循環(huán)腫瘤細(xì)胞在胰腺癌診治中的研究進(jìn)展

王鑫，黃靜，劉燁磊，陸才德

作者單位： 315000 寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（王鑫、劉燁磊）；寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院（黃靜、陸才德）

胰腺惡性腫瘤主要為胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC），而大多數(shù)PDAC 確診時(shí)已經(jīng)為晚期。PDAC 的侵襲性極強(qiáng)，且對靶向治療和細(xì)胞毒性治療的反應(yīng)較差?，F(xiàn)階段PDAC缺乏典型的早期臨床癥狀及較敏感的生物標(biāo)記物，且早期胰腺腫瘤的穿刺活檢較困難，早期難以發(fā)現(xiàn)[1]。盡管近期超聲內(nèi)鏡下活檢已取得一定的進(jìn)展，有利于PDAC的診斷，但穿刺活檢假陰性率較高[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）被認(rèn)為是多類實(shí)體腫瘤另外一種轉(zhuǎn)移方式，包括肝癌、胰腺癌等，即使在外科手術(shù)切除后外周血中仍能檢測到CTCs，利用CTCs 檢測早期胰腺腫瘤，具有安全性高、耐受低及敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，可用于胰腺疾病的早期檢測、預(yù)后、治療方案選擇和疾病預(yù)后監(jiān)測等方面。本文就CTCs在胰腺癌診治中的進(jìn)展作一綜述。

1 CTCs 概述

CTCs 最早在19 世紀(jì)的時(shí)候提出，腫瘤細(xì)胞可以被動(dòng)從實(shí)體腫瘤上脫落[3]，或者通過上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT）而發(fā)生主動(dòng)轉(zhuǎn)移。在外周血中只有極少量的CTCs，這對于檢測和分離CTCs造成了極大的困難，隨著腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究的深入和檢測技術(shù)的進(jìn)步，目前研究人員能夠使用液體組織活檢技術(shù)從一個(gè)簡單的血液樣本中尋找到CTCs。由于CTCs 源自于原發(fā)實(shí)體腫瘤[4]，因此CTCs 可以提供一個(gè)非侵入性的方法來診斷和評估胰腺癌的類型以及腫瘤現(xiàn)處于的階段，而對CTCs的重復(fù)收集和分析也可以用于檢測疾病的進(jìn)展以及患者對治療的實(shí)時(shí)反映。

2 CTCs 的分離

從血液成分中分離CTCs的技術(shù)，大多數(shù)可以被歸類為基于其生物屬性或其物理屬性（包括其細(xì)胞大小、密度），一旦CTCs被分離，它們能夠通過免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光、顯微鏡分析生物標(biāo)記等方式被確定，現(xiàn)階段主要分離的方法有細(xì)胞過濾技術(shù)（ISET）、密度梯度離心法（DGC）、熒光激活細(xì)胞分選（FACS）、免疫磁珠分選法（MACS）等方式[5]。

2.1 物理方式 CTCs較正常細(xì)胞相比具有更低的浮力密度及更大的體積[6]?；诿芏鹊姆蛛x方法常常基于Onco Quick 試劑盒，通常情況下血液樣本會(huì)被稀釋，并在介質(zhì)上分層，最后使用離心機(jī)進(jìn)行分離。除了密度梯度分離之外，OncoQuick合并了多孔膜，能減少與CTCs相似密度的血細(xì)胞的數(shù)量[7]。而ISET 則使用聚碳酸酯薄膜過濾器，用8 m 大小的圓柱孔來獲取血液樣本中的CTCs[8]。目前也有部分研究人員使用雙向電泳分離腫瘤細(xì)胞，利用腫瘤細(xì)胞的介電性能來分離出可行的CTCs，這種特性在不同細(xì)胞中類型不同，可用來分離腫瘤細(xì)胞以用于培養(yǎng)和分析。

