腦源性外泌體助力精準(zhǔn)診斷阿爾茨海默病

韓 瓔 李陶然

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，作為一種持續(xù)進(jìn)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，是造成癡呆的最主要元兇，也是目前唯一造成人類(lèi)主要死因卻又缺乏修飾治療方法的疾病[1]。在中國(guó)，60歲以上的老年人約有5.3%的癡呆患者，在2020年所造成的年度經(jīng)濟(jì)損失預(yù)計(jì)超過(guò)248億美元，給國(guó)家、社會(huì)、家庭均造成了巨大的負(fù)擔(dān)[2]。早期、精準(zhǔn)的診斷AD是進(jìn)行積極有效的二級(jí)預(yù)防和藥物研發(fā)的關(guān)鍵。自1984年7月美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病、語(yǔ)言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)發(fā)布了首個(gè)國(guó)際公認(rèn)的AD診斷標(biāo)準(zhǔn)，近40年來(lái)研究人員對(duì)其進(jìn)行多次更新，從僅有的癡呆癥狀到把AD看作一個(gè)包含了臨床前期和輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)在內(nèi)的連續(xù)的“疾病譜”，從質(zhì)樸的、典型的臨床表現(xiàn)到各種不典型的AD亞型，從臨床疑診、尸檢確診到可以在活體內(nèi)檢測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行確診，這些演變是醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步的縮影，也體現(xiàn)了人們對(duì)AD認(rèn)識(shí)的不斷深入[3, 4]。如何在患者生前確診AD是困擾研究人員的一大難題，在探索研究中不斷有新的生物學(xué)標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，其中腦源性外泌體是非常具有應(yīng)用前景的一類(lèi)標(biāo)志物，本文就其在AD診斷中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、為什么迫切需要開(kāi)發(fā)新的生物學(xué)標(biāo)志物

迄今為止，僅有5種藥物通過(guò)了美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準(zhǔn)并上市，上市成功率不到3%，且這些藥物僅能改善癥狀、延緩癡呆進(jìn)程，并不能對(duì)因治療[1]。2019年，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局有條件批準(zhǔn)了甘露特鈉(GV-971)的上市，在業(yè)內(nèi)引起廣泛關(guān)注，其遠(yuǎn)期效果仍有待研究。針對(duì)癥狀性AD患者的一系列大型臨床試驗(yàn)的失敗，已經(jīng)使研究者認(rèn)識(shí)到未來(lái)更應(yīng)該關(guān)注AD的臨床前期，將治療前移，才能夠使正確的藥物在正確的時(shí)期發(fā)揮應(yīng)有的作用[5, 6]。此外，進(jìn)一步的事后分析表明，部分Ⅲ期臨床試驗(yàn)中有高達(dá)20%的參與者并沒(méi)有AD的病理表現(xiàn)，這也是造成試驗(yàn)失敗的原因之一[5]。

根據(jù)2018年美國(guó)國(guó)立老化研究院和阿爾茨海默病協(xié)會(huì)(NIA-AA)最新的AD診斷框架，β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的生物學(xué)標(biāo)志物陽(yáng)性是確定患者進(jìn)入AD連續(xù)病程的必要條件，而臨床前期指的是那些出現(xiàn)了AD特征性的病理表現(xiàn)、但尚未出現(xiàn)客觀認(rèn)知功能損害的患者，這類(lèi)患者通常沒(méi)有任何臨床表現(xiàn)或僅有主觀的認(rèn)知下降，在實(shí)際臨床工作中很少被關(guān)注或極易被誤診成其他疾病狀態(tài)[4]。目前國(guó)際上公認(rèn)的Aβ檢測(cè)方法包括腦脊液Aβ含量檢測(cè)以及Aβ正電子發(fā)射掃描成像(positron emission tomography，PET)，但由于其有創(chuàng)性、輻射性、昂貴性，以及分析技術(shù)、閾值等尚未統(tǒng)一，所以很難進(jìn)行大范圍的推廣[7]。上述兩種檢測(cè)手段應(yīng)用于臨床上疑似AD癥狀性患者尚處于起步階段，難以在沒(méi)有任何客觀癥狀的人群中開(kāi)展檢查。因此，目前亟需一種新的生物學(xué)標(biāo)志物，可以反映AD內(nèi)在病理學(xué)改變，并能夠幫助醫(yī)務(wù)人員便捷地在臨床前期確診AD。

