胰腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)及臨床應(yīng)用前景

楊笑盈，秦 騁，趙邦博，李天浩，曹洪滔，王維斌

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京 100730

手術(shù)切除可能是目前治愈胰腺癌的唯一方式，但由于其起病隱匿、早期癥狀不典型，且缺乏早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物，多數(shù)患者就診時腫瘤已發(fā)生局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而失去最佳手術(shù)治療時機(jī)，患者預(yù)后較差，5年生存率不足9%[1- 3]。此外，胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移未能早期發(fā)現(xiàn)，亦是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因。因此，早期診斷并及時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶對指導(dǎo)胰腺癌臨床治療及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是一類通過循環(huán)系統(tǒng)從局部腫瘤擴(kuò)散至遠(yuǎn)處部位的腫瘤細(xì)胞，其保留了原發(fā)腫瘤的基本特征。目前認(rèn)為，胰腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵在于CTCs發(fā)生早期微轉(zhuǎn)移，因此早期對血液中的CTCs進(jìn)行檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本文對目前胰腺癌診斷方法的應(yīng)用現(xiàn)狀、CTCs富集方法及CTCs檢測在胰腺癌早期篩查、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與預(yù)后評估中的應(yīng)用前景進(jìn)行梳理和總結(jié)。

1 常規(guī)胰腺癌評估方法

目前，影像學(xué)、糖鏈抗原19- 9(carbohydrate antigen19- 9，CA19- 9)以及組織病理學(xué)仍是胰腺癌篩查、臨床分期、預(yù)后等的常規(guī)評估方法。

1.1 影像學(xué)

影像學(xué)檢查主要包括CT、MRI或PET/CT，其對體積較大病灶的檢出率較高，對于一些微轉(zhuǎn)移灶如粟粒樣微小轉(zhuǎn)移灶，術(shù)前增強(qiáng)CT甚至PET/CT均無法發(fā)現(xiàn)，部分患者由于在術(shù)中才發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶而被迫中止手術(shù)。研究顯示，對于微小肝轉(zhuǎn)移灶，CT和MRI檢查的靈敏度分別為69%和85%，約20%的患者通過影像學(xué)評估導(dǎo)致腫瘤分期被低估，影響治療方案的選擇[4- 5]。因此，僅通過影像學(xué)檢查對胰腺癌早期診斷及病情評估具有局限性。

1.2 CA19- 9

CA19- 9是目前胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)診斷的首選腫瘤標(biāo)志物，其血清水平與腫瘤分期相關(guān)，較高水平的CA19- 9常提示腫瘤處于中晚期。但CA19- 9表達(dá)受多種因素的影響，特異性較差，其在多種良性病變(如胰腺炎、急性膽管炎、肝硬化)和惡性腫瘤(如大腸癌、胃癌、膀胱癌、子宮鱗狀細(xì)胞癌)中亦可異常升高[6]。此外，Lewis抗原(巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)是CA19- 9的關(guān)鍵合成酶，約15%的人群該基因型表達(dá)異常，無法正常分泌CA19- 9，因此血清CA19- 9水平極低，導(dǎo)致臨床假陰性[7]。最近有研究認(rèn)為，CA19- 9與其他多種血清標(biāo)志物(如蛋白質(zhì)代謝物)聯(lián)合檢測可能有助于PDAC的早期診斷與疾病分期[8]。Bernard等[9]研究表明，CA19- 9結(jié)合循環(huán)腫瘤DNA以及患者性別、腫瘤轉(zhuǎn)移部位等進(jìn)行多因素分析可預(yù)測胰腺癌患者的總生存期(overall survival，OS)。但由于相關(guān)研究較少，確切研究結(jié)果尚需進(jìn)一步驗證。

1.3 組織病理

內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺術(shù)(endoscopic ultrasonography guided fine-needle aspiration，EUS-FNA)是獲取活檢標(biāo)本的首選檢查，其陽性率約為80%～95%。內(nèi)鏡超聲可發(fā)現(xiàn)毫米級微小病變，當(dāng)影像學(xué)難以區(qū)分胰腺腫塊性質(zhì)時，EUS-FNA有助于胰腺占位病變的良惡性鑒別。但臨床操作過程中，存在穿刺吸取標(biāo)本量過少、涂片質(zhì)量差等現(xiàn)象，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。有研究認(rèn)為對EUS-FNA獲取的胰腺病理樣本進(jìn)行原癌基因(如K-ras)突變檢測和抑癌基因(如p16、DPC4)缺失檢測可提高其診斷的準(zhǔn)確性。但EUS-FNA活體組織檢查為有創(chuàng)檢查，難以作為早期篩查的手段。因此，探究新的胰腺癌評估方法具有重要臨床意義。