2.2 生物性質(zhì)分離 大多數(shù)以免疫為基礎(chǔ)的CTCs 濃縮方法，都利用上皮細(xì)胞表面生物標(biāo)志物的表達(dá)來識(shí)別CTCs，其中最常使用的是上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）。在分離過程中，磁性微珠表面會(huì)被涂上EpCAM 抗體，之后通過一個(gè)特定磁場來吸引已經(jīng)結(jié)合CTCs 的磁性微珠，從而可以達(dá)到分離CTCs 的目的。MACS 可分為正性分離和負(fù)性分離，正性分離指從樣品血液中分離得到腫瘤細(xì)胞，負(fù)性分離指從血液樣本中去除其他無關(guān)血細(xì)胞而得到腫瘤細(xì)胞?，F(xiàn)階段微流體設(shè)備也用于CTCs 富集，其表面帶有EpCAM 抗體涂層用于結(jié)合CTCs，具有微型化、成本低及特異性高等特點(diǎn)?，F(xiàn)今將CTCs 吸引到導(dǎo)絲的概念已經(jīng)應(yīng)用于體內(nèi)，Saucedo-Zeni等[9]設(shè)計(jì)了一種EpCAM 功能化的醫(yī)用Seldinger 導(dǎo)絲，將其插入患者的靜脈血管中，以捕捉和富集CTCs，這設(shè)備將來可能用于直接從PDAC 患者體內(nèi)檢測CTCs。CellSearch 系統(tǒng)是唯一一種美國食品和藥物監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的CTCs 檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用以EpCAM為基礎(chǔ)的免疫磁珠富集法從而用于檢測CTCs，之后根據(jù)CD45 陰性，CK8、CK18 和CK19為陽性來分離獲得CTCs[10]。然而CTCs檢測目前仍未發(fā)現(xiàn)特異性靶點(diǎn)，各種方法檢出率也不盡相同，如上述EpCAM靶點(diǎn)，僅為上皮細(xì)胞標(biāo)志，而非胰腺癌腫瘤細(xì)胞特異性靶點(diǎn)。

3 CTCs 在胰腺癌治療中的應(yīng)用前景

3.1 檢測和診斷 CTCs可用于胰腺癌的早期檢測及診斷，He 等[11]分別檢測了CTCs、循環(huán)腫瘤DNA（CT-DNA）以及組織活檢中EGFR 突變的情況，得到了高達(dá)95%的一致率。當(dāng)前影像學(xué)作為腫瘤的常規(guī)檢測手段，臨床醫(yī)生很難發(fā)現(xiàn)較小的實(shí)體腫瘤，通過國內(nèi)外研究可以看到，很多腫瘤在2 ～4 mm 的情況下已經(jīng)有腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，甚至在遠(yuǎn)處形成新的病灶。其他癌前病變（如IPMN）或良性病變（如慢性胰腺炎）必須通過影像學(xué)和超聲內(nèi)鏡下活檢與癌癥相鑒別。在Rhim 等[12]的一項(xiàng)研究中，33%的IPMN 患者中發(fā)現(xiàn)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（CECs），但未發(fā)現(xiàn)CTCs，而在PDAC患者中，73%的病例中CTCs 呈現(xiàn)陽性。因此CTCs 能夠?yàn)橐认倌[瘤的定性提供一定的參考價(jià)值，從而避免穿刺活檢給患者帶來的傷害。

研究報(bào)告了從門靜脈與外周血分離的CTCs 的潛在差異。在一項(xiàng)對20 例胰腺癌患者的研究中，Bissolati 等[13]發(fā)現(xiàn)，在隨訪3 年的患者中，從門靜脈中可檢出的CTCs 的患者較CTCs 陰性患者具有更高的轉(zhuǎn)移率。在另一項(xiàng)類似的研究中，Catenacci 等[14]對18 例PDAC 患者進(jìn)行研究，在超聲內(nèi)鏡下獲取受試患者門靜脈血液樣本，CTCs 陽性率為100%，而在外周血循環(huán)中只有4 例患者發(fā)現(xiàn)CTCs，提示門靜脈血相較于外周血CTCs 檢測率明顯升高。國內(nèi)研究人員通過超聲內(nèi)鏡下穿刺PDAC患者門靜脈獲取血液標(biāo)本，提示CTCs 檢出率為100%[15]。在超聲內(nèi)鏡進(jìn)一步推廣后，通過門靜脈檢測CTCs 技術(shù)的安全性及實(shí)用性將大為提高。