二、腦源性外泌體的生物學(xué)特點(diǎn)

外泌體是一種重要的細(xì)胞外囊泡，在細(xì)胞間的交流中發(fā)揮了重要作用，與此同時(shí)，外泌體也帶動(dòng)了AD相關(guān)病理性蛋白的聚集、沉淀和播散，在Aβ和tau蛋白的傳播過(guò)程中發(fā)揮了“朊蛋白樣”播散機(jī)制的作用，促進(jìn)了AD的發(fā)生和發(fā)展[7]。

外泌體的以下特性決定了它能夠成為優(yōu)秀的生物學(xué)標(biāo)志物：①包括血液在內(nèi)的絕大多數(shù)體液中均能提取出外泌體；②包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類(lèi)型均能夠釋放外泌體；③外泌體能夠借助自身的雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)通過(guò)血-腦脊液屏障；④外泌體的內(nèi)含物十分豐富，包括各種蛋白質(zhì)和非編碼RNA等物質(zhì)；⑤其自身膜性結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)內(nèi)含物不被酶解，且內(nèi)含物的含量可以根據(jù)外界不同的刺激而發(fā)生特異性的改變?；谘褐苯舆M(jìn)行標(biāo)志物的檢測(cè)，由于取材便利而適合大范圍推廣。然而，由于血液中的外泌體來(lái)源廣泛，不加篩選提取出的“總外泌體”可能并不能成為良好的AD生物學(xué)標(biāo)志物。腦源性外泌體，包括神經(jīng)元來(lái)源的外泌體(neuron-derived exosomes，NDEs)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體(astrocyte-derived exosomes，ADEs)等，科學(xué)家通過(guò)外周血液，利用免疫沉淀技術(shù)可以直接提取出這類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)檢測(cè)其內(nèi)含物的含量變化而間接得到神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的活動(dòng)情況，進(jìn)而反映出大腦內(nèi)在的病理學(xué)改變[7]。因此，血液中提取的腦源性外泌體有潛力能夠成為AD新的生物學(xué)標(biāo)志物。

三、腦源性外泌體中的Aβ和tau在AD診斷中的研究進(jìn)展

數(shù)十年來(lái)，AD發(fā)病機(jī)制中的“Aβ瀑布假說(shuō)”仍然是最為經(jīng)典的理論之一，正是因?yàn)锳β的代謝紊亂，才會(huì)出現(xiàn)后續(xù)的由磷酸化tau蛋白異常聚集而產(chǎn)生的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，在損傷達(dá)到一定程度之后就會(huì)影響到患者外在的認(rèn)知功能[1, 4]。根據(jù)NIA-AA最新的“A-T-(N)”診斷框架，生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)應(yīng)的分為“A”、“T”和“(N)”3種類(lèi)型，分別反映患者體內(nèi)Aβ、磷酸化tau蛋白和神經(jīng)元損傷這3種病理狀態(tài)，而患者只要“A”和“T”陽(yáng)性就可以確診AD[4]。正是因?yàn)锳β和tau蛋白在AD診斷中不可撼動(dòng)的地位，以及大量的基礎(chǔ)研究證實(shí)外泌體在二者的播散中起到了重要作用，腦源性外泌體中的Aβ和tau也是目前研究最廣泛、最重要的物質(zhì)[7]。

