腦源性外泌體助力精準診斷阿爾茨海默病

韓 瓔 李陶然

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，作為一種持續(xù)進展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，是造成癡呆的最主要元兇，也是目前唯一造成人類主要死因卻又缺乏修飾治療方法的疾病[1]。在中國，60歲以上的老年人約有5.3%的癡呆患者，在2020年所造成的年度經(jīng)濟損失預計超過248億美元，給國家、社會、家庭均造成了巨大的負擔[2]。早期、精準的診斷AD是進行積極有效的二級預防和藥物研發(fā)的關鍵。自1984年7月美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關疾病學會發(fā)布了首個國際公認的AD診斷標準，近40年來研究人員對其進行多次更新，從僅有的癡呆癥狀到把AD看作一個包含了臨床前期和輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)在內(nèi)的連續(xù)的“疾病譜”，從質樸的、典型的臨床表現(xiàn)到各種不典型的AD亞型，從臨床疑診、尸檢確診到可以在活體內(nèi)檢測生物學標志物進行確診，這些演變是醫(yī)學不斷進步的縮影，也體現(xiàn)了人們對AD認識的不斷深入[3, 4]。如何在患者生前確診AD是困擾研究人員的一大難題，在探索研究中不斷有新的生物學標志物被發(fā)現(xiàn)，其中腦源性外泌體是非常具有應用前景的一類標志物，本文就其在AD診斷中的研究進展進行綜述。

一、為什么迫切需要開發(fā)新的生物學標志物

迄今為止，僅有5種藥物通過了美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準并上市，上市成功率不到3%，且這些藥物僅能改善癥狀、延緩癡呆進程，并不能對因治療[1]。2019年，國家藥品監(jiān)督管理局有條件批準了甘露特鈉(GV-971)的上市，在業(yè)內(nèi)引起廣泛關注，其遠期效果仍有待研究。針對癥狀性AD患者的一系列大型臨床試驗的失敗，已經(jīng)使研究者認識到未來更應該關注AD的臨床前期，將治療前移，才能夠使正確的藥物在正確的時期發(fā)揮應有的作用[5, 6]。此外，進一步的事后分析表明，部分Ⅲ期臨床試驗中有高達20%的參與者并沒有AD的病理表現(xiàn)，這也是造成試驗失敗的原因之一[5]。

根據(jù)2018年美國國立老化研究院和阿爾茨海默病協(xié)會(NIA-AA)最新的AD診斷框架，β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的生物學標志物陽性是確定患者進入AD連續(xù)病程的必要條件，而臨床前期指的是那些出現(xiàn)了AD特征性的病理表現(xiàn)、但尚未出現(xiàn)客觀認知功能損害的患者，這類患者通常沒有任何臨床表現(xiàn)或僅有主觀的認知下降，在實際臨床工作中很少被關注或極易被誤診成其他疾病狀態(tài)[4]。目前國際上公認的Aβ檢測方法包括腦脊液Aβ含量檢測以及Aβ正電子發(fā)射掃描成像(positron emission tomography，PET)，但由于其有創(chuàng)性、輻射性、昂貴性，以及分析技術、閾值等尚未統(tǒng)一，所以很難進行大范圍的推廣[7]。上述兩種檢測手段應用于臨床上疑似AD癥狀性患者尚處于起步階段，難以在沒有任何客觀癥狀的人群中開展檢查。因此，目前亟需一種新的生物學標志物，可以反映AD內(nèi)在病理學改變，并能夠幫助醫(yī)務人員便捷地在臨床前期確診AD。

二、腦源性外泌體的生物學特點

外泌體是一種重要的細胞外囊泡，在細胞間的交流中發(fā)揮了重要作用，與此同時，外泌體也帶動了AD相關病理性蛋白的聚集、沉淀和播散，在Aβ和tau蛋白的傳播過程中發(fā)揮了“朊蛋白樣”播散機制的作用，促進了AD的發(fā)生和發(fā)展[7]。