2 CTCs檢測技術(shù)

目前研究認(rèn)為CTCs是介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素[10- 12]，檢測血液中CTCs含量可能對胰腺癌的臨床分期、療效監(jiān)測及預(yù)后評估均有幫助。目前CTCs的檢測主要包括富集、分離、計數(shù)等步驟，而外周血中CTCs相較于血細(xì)胞含量極少，約為1/109～1/106，因此富集外周血中的CTCs是檢測的重要環(huán)節(jié)[13]。近年來液體活檢技術(shù)逐漸引起臨床關(guān)注，外周血中CTCs的分離、富集技術(shù)亦得以快速發(fā)展。目前CTCs檢測技術(shù)可通過CTCs的物理特性或生物學(xué)特性與血液中其他細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，并將其富集、分離，但尚不能確定CTCs的最優(yōu)檢測方法。

2.1 基于物理特性

CTCs的物理性質(zhì)主要包括其大小、可變形性、密度和電荷。研究表明，CTCs通常比其他血細(xì)胞體積更大且密度更低[14]。因此，可基于此將血液樣本稀釋并鋪在培養(yǎng)基上，經(jīng)離心、密度梯度法分離CTCs或利用CTCs體積較大的特性將其從血液中過濾出來。如ISET系統(tǒng)(Rarecells，Paris，F(xiàn)rance)使用具有8 mm圓柱形孔的聚碳酸酯膜過濾器從血液樣本中富集CTCs[15]。

2.2 基于生物學(xué)特性

CTCs的生物學(xué)特性主要包括表面標(biāo)志物及免疫親和力，可利用不同抗體對血液中細(xì)胞表面抗原的吸附作用不同進(jìn)行篩選，即使用與CTCs細(xì)胞膜表面特定抗原結(jié)合的抗體標(biāo)記、包被磁性微珠，并施加磁場以將被標(biāo)記的CTCs吸附至微珠上，以達(dá)到分離、富集CTCs的目的。此種基于表面抗原的富集方法分為“正選擇”和“負(fù)選擇”。正選擇直接通過CTCs的表面標(biāo)志物，如上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)陽性選擇相應(yīng)的抗體從而將其富集，負(fù)選擇則通過相應(yīng)的抗體標(biāo)志物(主要為CD45)并耗盡血液中其他細(xì)胞(主要為白細(xì)胞)，從而篩選出CTCs[16]。目前使用較廣泛的選擇系統(tǒng)是CellSearch系統(tǒng)(Janssen Diagnostics Raritan，NJ)，該系統(tǒng)亦是目前美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的唯一可用于檢測分離CTCs的平臺。CellSearch系統(tǒng)基于EpCAM抗體免疫磁性微珠捕獲CTCs，并通過細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)8、18和19陽性，及血液特異性細(xì)胞表面標(biāo)記CD45陰性，含有核成分DAPI陽性富集并鑒定分離CTCs[17]。

此方法存在一定的局限性，因不同患者之間CTCs表面蛋白差異性較大，即使同一患者的不同樣本，EpCAM或CTCs上其他表面蛋白的表達(dá)仍存在異質(zhì)性。Went等[18]報道，盡管78%的PDAC患者的CTCs表面蛋白上EpCAM為陽性，但CTCs可通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化降低其EpCAM的表達(dá)水平。

Khoja等[19]入選54例胰腺癌患者比較了CellSearch系統(tǒng)與ISET系統(tǒng)對CTCs富集、檢測效率，結(jié)果顯示ISET系統(tǒng)檢出CTCs的患者數(shù)比CellSearch系統(tǒng)多，且對分離出的CTCs進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，同樣血液量中，ISET系統(tǒng)檢出的CTCs數(shù)量明顯更多。CTCs表面標(biāo)志蛋白存在異質(zhì)性可能是導(dǎo)致CellSearch系統(tǒng)檢出率低的原因之一。ISET系統(tǒng)能檢測出聚集成團(tuán)的CTCs，但對于體積較小的CTCs(如小神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞)則存在漏檢的可能[20]。因此，目前尚無檢測CTCs的標(biāo)準(zhǔn)方法，由于不同參考文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)不同，難以比較不同系統(tǒng)的優(yōu)劣。