3.2 預(yù)后和監(jiān)控 在對胰腺癌CTCs 研究的廣泛文獻(xiàn)檢索中發(fā)現(xiàn)，CTCs陽性患者普遍具有較差的無瘤生存期及總存活率。Han 等[16]評估了共623 例PDAC 患者，在268 例患者的血液樣本中檢測到CTCs（43%）；這些患者的無進(jìn)展生存期和整體存活率較CTCs檢測陰性的患者要短得多。

晚期PDAC患者的化療后評估常常通過影像學(xué)完成，然而研究發(fā)現(xiàn)通過化療后CTCs檢測可評估化療效果，從而指導(dǎo)臨床化療選擇。在實(shí)驗(yàn)研究中，Bidard等[17]評估了29 例晚期PDAC 患者的CTCs陽性率和存活率之間的相關(guān)性，這些患者行化療治療2 個(gè)月后行CTCs 檢測，提示CTCs陽性的患者多為低分化腫瘤，且總體存活時(shí)間較短。Okubo 等[18]評估了65 例胰腺癌患者，在21 例患者中血液樣本中找到CTCs，并且全部CTCs陽性患者皆為晚期胰腺癌，此項(xiàng)研究也表明當(dāng)進(jìn)行化療3 個(gè)月后，CTCs檢測仍為陽性的患者總生存率低于CTCs 轉(zhuǎn)陰患者。另一些研究對CTCs 的評估與患者的腫瘤發(fā)展聯(lián)系提供了更細(xì)致的見解。Gemenetzis 等[19]通過實(shí)驗(yàn)指出，當(dāng)影像學(xué)能夠提示腫瘤復(fù)發(fā)前的2 個(gè)月，研究人員就能發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)CTCs 出現(xiàn)明顯的增高；一項(xiàng)薈萃分析納入19項(xiàng)研究，1 320 例確診個(gè)體，經(jīng)過Meta 分析顯示CTCs 陽性患者的總生存期（P ＜0.001）和無進(jìn)展生存期明顯縮短（P=0.003），此外，按種族劃分的亞組分析表明，CTCs陽性患者在亞洲和西方人群中的總生存期都明顯縮短，并無人群差異[20]。

外周血中癌細(xì)胞不是均一的種群，而是由不同種類的細(xì)胞構(gòu)成，某些亞種群在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著主要作用。且現(xiàn)有文章表明發(fā)生EMT的CTCs處于“冬眠”，大部分無法增值形成轉(zhuǎn)移灶，遂需要尋求新的特異性標(biāo)志物以鑒別最終形成轉(zhuǎn)移灶的CTCs[21]。Sun 等[22]對46 例行手術(shù)切除的PDAC 患者進(jìn)行研究，將捕獲的CTCs 分化為上皮型（E-CTCs）、間葉型（M-CTCs）和雜交型（H-CTCs）三種表型，結(jié)果提示H-CTCs在PDAC轉(zhuǎn)移中具有良好的預(yù)測作用，而E-CTCs 在PDAC 患者OS 方面起到良好的預(yù)測作用，E-CTCs＜11.0CTCS/2ml患者中位OS為16.5 個(gè)月，E-CTCs＞11.0CTCS/2ml 患者中位OS 為5.5 個(gè)月（P=0.016）。對CTCs進(jìn)行分型能夠使CTCs在胰腺癌預(yù)后方面起到更好的預(yù)測作用。