外泌體的以下特性決定了它能夠成為優(yōu)秀的生物學標志物：①包括血液在內(nèi)的絕大多數(shù)體液中均能提取出外泌體；②包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞在內(nèi)的多種細胞類型均能夠釋放外泌體；③外泌體能夠借助自身的雙層脂質結構通過血-腦脊液屏障；④外泌體的內(nèi)含物十分豐富，包括各種蛋白質和非編碼RNA等物質；⑤其自身膜性結構能夠保護內(nèi)含物不被酶解，且內(nèi)含物的含量可以根據(jù)外界不同的刺激而發(fā)生特異性的改變?；谘褐苯舆M行標志物的檢測，由于取材便利而適合大范圍推廣。然而，由于血液中的外泌體來源廣泛，不加篩選提取出的“總外泌體”可能并不能成為良好的AD生物學標志物。腦源性外泌體，包括神經(jīng)元來源的外泌體(neuron-derived exosomes，NDEs)、神經(jīng)膠質細胞來源的外泌體(astrocyte-derived exosomes，ADEs)等，科學家通過外周血液，利用免疫沉淀技術可以直接提取出這類物質，通過檢測其內(nèi)含物的含量變化而間接得到神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞等的活動情況，進而反映出大腦內(nèi)在的病理學改變[7]。因此，血液中提取的腦源性外泌體有潛力能夠成為AD新的生物學標志物。

三、腦源性外泌體中的Aβ和tau在AD診斷中的研究進展

數(shù)十年來，AD發(fā)病機制中的“Aβ瀑布假說”仍然是最為經(jīng)典的理論之一，正是因為Aβ的代謝紊亂，才會出現(xiàn)后續(xù)的由磷酸化tau蛋白異常聚集而產(chǎn)生的神經(jīng)元纖維纏結，繼而導致神經(jīng)元損傷，在損傷達到一定程度之后就會影響到患者外在的認知功能[1, 4]。根據(jù)NIA-AA最新的“A-T-(N)”診斷框架，生物學標志物對應的分為“A”、“T”和“(N)”3種類型，分別反映患者體內(nèi)Aβ、磷酸化tau蛋白和神經(jīng)元損傷這3種病理狀態(tài)，而患者只要“A”和“T”陽性就可以確診AD[4]。正是因為Aβ和tau蛋白在AD診斷中不可撼動的地位，以及大量的基礎研究證實外泌體在二者的播散中起到了重要作用，腦源性外泌體中的Aβ和tau也是目前研究最廣泛、最重要的物質[7]。

2015年，F(xiàn)iandaca等[8]進行了一項開拓性的病例對照研究，他們發(fā)現(xiàn)血液提取的NDEs中的P-T181-tau，P-S396-tau和Aβ42的表達量在癥狀性AD患者中要遠高于正常對照組，更令人驚訝的是，研究人員獲得了24例受試者在出現(xiàn)認知損害前的，即認知完整時的血液標本，他們發(fā)現(xiàn)這3種物質在長達10年的臨床前期就已經(jīng)出現(xiàn)了表達量的升高，此外，NDEs中P-S396-tau能夠良好地區(qū)分AD患者和額顳葉癡呆的患者，一定程度上提示了其特異性。上述在癥狀性AD患者中得出的結論在另外兩篇文獻中得到了證實[9, 10]。除此之外，Goetzl等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ADEs中Aβ42的表達量在癥狀性AD患者中出現(xiàn)了下降，但由于和對照組之間存在巨大的重疊而嚴重限制了其臨床應用，他們進一步研究了和Aβ代謝相關的酶或底物，如可溶性α或β淀粉樣前體蛋白、β-位點淀粉樣前體蛋白裂解酶1等，也在NDEs或ADEs中出現(xiàn)了表達量的改變。Winston等[9]重點關注了MCI患者，他們根據(jù)患者在36個月內(nèi)是否轉化成癡呆定義MCI是否穩(wěn)定，發(fā)現(xiàn)NDEs中P-S396-tau和Aβ42的表達量在“不穩(wěn)定型MCI”患者和AD源性癡呆患者中均出現(xiàn)升高，且二者之間的表達量無差異，但在“穩(wěn)定型MCI”患者中并未出現(xiàn)改變，相比之下，P-T181-tau則不能預測MCI患者在未來是否出現(xiàn)認知惡化。唐氏綜合征患者擁有和AD患者極其類似的病理改變，在這些患者中同樣證實NDEs中的P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ42的表達量相比對照組明顯升高[11]。