2015年，F(xiàn)iandaca等[8]進(jìn)行了一項(xiàng)開(kāi)拓性的病例對(duì)照研究，他們發(fā)現(xiàn)血液提取的NDEs中的P-T181-tau，P-S396-tau和Aβ42的表達(dá)量在癥狀性AD患者中要遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組，更令人驚訝的是，研究人員獲得了24例受試者在出現(xiàn)認(rèn)知損害前的，即認(rèn)知完整時(shí)的血液標(biāo)本，他們發(fā)現(xiàn)這3種物質(zhì)在長(zhǎng)達(dá)10年的臨床前期就已經(jīng)出現(xiàn)了表達(dá)量的升高，此外，NDEs中P-S396-tau能夠良好地區(qū)分AD患者和額顳葉癡呆的患者，一定程度上提示了其特異性。上述在癥狀性AD患者中得出的結(jié)論在另外兩篇文獻(xiàn)中得到了證實(shí)[9, 10]。除此之外，Goetzl等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ADEs中Aβ42的表達(dá)量在癥狀性AD患者中出現(xiàn)了下降，但由于和對(duì)照組之間存在巨大的重疊而嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用，他們進(jìn)一步研究了和Aβ代謝相關(guān)的酶或底物，如可溶性α或β淀粉樣前體蛋白、β-位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白裂解酶1等，也在NDEs或ADEs中出現(xiàn)了表達(dá)量的改變。Winston等[9]重點(diǎn)關(guān)注了MCI患者，他們根據(jù)患者在36個(gè)月內(nèi)是否轉(zhuǎn)化成癡呆定義MCI是否穩(wěn)定，發(fā)現(xiàn)NDEs中P-S396-tau和Aβ42的表達(dá)量在“不穩(wěn)定型MCI”患者和AD源性癡呆患者中均出現(xiàn)升高，且二者之間的表達(dá)量無(wú)差異，但在“穩(wěn)定型MCI”患者中并未出現(xiàn)改變，相比之下，P-T181-tau則不能預(yù)測(cè)MCI患者在未來(lái)是否出現(xiàn)認(rèn)知惡化。唐氏綜合征患者擁有和AD患者極其類(lèi)似的病理改變，在這些患者中同樣證實(shí)NDEs中的P-T181-tau、P-S396-tau和Aβ42的表達(dá)量相比對(duì)照組明顯升高[11]。

為了進(jìn)一步證實(shí)NDEs中的Aβ和tau蛋白是否在AD的臨床前期就已經(jīng)發(fā)生了變化，2019年，Kapogiannis等[12]進(jìn)行了一項(xiàng)重要的縱向研究，納入了迄今為止最多的樣本。研究人員對(duì)350例受試者進(jìn)行長(zhǎng)期追蹤，在平均3.5年的隨訪期，他們發(fā)現(xiàn)128例受試者出現(xiàn)了AD相關(guān)的認(rèn)知下降，222例受試者始終保持認(rèn)知穩(wěn)定，在這些受試者認(rèn)知功能出現(xiàn)惡化前或隨訪的截止日期前總共獲得了887份血液樣本。研究人員發(fā)現(xiàn)，相比于認(rèn)知穩(wěn)定的正常人，那些“轉(zhuǎn)化者”在臨床前期就已經(jīng)出現(xiàn)了NDEs中P-T181-tau和P-T231-tau的水平升高，然而奇怪的是，Aβ42的表達(dá)量并沒(méi)有明顯的變化，這與既往結(jié)論不一致[8, 9]。這一結(jié)果使NDEs中的Aβ42是否能作為AD臨床前期的生物學(xué)標(biāo)志物變得撲簌迷離，理論上，Kapogiannis等[12]所使用的單分子免疫陣列(single molecule array，SIMOA)技術(shù)檢測(cè)Aβ42要比既往的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技術(shù)更加敏感，因此陰性結(jié)果也是研究者始料未及的，他們并未做出更多的解釋。此外，該研究并未檢測(cè)P-S396-tau，其在臨床前期是否已經(jīng)出現(xiàn)改變?nèi)杂写嗟脑囼?yàn)去證實(shí)。