3.3 單細(xì)胞測序 在檢測到實(shí)體腫瘤之前，已經(jīng)可從患者身上分離出CTCs，且腫瘤的發(fā)生與發(fā)展和細(xì)胞基因的突變密切相關(guān)[23]。因此，對CTCs 中致癌基因和抑癌基因的突變分析，以及對單細(xì)胞畸變?nèi)旧?，可以用來證實(shí)CTCs 的腫瘤來源從而達(dá)到診斷目的[24-25]。從胰腺癌的基因組分析中可以了解到，根據(jù)不同的分子亞型可對PDAC 進(jìn)行分類，從而能夠揭示出潛在的治療靶點(diǎn)[26]。WNT基因在PDAC細(xì)胞中的表達(dá)抑制了腫瘤凋亡，并增加腫瘤轉(zhuǎn)移傾向，Yu 等[27]對11 例PDCA 大鼠進(jìn)行CTCs 中RNA 測序，有5 例CTCs 顯示W(wǎng)NT 信號(hào)富集，因此對于CTCs 的單細(xì)胞測序能夠提供腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)?；驕y序的改進(jìn)使研究人員能夠?qū)TCs 樣本進(jìn)行基因組分析，明確與患者預(yù)后和治療反應(yīng)相關(guān)的基因改變，從而幫助指導(dǎo)患者治療方案的制定。Ting 等[28]比較了從胰腺癌小鼠身上分離出的CTCs 和相應(yīng)的原發(fā)性腫瘤的全基因組表達(dá)譜，其中單細(xì)胞DNA 測序顯示，與原發(fā)腫瘤細(xì)胞相比，CTCs 表達(dá)了大量基質(zhì)衍生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，發(fā)現(xiàn)它們增加了腫瘤細(xì)胞的侵入性和遷移性，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)階段全基因測序存在潛在的非法轉(zhuǎn)錄和放大偏誤，這將成為單細(xì)胞分析的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。

3.4 體外預(yù)測模擬 隨著更多的細(xì)胞毒性和生物治療藥物的出現(xiàn)，為了遠(yuǎn)離傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)療法，現(xiàn)階段需要開發(fā)能夠預(yù)測患者對藥物反應(yīng)的試驗(yàn)。CTCs 可以在體外培養(yǎng)，可以通過CTCs 對不同藥物的敏感性，從而選擇最佳的治療方案，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。且利用CTCs 比原發(fā)性實(shí)體腫瘤細(xì)胞更加有利，CTCs存在著負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移的起始和將腫瘤傳播其他部位的能力，而干預(yù)轉(zhuǎn)移是提高療效的關(guān)鍵?，F(xiàn)今體外CTCs 培養(yǎng)雖仍處在挑戰(zhàn)，大多數(shù)方案在樣本前處理、富級分選過程和培養(yǎng)條件不當(dāng)都會(huì)導(dǎo)致對CTCs 不可逆的損傷，且由于長期培養(yǎng)和多次傳代可能致使CTCs 在基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)方面不再代表原始腫瘤的表型。CTCs細(xì)胞株培養(yǎng)的效率現(xiàn)有所提高，提高效率的方法包括使用非附著的三維培養(yǎng)條件、基質(zhì)支撐層或低氧條件來增加CTCs 的生存。盡管存在挑戰(zhàn)，但這一領(lǐng)域的進(jìn)展可以改善患者的診斷和管理。現(xiàn)階段CTCs 能夠被長期體外培養(yǎng)，且肺癌或乳腺癌患者的CTCs 已經(jīng)被成功地在體外培養(yǎng)用于檢測治療藥物療效[29-30]，但對于胰腺癌患者CTCs 仍缺少足夠的實(shí)驗(yàn)來支持它的臨床應(yīng)用。

4 結(jié)論

胰腺癌在目前來說是一種高度侵襲性的疾病，在過去的許多年里，患者的預(yù)后改善不明顯。持續(xù)發(fā)展更為敏感、高通量和高效的CTCs 檢測方式，能夠加強(qiáng)CTCs 在臨床中的應(yīng)用。對CTCs 的深入研究可以增加對胰腺癌的形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的更深一步的認(rèn)識(shí)，并能夠使個(gè)性化醫(yī)療的體外藥物測試平臺(tái)得到進(jìn)一步的發(fā)展。對于高風(fēng)險(xiǎn)的疑似患者，可能在未來常規(guī)體檢時(shí)能夠接受CTCs 的篩選，從而增加對胰腺癌的早期檢測。雖然胰腺癌中找尋CTCs的研究為胰腺癌轉(zhuǎn)移、診斷和治療提供新的思路，但在當(dāng)前情況下仍有大量未探索的問題等待深入研究，比如如何高效的收集CTCs，進(jìn)一步的找尋CTCs 的細(xì)胞生物學(xué)特性和特異分子標(biāo)志物等。