冰凍組織樣本病理質(zhì)控在轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用價值

王燦銘，張慧萍，黃旻然，吳映雪，泮曉丹，胡錦林，應(yīng)莉莎，蘇丹

在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代，隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的快速發(fā)展，組織樣本的需求日益增長。雖然甲醛固定的石蠟包埋組織能解決部分研究的需求，但在大多數(shù)情況下，冷凍組織更受研究者的青睞，尤其是保存完好及高質(zhì)量的樣本，可確保下游實驗的順利進(jìn)行和結(jié)果的準(zhǔn)確性。通常，研究者對冰凍樣本的核酸質(zhì)量和濃度比較關(guān)注，是下游分子生物實驗前的常規(guī)檢測[1]，但冰凍樣本病理質(zhì)控常被忽略，如病理診斷的再復(fù)核及腫瘤細(xì)胞含量等。有研究表明，10%的冷凍組織樣本不適合下游分子檢測，主要原因包括取材或診斷的不準(zhǔn)確可導(dǎo)致研究結(jié)果偏倚[2]。冰凍組織樣本病理質(zhì)控在轉(zhuǎn)化研究中扮演著至關(guān)重要的作用。本研究對93 例非小細(xì)胞肺癌共848 份組織樣本進(jìn)行冰凍染色、病理診斷復(fù)核和腫瘤細(xì)胞含量評估。此外，對部分組織DNA 及RNA濃度與質(zhì)量進(jìn)行分析，為下游RNA測序和基因組測序的順利進(jìn)行和結(jié)果分析及解讀奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 組織樣本 選取中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院生物樣本庫2008 年4 月至2015 年7 月在－80 ℃低溫冰箱保存的非小細(xì)胞肺癌樣本93 例，其中鱗癌65例，腺癌28 例；手術(shù)時年齡44 ～77 歲，平均（63.4±7.3）歲；均為男性。根據(jù)生物樣本庫的樣本庫存情況，每個病例取腫瘤組織、癌旁組織（離腫瘤組織1 ～1.5 cm處）和遠(yuǎn)離腫瘤的正常組織（離腫瘤組織5 cm以外或更遠(yuǎn)處）各1 ～4 份，共計組織樣本848 份。其中腫瘤組織315 份，癌旁組織204 份，正常組織329 份。所有樣本均為中國科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院手術(shù)樣本，標(biāo)本離體后30 min 內(nèi)由生物樣本庫專職人員取材，分裝在有RNA 保存液的冷凍管后放入液氮中臨時保存，后轉(zhuǎn)入－80 ℃低溫冰箱中保存。

1.2 實驗設(shè)備及材料 三洋冰箱、賽默飛NX50 冷凍切片機(jī)、OCT包埋劑、Nano Drop 2000 分光光度計、Agilent2100 生物分析儀及核酸提取試劑盒等。

1.3 組織樣本病理形態(tài)學(xué)評估

1.3.1 冷凍切片的制作 組織樣本通過冷凍切片機(jī)制作冷凍切片，制片前機(jī)器設(shè)備去除RNA對樣本的影響，包括冷凍切片機(jī)的消毒清洗；制片前先將冷凍切片機(jī)斷電化霜清洗，清洗干凈后箱體內(nèi)擦焦炭酸二乙酯（DEPC）水，一次性切片刀在DEPC 水中浸泡10 min；冷凍切片機(jī)箱體溫度預(yù)先設(shè)置－30 ℃。制片時打開速凍臺制冷，切片用力均勻，防卷板調(diào)整至合適位置；每切一個樣本換一把新刀，同時將切片刀座、防卷板等部件用無水酒精擦拭，避免污染；待切樣本在干冰中臨時保存，切片時直接從干冰中拿?。辉诶錁颖就猩嫌眠m量OCT 包埋劑將組織包埋好，壓上冷凍錘放置于速凍臺至組織完全冷凍；癌組織切片厚度為5 m，正常組織可適當(dāng)加厚至6 m；勻速切片后經(jīng)甲醇固定，進(jìn)行HE 染色，封固；冰剩組織去除OCT包埋劑后放入RNA保存液中低溫保存，用于下游實驗。