除上述研究之外，還有一些針對(duì)tau蛋白的研究得出了陰性的結(jié)果，但仔細(xì)比較之后可以發(fā)現(xiàn)這些研究的受試者入組標(biāo)準(zhǔn)并不夠嚴(yán)謹(jǐn)[13, 14]。Winston等[13]在MCI患者中發(fā)現(xiàn)NDEs中P-S396-tau的表達(dá)相對(duì)正常對(duì)照并沒(méi)有改變，然而這些MCI患者均是依靠單純的臨床信息進(jìn)行的診斷，并且沒(méi)有進(jìn)行隨訪，不知道他們未來(lái)的轉(zhuǎn)歸，因此可能存在巨大的異質(zhì)性，不一定是AD源性的MCI。Guix等[14]研究發(fā)現(xiàn)，full-length tau、mid-region tau和P-T181-tau的表達(dá)量在癥狀性AD患者中，相對(duì)正常對(duì)照組并沒(méi)有改變，但是作者也清楚地認(rèn)識(shí)到自己存在樣本量不足和單純臨床診斷的缺點(diǎn)。此外，在一項(xiàng)最新的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)AD源性癡呆和正常對(duì)照組之間以123和224氨基酸結(jié)尾的tau蛋白片段表達(dá)量不存在差異，這也提示NDEs中差異的tau蛋白可能是以特定形式存在的[15]。

在腦源性外泌體中的Aβ和tau蛋白真正應(yīng)用于臨床診斷之前，必須有研究去把它們和現(xiàn)有的、公認(rèn)的AD生物學(xué)標(biāo)志物去比對(duì)，以明確是否存在嚴(yán)格的匹配關(guān)系。來(lái)自首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院的賈建平教授團(tuán)隊(duì)在2019年發(fā)表了一項(xiàng)重要的多中心臨床研究，在包含82例受試者的“探索組”和216例受試者的“驗(yàn)證組”中，均發(fā)現(xiàn)NDEs中P-T181-tau、T-tau和Aβ42的表達(dá)量在癡呆、MCI和正常對(duì)照組之間存在階梯狀改變，即癡呆組的表達(dá)量大于MCI組，而MCI組大于對(duì)照組。此外，重要的是，3種物質(zhì)在NDEs中的表達(dá)量和他們?cè)谀X脊液中的表達(dá)量存在嚴(yán)格的匹配關(guān)系，也就是說(shuō)作者推論從血液提取的NDEs完全可以替代腦脊液診斷AD[16]。該研究是目前唯一把腦源性外泌體和“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行比對(duì)的研究，對(duì)未來(lái)AD指南的更新存在重要意義。

從上述多項(xiàng)研究中筆者可以明確得出結(jié)論，血液中提取的腦源性外泌體中的Aβ和tau蛋白的表達(dá)量在AD癥狀期、甚至是臨床前期出現(xiàn)了特異性變化，有望成為一種新的診斷性AD生物學(xué)標(biāo)志物。

四、腦源性外泌體中其他生物學(xué)標(biāo)志物

AD臨床癥狀要滯后于其病理改變，而現(xiàn)有證據(jù)還是支持“Aβ瀑布假說(shuō)”，因此，筆者推測(cè)下文所述的生物學(xué)標(biāo)志物均屬于Aβ的下游事件，是反映神經(jīng)元損傷的標(biāo)志物，對(duì)應(yīng)于“A-T-(N)”診斷體系中的“(N)”類(lèi)別[3]。理論上來(lái)講，這一類(lèi)基于外泌體的標(biāo)志物是非特異的，反映AD或其他病理狀態(tài)的最終結(jié)局。然而，現(xiàn)有的證據(jù)表明它們能夠良好地區(qū)分AD和額顳葉癡呆，甚至在AD臨床前期就已經(jīng)發(fā)生了變化。但是爭(zhēng)議仍然存在，比如，它們是否能夠區(qū)分除額顳葉癡呆之外的其他變性病或者外傷？改變的程度是否和疾病的嚴(yán)重性有關(guān)？這些都值得進(jìn)一步研究。

