日益增多，找到其中的作用靶點與機制，可幫助分析NF-κB 相關(guān)通路與肝癌的關(guān)系，明確中藥精準治療肝癌的NF-κB相關(guān)通路機制。

2 中藥單體對肝癌細胞中NF-κB 相關(guān)通路作用機制

2.1 生物堿類黃連素是一種季胺類異喹啉生物堿，提取于毛梗科植物的根莖中?，F(xiàn)代研究表明，黃連素對肝癌具有較好的治療效果?？律茥澋龋?2］研究發(fā)現(xiàn)黃連素在HepG2 細胞中對腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor，TNF-α）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達具有抑制作用，可能通過抑制 NF-κB 活性，抑制 IκB 降解和抑制 NF-κB（P65）入核實現(xiàn)，VEGF 作為主要的血管生成促進因子，能刺激內(nèi)皮細胞遷徙和增殖，促進微小肝癌血管形成，增加血管通透性并促進腫瘤轉(zhuǎn)移［13-14］。

苦參堿是傳統(tǒng)中藥苦參的主要活性成分，常用于肝纖維化及皮膚疾病等的治療?？鄥A能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞的分化和凋亡。在肝癌細胞HepG2實驗中發(fā)現(xiàn)苦參堿誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡呈時間和劑量依賴性［15］。樊浩等［16］研究發(fā)現(xiàn)苦參堿在誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的同時會激活NF-κB信號通路，這與高航等［17］研究結(jié)果一致，隨著苦參堿濃度的增加，NF-κB mRNA 的表達隨之增加，認為苦參堿在誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的過程中活化了NF-κB，這可能是肝癌細胞對苦參堿早期耐藥的機制之一。同時，研究還發(fā)現(xiàn)在不同類型細胞中，苦參堿對NF-κB的作用有可能相反，如在肝癌細胞SMMC-7721 中，苦參堿抑制NF-κB 表達進而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）的 表達［18］；而在HepG2細胞中，苦參堿卻具有促進NF-κB表達的作用。因此高航等［17］認為，肝癌化療過程中應(yīng)用苦參堿應(yīng)當聯(lián)用具有抑制NF-κB 表達的化療藥物以增強化療效果和減少藥物耐受。

2.2 皂苷類皂苷在自然界分布廣泛、資源豐富，主要存在于單子葉植物百合科的絲蘭屬和知母屬，主要由皂苷元和糖、糖醛酸及其他有機酸組成［19］。中藥中常見的皂苷類型有柴胡皂苷、人參皂苷和七葉皂苷。

柴胡中的柴胡皂苷D（saikosaponian D，SSD）是一類具有廣譜抗癌作用的提取物，張豐華等［20］發(fā)現(xiàn)經(jīng)SSD 處理后的肝癌細胞形態(tài)有向正常方向逆轉(zhuǎn)演變的趨勢，SSD 可抑制NF-κB 的核內(nèi)表達，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，低濃度時誘導(dǎo)分化作用明顯，較高濃度時抑制細胞毒作用較明顯，且呈一定凋亡作用。

人參皂苷Rb1 是一種四環(huán)三萜類皂苷，是人參二醇系皂苷的代表成分之一，人參皂苷Rb1 具有增強機體免疫力、抗氧化和廣譜抗腫瘤的功效，Rb1可降低核NF-κB蛋白表達水平，抑制NF-κB異位，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕膽汁淤積性肝纖維化?？赏ㄟ^抑制NF-κB信號通路的激活及其下游TNF-α和IL-1β等炎性因子表達，發(fā)揮抗炎護肝作用［21］。

七葉皂苷鈉是從中藥娑羅子干燥成熟果實中提取的三萜皂甙鈉鹽，研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉可抑制肝癌細胞系的增殖，促進其凋亡，且對正常肝細胞無毒性作用［22］。實驗主要研究Caspase 募集域和膜相關(guān)鳥苷酸激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白3（CARD recruited membrane associated protein 3，CARMA3），兩者是NF-κB 上游調(diào)節(jié)因子，實驗表明七葉皂苷鈉能夠抑制CARMA3 及其下游NF-κB 的表達。因此認為七葉皂苷鈉通過抑制肝癌中被激活的CARMA3/NF-κB 信號傳導(dǎo)通路，從而有效抑制肝癌細胞系的增殖。