1.3.2 鏡下形態(tài)學(xué)觀察 冷凍切片制作完成后由高年資病理醫(yī)師鏡下閱片，診斷切片與原病理結(jié)果是否一致，并計算腫瘤組織樣本中腫瘤細(xì)胞所占的比例。

1.4 RNA 的提取及質(zhì)控

1.4.1 組織樣本總RNA提取方法（1）組織置于離心管后在液氮下研磨成粉，取少量加至有1 ml Trizol 的1.5 ml 離心管中，充分混合后于4 ℃，12 000 r/min離心15 min。（2）取上清移至新1.5 ml離心管中，加入200 l氯仿，劇烈震蕩直至呈乳白色，于4 ℃，12 000 r/min 離心15 min。（3）取上清移至新1.5 ml 離心管中，加入500 l 異丙醇，輕輕顛倒10 次，冰上放置20 min，于4 ℃，12 000 r/min 離心15 min。（4）棄上清，加入1 ml 75%乙醇（用DEPC水現(xiàn)配現(xiàn)用），于4℃，12000r/min離心5 min，重復(fù)此步驟一次。（5）棄上清后，室溫干燥5 ～7 min。（6）加入20～30 l 的DEPC 水溶解沉淀65 ℃溶解，－20 ℃保存。

1.4.2 RNA 純度和完整性檢測 取2 l提取好的RNA溶液，利用分光光度計檢測其濃度和純度，通過OD260/280 判斷RNA 純度。利用Agilent2100 生物分析儀測量RNA 的完整性指數(shù)（RIN）。

1.5 DNA 的提取及質(zhì)控

1.5.1 DNA提取方法（1）冷凍樣本加入10 倍體積的組織保護(hù)液，置于4 ℃中解凍。（2）往20 ～60 mg 組織樣本中加入1 ml 0.9%氯化鈉注射液，振蕩混勻，12 000 r/min 離心2 min，小心去除上清，加入180 l Buffer DTL，將組織處理為勻漿。（3）加入20 l Proteinase K Solution，振蕩混勻，56 ℃消化至獲得較清透的組織溶解液。（4）取出樣品管，用掌式離心機(jī)離心5 ～10 s。（5）加入200 l BufferDTB和200 l無水乙醇，振蕩混勻后離心5 ～10s。（6）將全部液體轉(zhuǎn)移至DNA 吸附柱中，8 000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中的液體。（7）往DNA 吸附柱中加入600 l Buffer DW1，8 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的液體。（8）往DNA 吸附柱中加入600 l Buffer DW2，8 000 r/min 離心1 min，丟棄收集管。（9）換用新的收集管，12 000 r/min離心3 min，丟棄收集管。（10）將吸附柱小心轉(zhuǎn)移至干凈的1.5 ml 離心管中，往DNA 吸附膜中心滴加30 ～100 l Buffer DTE（勿碰到DNA 吸附膜），室溫靜置1 ～5 min，12 000 r/min 離心1 min，收集樣品DNA 并保存。

1.5.2 基因組DNA（gDNA） 分別使用QIAamp DNA MiniKit 和QIAamp DNA Blood Mini Kit（凱杰公司，Hilden，德國）從腫瘤和鄰近腫瘤肺和白細(xì)胞層提取。使用Qubit 熒光儀和dsDNA 高靈敏度檢測試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）測定DNA 濃度。使用Agilent2100生物分析儀（安捷倫科技，美國加州圣克拉拉）評估DNA 的分布。

2 結(jié)果

2.1 組織樣本病理形態(tài)學(xué)評估 93 例非小細(xì)胞肺癌樣本通過制作冷凍切片病理評估發(fā)現(xiàn)，有6 例與原診斷不符合，其中1 例診斷為肉芽腫性病變，1 例腸癌肺轉(zhuǎn)移，3 例癌組織內(nèi)無癌細(xì)胞，1 例癌旁組織中有癌細(xì)胞；在315 份腫瘤組織中，腫瘤部分所占比例≥30%的占77.8%（245/315）；在204 份癌旁組織中，發(fā)現(xiàn)1份陽性樣本，1 份可疑陽性；在329 份正常組織中，發(fā)現(xiàn)8 份陽性樣本?？倶颖镜牟±碓\斷合格率為93.55%（87/93），癌組織77.8%（245/315），癌旁組織99.02%（202/204），正常組織97.57%（321/329）。