為了進一步證實NDEs中的Aβ和tau蛋白是否在AD的臨床前期就已經(jīng)發(fā)生了變化，2019年，Kapogiannis等[12]進行了一項重要的縱向研究，納入了迄今為止最多的樣本。研究人員對350例受試者進行長期追蹤，在平均3.5年的隨訪期，他們發(fā)現(xiàn)128例受試者出現(xiàn)了AD相關的認知下降，222例受試者始終保持認知穩(wěn)定，在這些受試者認知功能出現(xiàn)惡化前或隨訪的截止日期前總共獲得了887份血液樣本。研究人員發(fā)現(xiàn)，相比于認知穩(wěn)定的正常人，那些“轉化者”在臨床前期就已經(jīng)出現(xiàn)了NDEs中P-T181-tau和P-T231-tau的水平升高，然而奇怪的是，Aβ42的表達量并沒有明顯的變化，這與既往結論不一致[8, 9]。這一結果使NDEs中的Aβ42是否能作為AD臨床前期的生物學標志物變得撲簌迷離，理論上，Kapogiannis等[12]所使用的單分子免疫陣列(single molecule array，SIMOA)技術檢測Aβ42要比既往的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技術更加敏感，因此陰性結果也是研究者始料未及的，他們并未做出更多的解釋。此外，該研究并未檢測P-S396-tau，其在臨床前期是否已經(jīng)出現(xiàn)改變?nèi)杂写嗟脑囼炄プC實。

除上述研究之外，還有一些針對tau蛋白的研究得出了陰性的結果，但仔細比較之后可以發(fā)現(xiàn)這些研究的受試者入組標準并不夠嚴謹[13, 14]。Winston等[13]在MCI患者中發(fā)現(xiàn)NDEs中P-S396-tau的表達相對正常對照并沒有改變，然而這些MCI患者均是依靠單純的臨床信息進行的診斷，并且沒有進行隨訪，不知道他們未來的轉歸，因此可能存在巨大的異質性，不一定是AD源性的MCI。Guix等[14]研究發(fā)現(xiàn)，full-length tau、mid-region tau和P-T181-tau的表達量在癥狀性AD患者中，相對正常對照組并沒有改變，但是作者也清楚地認識到自己存在樣本量不足和單純臨床診斷的缺點。此外，在一項最新的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)AD源性癡呆和正常對照組之間以123和224氨基酸結尾的tau蛋白片段表達量不存在差異，這也提示NDEs中差異的tau蛋白可能是以特定形式存在的[15]。

在腦源性外泌體中的Aβ和tau蛋白真正應用于臨床診斷之前，必須有研究去把它們和現(xiàn)有的、公認的AD生物學標志物去比對，以明確是否存在嚴格的匹配關系。來自首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院的賈建平教授團隊在2019年發(fā)表了一項重要的多中心臨床研究，在包含82例受試者的“探索組”和216例受試者的“驗證組”中，均發(fā)現(xiàn)NDEs中P-T181-tau、T-tau和Aβ42的表達量在癡呆、MCI和正常對照組之間存在階梯狀改變，即癡呆組的表達量大于MCI組，而MCI組大于對照組。此外，重要的是，3種物質在NDEs中的表達量和他們在腦脊液中的表達量存在嚴格的匹配關系，也就是說作者推論從血液提取的NDEs完全可以替代腦脊液診斷AD[16]。該研究是目前唯一把腦源性外泌體和“金標準”進行比對的研究，對未來AD指南的更新存在重要意義。

從上述多項研究中筆者可以明確得出結論，血液中提取的腦源性外泌體中的Aβ和tau蛋白的表達量在AD癥狀期、甚至是臨床前期出現(xiàn)了特異性變化，有望成為一種新的診斷性AD生物學標志物。

四、腦源性外泌體中其他生物學標志物

AD臨床癥狀要滯后于其病理改變，而現(xiàn)有證據(jù)還是支持“Aβ瀑布假說”，因此，筆者推測下文所述的生物學標志物均屬于Aβ的下游事件，是反映神經(jīng)元損傷的標志物，對應于“A-T-(N)”診斷體系中的“(N)”類別[3]。理論上來講，這一類基于外泌體的標志物是非特異的，反映AD或其他病理狀態(tài)的最終結局。然而，現(xiàn)有的證據(jù)表明它們能夠良好地區(qū)分AD和額顳葉癡呆，甚至在AD臨床前期就已經(jīng)發(fā)生了變化。但是爭議仍然存在，比如，它們是否能夠區(qū)分除額顳葉癡呆之外的其他變性病或者外傷？改變的程度是否和疾病的嚴重性有關？這些都值得進一步研究。