2.3 多酚類姜黃中的姜黃素能抑制肝癌細胞HepG2 的增殖，其機制可能與下調(diào)Notch1、NF-κB表達有關(guān)。其中NF-κB是Notch1的靶基因之一［23］。Notch 信號通路可以通過基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白間相互作用來調(diào)節(jié)目的基因NF-κB 的表達，Notch1的胞內(nèi)段（Notch1IC）與NF-κB 的抑制蛋白IκB-α競爭性結(jié)合，從而激活NF-κB，另外有研究證實，Notch受體胞內(nèi)段還可以與IKK信號肽相互激活，通過經(jīng)典途徑激活NF-κB表達［19］。

丹皮酚是中藥牡丹皮中提取的活性成分，丹皮酚可誘導(dǎo)某些腫瘤細胞凋亡。錢翠娟等［24］實驗發(fā)現(xiàn)丹皮酚能增強TNF-α 誘導(dǎo)的細胞凋亡，同時發(fā)現(xiàn)該作用可能與丹皮酚降低TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化有關(guān)，而抑制NF-κB 活化可增強腫瘤細胞對放療、化療的敏感性，促進腫瘤細胞凋亡。丹皮酚濃度越高，抑制作用越強，呈明顯的濃度依賴關(guān)系。

厚樸中的和厚樸酚是一種具有抗血栓、抗菌和抗腫瘤作用的活性物質(zhì)。實驗研究［25］表明和厚樸酚降低了人肝癌HepG2 細胞存活數(shù)目，在濃度40～160 μmol/L 范圍內(nèi)對人肝癌 HepG2 細胞增殖呈時間-劑量依賴關(guān)系，用藥24 h 后NF-κB 基因mRNA 表達下調(diào)，這可能為和厚樸酚誘導(dǎo)HepG2 細胞凋亡的機制。

迷迭香酸是中藥冬凌草、紫草等的主要成分，亦存在于香料植物迷迭香中，研究發(fā)現(xiàn)其能使小鼠肝癌H22皮下移植瘤模型促凋亡蛋白Bax 和Caspsase-3 蛋白表達升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達降低，同時使NF-κB 信號通路受到抑制［26］；此外，在人肝癌HepG2 細胞株實驗中迷迭香酸能抑制HepG2 細胞增殖，促進其凋亡，其作用主要是通過下調(diào)Vimentin/NLRP3 蛋白表達來實現(xiàn)。波形蛋白（Vimentin）是中間纖維的主要組成部分，參與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，可驅(qū)動NLRP3 炎癥小體/Caspase-1炎癥信號通路［27］。

2.4 有機酸類莽草酸是八角科植物八角茴香即中藥大茴香的提取物，朱開梅等［28］發(fā)現(xiàn)莽草酸使人肝癌 HepG-2 細胞 NF-κB（p65）表達減弱，且呈現(xiàn)時間-劑量依賴性，因此認為其誘導(dǎo)人肝癌HepG2細胞凋亡作用機制可能與下調(diào)NF-κB 表達有關(guān)。

3 中藥復(fù)方對肝癌細胞中NF-κB 相關(guān)通路作用機制

3.1 健脾益氣方健脾益氣方由黃芪30 g，白術(shù)10 g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、白芍15 g、神曲10 g和法半夏10 g 組成。有實驗［29］發(fā)現(xiàn)在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）模型中，該方可降低肝癌細胞SMMC-7721中Vimentin、PARP-1、NLRP3 和 Caspase-1 蛋白表達，升高Caspase-3 蛋白水平；Vimentin 蛋白水平的下調(diào)會使肝癌細胞增殖與侵襲受到抑制，并誘導(dǎo)部分肝癌細胞凋亡；導(dǎo)致Vimentin 下調(diào)的原因可能在于Caspase-3 對它的裂解，健脾益氣方一方面利用Caspase3/Vimentin 裂解片段形成正反饋促凋亡信號誘導(dǎo)肝癌細胞發(fā)生凋亡，另一方面可能利用Vimentin 水平下調(diào)進一步促使NLRP3/Caspase-1炎癥信號下調(diào)，抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