3 CTCs在胰腺癌評估中的應(yīng)用

2007年，Nagrath等[21]使用CellSearch系統(tǒng)富集、檢測15例PDAC患者的CTCs，結(jié)果顯示所有患者均可檢測到CTCs(跨度范圍9～831 CTCs/mL，中位數(shù)120 CTCs/mL)。Iwanicki-Caron等[22]對疑診為PDAC的患者采用ScreenCell系統(tǒng)檢測CTCs，并通過EUS-FNA收集可疑胰腺腫瘤細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)85%的患者經(jīng)EUS-FNA確診為PDAC，其中70%可檢測出CTCs，認(rèn)為可考慮通過檢測CTCs來診斷PDAC。Zhang等[23]使用hTERT啟動子調(diào)節(jié)的溶瘤性單純皰疹病毒- 1靶向端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶陽性的腫瘤細(xì)胞，檢測不同臨床階段的胰腺癌患者CTCs表達(dá)情況，結(jié)果顯示88.2%(15/17)的患者檢出CTCs。Chang等[24]開發(fā)了一種平行微流控芯片，該芯片與免疫磁性吸附和基于物理特性過濾等不同策略相結(jié)合對胰腺癌患者的CTCs分離效果良好，胰腺癌患者的CTCs檢出率為91.7%(11/12)，非小細(xì)胞肺癌患者的CTCs檢出率為100%(38/38)。

上述研究表明，基于目前的檢測技術(shù)對PDAC患者進(jìn)行CTCs定性檢測或定量分析具有可行性，但不同檢測技術(shù)的結(jié)果仍存在較大差異。

3.1 篩查

Rhim等[25]采用黃色熒光蛋白譜系標(biāo)記物標(biāo)記了KPC小鼠的所有胰腺細(xì)胞，檢測了胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)階段小鼠血液中循環(huán)胰腺細(xì)胞(circulating pancreatic cells，CPCs)，發(fā)現(xiàn)CPCs表達(dá)的胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD24水平升高。此外，該研究發(fā)現(xiàn)CPCs可滲入骨髓、腎臟等組織，并表達(dá)Fsp1和Zeb1等間充質(zhì)表面標(biāo)志物，可作為胰腺癌患者死亡的獨立預(yù)測因子。提示處于癌前病變時，胰腺腫瘤細(xì)胞即可離開原器官發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，CPCs可能是早期胰腺癌的標(biāo)志物。在隨后的研究中，Rhim等[26]在3個不同的受試者組(所有階段的PDAC患者、腫瘤前囊性病變以及無癌對照人群)中捕獲CTCs，結(jié)果顯示PDAC患者和對照人群的CTCs檢出率分別為73%(8/11)和0(0/19)，且40%(8/21)的腫瘤前囊性病變患者血液中可檢測到CTCs，提示CTCs可用于胰腺癌的篩查。但Cauley等[27]通過ScreenCell系統(tǒng)對188例受試者進(jìn)行CTCs檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康受試者未檢出CTCs，胰腺癌、癌前病變及胰腺良性病變中，均有一定比例的患者可檢出CTCs，且3組間CTCs檢出率無顯著性差異。因此，CTCs在胰腺癌早期診斷與篩查中的確切作用需進(jìn)一步研究證實。

3.2 分期

CTCs水平對胰腺癌早期出現(xiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有重要提示意義。Kamande等[28]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性PDAC患者的CTCs水平顯著高于局部可切除PDAC患者，但該研究納入的受試者僅12例(包括7例轉(zhuǎn)移性PDAC患者及5例局部可切除PDAC患者)。Court等[29]對126例胰腺癌患者術(shù)前進(jìn)行CTCs檢測，得到了相似結(jié)果，即合并隱匿轉(zhuǎn)移性胰腺癌的患者與局灶性胰腺癌患者相比可檢出更多的CTCs，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。但亦有少數(shù)研究結(jié)果顯示CTCs水平與胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)[30]。

胰腺癌患者預(yù)后較差主要歸因于腫瘤較早出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但尚無在無癥狀人群中甄別出早期胰腺癌的有效方法[31]。目前研究認(rèn)為在胰腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的早期，即可在血液中檢出CTCs，為胰腺癌早期診斷及轉(zhuǎn)移篩查提供了可能性。但相關(guān)研究較少，且部分假陰性及假陽性結(jié)果的原因尚不清楚，確切結(jié)論及其應(yīng)用價值需深入研究。