一直以來，研究者認為突觸損傷可以直接導致認知功能下降，大量研究工作都圍繞著突觸開展，試圖尋找一種反映突觸損傷的標志物來間接診斷AD[17]。生長相關蛋白43、synaptophysin、synaptotagmin、synapsin 1及其絲氨酸9磷酸化的變體，它們作為突觸前膜蛋白在調節(jié)囊泡融合、釋放或再循環(huán)中都起到了重要作用，而synaptopodin和neurogranin作為兩個重要的突觸后膜蛋白則在監(jiān)測細胞內(nèi)鈣濃度中發(fā)揮作用。此外，神經(jīng)元穿透素2(pentraxin 2)、含有gluA4的谷氨酸(gluA4-containing glutamate)、neurexins 2α和neuroligin 1對維持突觸功能至關重要[7]。已經(jīng)有研究證實NDEs中的上述11種反映突觸狀態(tài)的標志物，在AD源性認知損害的受試者中的表達量比正常人明顯下降[18, 19]。此外，synaptophysin、neurexins 2α等物質在受試者出現(xiàn)認知損害前1～10年，即認知正常時就已經(jīng)出現(xiàn)了改變；而且neurogranin表達量的下降也預示著MCI受試者在未來36個月之內(nèi)會進展成癡呆[9]。在相關性分析中，研究者還發(fā)現(xiàn)NDEs中的synaptophysin、synaptotagmin、synaptopodin，含有gluA4的谷氨酸和neuroligin 1，而不是Aβ42或P-T181-tau，與認知功能呈明顯的負相關，因此提示真正導致認知下降的是這些包括突觸損害在內(nèi)的下游事件。

胰島素的信號通路成分，如生長因子-1受體和胰島素受體，控制著諸如葡萄糖攝取和能量代謝等重要腦功能。許多研究者致力于研究它們在AD中的信號轉導抵抗，發(fā)現(xiàn)這似乎是一種早期和普遍的特征。胰島素受體底物-1(IRS-1)是胰島素受體的效應分子，它的幾個酪氨酸殘基的磷酸化將激活胰島素信號功能，而絡氨酸殘基的去磷酸化和(或)某些絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化將導致信號的抑制。這些特異性的IRS-1磷酸化形式可作為腦胰島素抵抗的生物學標志物，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在AD患者的腦組織中發(fā)生了變化[7]。相應地，有研究探索他們在NDEs中的改變，研究人員檢測了NDEs中的IRS-1、磷酸化-絲氨酸312-IRS-1(P-S312-IRS-1)和磷酸化-pan-酪氨酸-IRS-1(P-panY-IRS-1)，并定義R(P-S312-IRS-1/P-panY-IRS-1)為腦胰島素抵抗指數(shù)，發(fā)現(xiàn)癥狀性AD患者中的P-panY-IRS-1表達量明顯下降，而P-S312-IRS-1和R則明顯升高，而且R能夠良好地區(qū)分糖尿病患者、AD患者、額顳葉癡呆患者和正常對照組。與突觸標志物類似，這3個指標也是在受試者出現(xiàn)認知損害前1～10年就已經(jīng)出現(xiàn)了改變[20]。在該作者的后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，P-S312-IRS-1和P-panY-IRS-1與大腦的皮質萎縮明顯相關，提示二者分別在AD的病理學改變中起到了損害和保護性的作用[21]。

除上述研究之外，也有研究者去探索腦源性外泌體中泛素蛋白酶系統(tǒng)或自噬溶酶系統(tǒng)的生物學標志物、神經(jīng)炎癥和補體系統(tǒng)的標志物、一些神經(jīng)營養(yǎng)因子以及阻遏元件1-沉默轉錄因子(REST)、低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)或熱休克蛋白等調控Aβ表達的因子，均得出良好的結論[10, 22～25]。這也提示AD是一個異常復雜的病理學狀態(tài)，其下游事件和旁支末節(jié)的調控因子非常豐富，有更多未知的標志物值得去探索。

綜上所述，基于外周血提取的腦源性外泌體有望成為一種新型AD診斷性、甚至是預測性的生物學標志物。目前，包括我國在內(nèi)的許多國家，普通神經(jīng)科門診或記憶門診通常會收到涵蓋各種疾病的廣泛轉診，醫(yī)療資源得不到合理的配置。此外，現(xiàn)有的基于腦脊液或影像學的診斷標志物也都集中在這樣的專業(yè)門診，但是此時的患者病情發(fā)展往往錯過了最好的治療機會。而基于外周血就可以獲得的腦源性外泌體可以將AD的診斷提前10年，再加上基層大夫就可以獲得的人口學信息，可以進一步提高預測AD的準確性，這對合理轉診、優(yōu)化醫(yī)療保健的利用率和成本會產(chǎn)生重大和深遠的影響[12]?？紤]到腦源性外泌體的研究尚處于起步階段，且也存在一些矛盾和爭議，未來在多中心納入更多的受試者、在不同的實驗室完善實驗、進行多病種的鑒別以及和AD的“金標準”進行匹配，是使腦源性外泌體得到公認和大范圍推廣所必須要做的事情。