3.2 益脾養(yǎng)肝方益脾養(yǎng)肝方是陜西省名中醫(yī)常占杰教授治療肝硬化進展期的驗方［30］，由白術(shù)、黨參、熟地黃、鱉甲、枸杞、半枝蓮、郁金、姜黃、白花蛇舌草各5 g組成，具有益脾養(yǎng)肝、行氣活血、解毒散結(jié)的功效。益脾養(yǎng)肝方被認為可以改善肝臟功能，被廣泛應(yīng)用于肝臟癌前病變的預(yù)防和治療中。李京濤等［31］建立大鼠肝臟癌前病變模型，分析益脾養(yǎng)肝方對大鼠癌前病變進程的影響，結(jié)果顯示與模型組相比，益脾養(yǎng)肝方組大鼠病理形態(tài)得到改善，血清IL-6、TNF-α、NF-κB 和 STAT3 蛋白水平均降低，且大劑量組低于小劑量組，提示益脾養(yǎng)心方可抑制肝臟炎癥反應(yīng)。方中白術(shù)、鱉甲、半枝蓮和白花蛇舌草等有效成分已經(jīng)被證實具有抗腫瘤、促進細胞凋亡和減少腫瘤微血管形成的作用，半枝蓮醇提取物被證實可通過阻止NF-κB 誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)因子IL-6、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等的釋放，促進肝臟谷胱甘肽的表達而發(fā)揮護肝作用；白術(shù)內(nèi)酯I 可促進細胞凋亡，減少腫瘤微血管形成，起到抗腫瘤的作用；鱉甲活性多肽可抑制小鼠肝纖維化。

3.3 芍藥軟肝方芍藥軟肝方是浙江省腫瘤醫(yī)院治療中晚期肝癌的經(jīng)驗方，該方以清熱解毒為主，健脾行氣為輔，由白毛藤、白茅根、白花蛇舌草、半枝蓮、矮地茶、三葉青、三棱、莪術(shù)、芍藥等組成。徐海燕等［32］分析荷肝癌H22小鼠，發(fā)現(xiàn)芍藥軟肝方具有抑制腫瘤生長的作用，該作用機理是通過下調(diào)荷瘤小鼠腫瘤組織NF-κB、VEGF 表達，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1R Ⅱ（transforming growth factorβ1RⅡ，TGF-β1RⅡ）的表達，從而抑制腫瘤組織新生血管生成，抑制腫瘤細胞增殖，實現(xiàn)其抗腫瘤作用。

3.4 十全大補湯十全大補湯主要由熟地黃、黃芪、肉桂、人參、當歸、茯苓和白術(shù)等藥物組成，羅海鷗［33］發(fā)現(xiàn)其可提高小鼠H22肝癌模型中化療藥物5-Fu 對小鼠肝癌的抑瘤率，增加骨髓造血細胞中NF-κB表達及抑制Caspase-3表達，說明抗凋亡和促進骨髓細胞增殖是其解毒作用機制之一。

3.5 消癌解毒方消癌解毒方由白花蛇舌草、僵蠶、蜈蚣和太子參組成。李棟等［34］進行人肝癌細胞SMMC-7721 干預(yù)實驗，結(jié)果顯示消癌解毒方具有良好的抑制人肝癌細胞株增殖的作用，其抗腫瘤機制可能是含藥血清與CD284 能協(xié)同作用于人肝癌細胞株的Toll 樣受體TLRs/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的異常持續(xù)活化，促進腫瘤細胞凋亡。