3.3 預(yù)后

通過不同平臺檢測CTCs的研究均表明，CTCs可能是PDAC患者預(yù)后的獨立影響因素。Soeth等[32]通過巢式CK20實時PCR在52例PDAC患者(52/154，33.8%)中分離出了CTCs，并發(fā)現(xiàn)這些患者的OS比未分離出CTCs的患者顯著縮短。Kurihara等[33]使用CellSearch系統(tǒng)對26例胰腺癌患者進(jìn)行CTCs檢測，結(jié)果顯示11例檢出CTCs，且此類患者的OS顯著縮短。de Albuquerque等[34]在34例患者的研究中亦得到了一致的結(jié)果。Bidard等[35]進(jìn)行了一項多中心隨機(jī)對照臨床試驗，該研究納入79例局部晚期非轉(zhuǎn)移性PDAC患者，分別接受吉西他濱單藥治療或吉西他濱+厄洛替尼治療，通過CellSearch系統(tǒng)在2個不同的時間點(基線和治療2個月時)進(jìn)行CTCs檢測。結(jié)果表明，CTCs的總體陽性率為11%；多因素分析顯示任意時間點CTCs陽性是局部晚期胰腺腺癌OS縮短的危險因素，但其對患者的無進(jìn)展生存期(progression-free-survival，PFS)無顯著影響。Gao等[36]通過非EpCAM依賴性方法富集、檢測胰腺癌患者CTCs，發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)目升高(≥3 CTCs/7.5 mL)患者的OS較CTCs數(shù)目較低患者(<3 CTCs/7.5 mL)明顯縮短(10.2個月 比 15.2個月)，且多因素分析顯示CTCs數(shù)目升高是胰腺癌患者OS較短的危險因素(HR=4.547，P=0.016)。Poruk等[37]基于物理特性富集并分離出CTCs后，對panCK和波形蛋白分別進(jìn)行免疫熒光染色，比較了上皮型CTCs(CK陽性)和間質(zhì)型CTCs(波形蛋白陽性)患者的預(yù)后情況，發(fā)現(xiàn)上皮型CTCs與較短的OS密切相關(guān)(P<0.01)，但間質(zhì)型CTCs與OS無相關(guān)性(P=0.39)。大量研究證實，CTCs陽性不僅提示胰腺癌患者OS縮短，且是PFS縮短的危險因素[38- 40]。

有部分研究認(rèn)為，從門靜脈分離出的CTCs與全身循環(huán)系統(tǒng)分離出的CTCs可能存在潛在差異。Catenacci等[41]在18例胰腺癌或膽管癌患者中均可檢出門靜脈CTCs，而其中僅有22%的患者外周血可檢出CTCs。Bissolati等[42]在對20例胰腺癌患者的研究中，9例(45%)患者可檢出CTCs，其中5例僅在門靜脈中檢出CTCs、3例同時在門靜脈和外周血中檢出，1例僅在外周血中檢出；隨訪3年可知，相比門靜脈CTCs陰性的患者，CTCs陽性者具有更高的肝轉(zhuǎn)移率。Tien等[43]收集了41例PDAC患者術(shù)中門靜脈和外周血樣本，僅發(fā)現(xiàn)門靜脈CTCs數(shù)量升高是PDAC患者術(shù)后6個月肝轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測指標(biāo)(P=0.002)。上述結(jié)果表明，門靜脈血液中的CTCs比外周血中的CTCs更易被檢出，且與PDAC潛在轉(zhuǎn)移的關(guān)系更密切。但上述研究樣本量較小，且檢測方法不完全一致，從門靜脈分離出的CTCs是否更有助于臨床對胰腺癌患者進(jìn)行預(yù)后判斷仍需進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

胰腺癌作為一種惡性程度高、預(yù)后差的腫瘤，在過去數(shù)十年的探索中患者預(yù)后并未獲得明顯的改善。由于存在特殊的解剖學(xué)位置及腫瘤細(xì)胞成分相對較低等特點，胰腺癌組織活檢較為困難，而CA19- 9等分子生物學(xué)標(biāo)志物及MRI、CT、PET/CT等影像學(xué)技術(shù)在胰腺癌的早期診斷和轉(zhuǎn)移篩查中均存在一定局限性。CTCs作為保留原發(fā)腫瘤特性的一類腫瘤細(xì)胞，其在胰腺癌早期即可在血液中檢測到，且獲取方便、可多次收集，為胰腺癌的早期診斷、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移篩查提供了新思路，且在實時監(jiān)測腫瘤進(jìn)展、對治療的反應(yīng)以及預(yù)后評估中具有較好的應(yīng)用前景[44]。但目前尚缺乏CTCs富集、分離的標(biāo)準(zhǔn)平臺和方法，且其在胰腺癌患者中的應(yīng)用多為小樣本量研究，需進(jìn)行更多、更大規(guī)模的前瞻性臨床試驗進(jìn)一步驗證，以發(fā)掘其潛在價值。

作者貢獻(xiàn)：楊笑盈、秦騁撰寫論文初稿；王維斌負(fù)責(zé)論文設(shè)計；趙邦博負(fù)責(zé)論文修改；李天浩、曹洪滔負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱工作；所有作者均參與本文修訂。

利益沖突：無