2.2 RNA 的純度和完整性評估 在選取的172 份RNA 樣本中，RNA 純度OD260/280 為2.037±0.57，RNA 純度OD260/280≥1.8 占98.84%（170/172）；RNA 分子RIN 為7.47±1.69，RIN≥7 占82.56%（142/172）；RIN ＜4 占6.98%（12/172）。其中有1 份OD260/280 為9.4，RIN=1，RNA 已降解。

2.3 DNA 的濃度及質(zhì)量 在選取的165 份DNA 樣本中，DNA 最大濃度為200.69 ng/ l，最小濃度為11.60 ng/ l，平均131.29 ng/ l，中位值134.07 ng/ l，低于60 ng/ l 的樣本5 份。條帶降解度＞1 000 bp 有161 份，500 ～1 000 bp 有3份，小于500 bp 有1 份。

3 討論

高質(zhì)量及高標(biāo)準(zhǔn)的生物樣本庫是基礎(chǔ)和臨床研究的樣本來源，也是實現(xiàn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。樣本質(zhì)量是生物樣本庫的核心，對生物樣本庫的質(zhì)量評估往往圍繞DNA與RNA進(jìn)行[4-5]。然而，大約10%的冷凍樣本是不適合進(jìn)行分子分析的，主要原因是樣本的取材和保存[2]。因此，組織樣本進(jìn)行分子分析前進(jìn)行病理評價是十分必要的。

本研究對生物樣本庫的組織樣本質(zhì)量在組織形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上進(jìn)行評估，再進(jìn)行核苷酸純度和完整性的檢測。通過冷凍切片對冷凍樣本的病理形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，癌組織與正常組織的病理診斷結(jié)果產(chǎn)生偏移，而RNA 和DNA 質(zhì)量是良好的，這說明生物樣本庫中冷凍樣本在RNA 和DNA 層面的結(jié)果是可行的。目前分子病理存在的主要問題是由于樣本導(dǎo)致的錯誤率較高。在實驗環(huán)節(jié)，分析前和分析后錯誤發(fā)生的頻率更高，由于分析問題導(dǎo)致的錯誤隨著時間的推移已經(jīng)顯著減少，大部分錯誤是分析前造成的，占總錯誤的46%～68.2%[6]。在生物樣本庫分析前因素中，不僅關(guān)注患者的內(nèi)在因素、熱缺血時間和冷缺血時間等[7]，更要在標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)程（SOP）中進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量管理和質(zhì)量控制，包括組織學(xué)的證實[8]。生物樣本庫實際保存的樣本與病理報告中的組織存在一定的差異，這種差異足以影響研究的結(jié)果[9]。在病理評估中，確認(rèn)該組織是否是腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞含量等都是決定下游研究結(jié)果的前提[10]。

本研究中癌旁組織和正常組織中出現(xiàn)陽性樣本，腫瘤組織樣本中腫瘤細(xì)胞所占比例≥30%的占77.8%，造成這種差異的原因可能是樣本庫組織取材較小，同一樣本腫瘤的分化程度不同，取材位置不同，腫瘤成分比例也不同，所取樣本不足以概括腫瘤全貌。樣本庫冷凍小組織也增加了冷凍切片的難度，皺褶、切片不完整等都有可能造成閱片時腫瘤細(xì)胞計數(shù)的偏差。對照RNA 及DNA 的結(jié)果表現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞占比≥30%可以說明樣本的病理準(zhǔn)確性。對研究用的樣本組織進(jìn)行冷凍切片時，更要避免樣本污染，用熟練的冷凍切片技術(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鲬B(tài)度提高切片的質(zhì)量，通過對冷凍樣本的病理質(zhì)控，可進(jìn)一步提高下游實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。