在人肝癌細胞株中通過TLR4/NF-κB 通路上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1a（HIF-1a mRNA）和VEGF，促進肝癌的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤細胞表達TLRs，并且TLRs信號有助于腫瘤的免疫逃逸和發(fā)展。

3.6 益氣活血軟堅解毒方益氣活血軟堅解毒方由黃芪、炒白術(shù)、田三七、水紅花子、藤梨根、凌霄花、炮山甲、白花舌蛇草、半枝蓮組成，能增強肝癌H22615 細胞凋亡模型中凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因Fas蛋白表達，降低FasL 表達，增強促細胞凋亡調(diào)控基因Bax蛋白表達，降低細胞凋亡保護基因NF-κB、Bcl-2及突變型p53基因表達，從而誘導(dǎo)細胞凋亡［35］。

4 討論

NF-κB 基因是一種重要的抑制細胞凋亡的基因，抑制NF-κB 基因的表達可使肝癌細胞進入凋亡狀態(tài)，中藥單體的實驗大部分選用HepG2 細胞、MMC-7721 細胞等肝癌細胞株做體外細胞株實驗，中藥單體效應(yīng)分子有NF-κB蛋白（P65）、NF-κB mRNA、IκB、VEGF、MMP-9、P38MAPκ、CARMA3、Caspase-1 以及Caspase-3 和Vimentin 等，其主要作用靶點針對NF-κB的轉(zhuǎn)錄與翻譯以及NLRP3的激活；除苦參堿外，所有中藥單體均通過下調(diào)NF-κB 表達，抑制NLRP3 激活，減少 NF-κB 的下游效應(yīng)分子，進而促進肝癌細胞的凋亡，達到治療肝癌的目的。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，相較于中藥單體的作用靶點更加多樣，作用機制難以從單方向或單通路闡明，故研究多集中在對效應(yīng)蛋白的監(jiān)測與肝癌細胞凋亡率等展開，Vimentin、PARP-1、NLRP3 和Caspase-1 蛋白以及 TLR4、NF-κB 蛋白、VEGF、Fas蛋白等是主要效應(yīng)分子，中藥復(fù)方的通路節(jié)點主要包 括 Vimentin/NLRP3/Caspase-1、TLR4/NF-κB、NF-κB/VEGF 等，目前所有作用于肝癌細胞NF-κB/NLRP3 相關(guān)通路的中藥復(fù)方均顯示出通過對該通路產(chǎn)生抑制作用而促進肝癌細胞的凋亡，而部分中藥復(fù)方可激活凋亡相關(guān)基因聯(lián)合誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，此外還有部分中藥復(fù)方對腫瘤組織新生血管生成的相關(guān)促進因子具有抑制能力。

目前無論中藥單體還是中藥復(fù)方，對肝癌NF-κB相關(guān)通路研究均針對癌株細胞，對于實體移植瘤或人體內(nèi)的癌組織中的癌旁組織研究甚少，實驗證據(jù)不充分，難以解釋NF-κB 通路在癌旁組織中激活的矛盾性，在炎癥發(fā)展、積聚的早期，NLRP3炎癥小體的作用是促進加劇炎癥發(fā)生，促進炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化，不管是其介導(dǎo)的正常細胞炎癥反應(yīng)，還是通過細胞焦亡方式導(dǎo)致的劇烈炎癥聚集反應(yīng)，都會創(chuàng)造炎-癌轉(zhuǎn)化條件，并且由于大量炎性分子的瀑布性級聯(lián)反應(yīng)影響可能遠遠大于由于“細胞焦亡”帶來的機體保護反應(yīng)，此時，抑制其活化過程可能逆轉(zhuǎn)炎-癌轉(zhuǎn)化事件；但隨著癌灶的形成，NLRP3 炎癥小體在腫瘤組織內(nèi)表達下降［36］，而正常肝細胞GM-CSF、NLRP3和TLR4 mRNA的表達水平均高于肝癌細胞［37］。中藥針對肝癌炎-癌轉(zhuǎn)化過程的作用機制尚需進一步闡明。