一直以來(lái)，研究者認(rèn)為突觸損傷可以直接導(dǎo)致認(rèn)知功能下降，大量研究工作都圍繞著突觸開(kāi)展，試圖尋找一種反映突觸損傷的標(biāo)志物來(lái)間接診斷AD[17]。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43、synaptophysin、synaptotagmin、synapsin 1及其絲氨酸9磷酸化的變體，它們作為突觸前膜蛋白在調(diào)節(jié)囊泡融合、釋放或再循環(huán)中都起到了重要作用，而synaptopodin和neurogranin作為兩個(gè)重要的突觸后膜蛋白則在監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度中發(fā)揮作用。此外，神經(jīng)元穿透素2(pentraxin 2)、含有g(shù)luA4的谷氨酸(gluA4-containing glutamate)、neurexins 2α和neuroligin 1對(duì)維持突觸功能至關(guān)重要[7]。已經(jīng)有研究證實(shí)NDEs中的上述11種反映突觸狀態(tài)的標(biāo)志物，在AD源性認(rèn)知損害的受試者中的表達(dá)量比正常人明顯下降[18, 19]。此外，synaptophysin、neurexins 2α等物質(zhì)在受試者出現(xiàn)認(rèn)知損害前1～10年，即認(rèn)知正常時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)了改變；而且neurogranin表達(dá)量的下降也預(yù)示著MCI受試者在未來(lái)36個(gè)月之內(nèi)會(huì)進(jìn)展成癡呆[9]。在相關(guān)性分析中，研究者還發(fā)現(xiàn)NDEs中的synaptophysin、synaptotagmin、synaptopodin，含有g(shù)luA4的谷氨酸和neuroligin 1，而不是Aβ42或P-T181-tau，與認(rèn)知功能呈明顯的負(fù)相關(guān)，因此提示真正導(dǎo)致認(rèn)知下降的是這些包括突觸損害在內(nèi)的下游事件。

胰島素的信號(hào)通路成分，如生長(zhǎng)因子-1受體和胰島素受體，控制著諸如葡萄糖攝取和能量代謝等重要腦功能。許多研究者致力于研究它們?cè)贏D中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抵抗，發(fā)現(xiàn)這似乎是一種早期和普遍的特征。胰島素受體底物-1(IRS-1)是胰島素受體的效應(yīng)分子，它的幾個(gè)酪氨酸殘基的磷酸化將激活胰島素信號(hào)功能，而絡(luò)氨酸殘基的去磷酸化和(或)某些絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化將導(dǎo)致信號(hào)的抑制。這些特異性的IRS-1磷酸化形式可作為腦胰島素抵抗的生物學(xué)標(biāo)志物，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在AD患者的腦組織中發(fā)生了變化[7]。相應(yīng)地，有研究探索他們?cè)贜DEs中的改變，研究人員檢測(cè)了NDEs中的IRS-1、磷酸化-絲氨酸312-IRS-1(P-S312-IRS-1)和磷酸化-pan-酪氨酸-IRS-1(P-panY-IRS-1)，并定義R(P-S312-IRS-1/P-panY-IRS-1)為腦胰島素抵抗指數(shù)，發(fā)現(xiàn)癥狀性AD患者中的P-panY-IRS-1表達(dá)量明顯下降，而P-S312-IRS-1和R則明顯升高，而且R能夠良好地區(qū)分糖尿病患者、AD患者、額顳葉癡呆患者和正常對(duì)照組。與突觸標(biāo)志物類(lèi)似，這3個(gè)指標(biāo)也是在受試者出現(xiàn)認(rèn)知損害前1～10年就已經(jīng)出現(xiàn)了改變[20]。在該作者的后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，P-S312-IRS-1和P-panY-IRS-1與大腦的皮質(zhì)萎縮明顯相關(guān)，提示二者分別在AD的病理學(xué)改變中起到了損害和保護(hù)性的作用[21]。

除上述研究之外，也有研究者去探索腦源性外泌體中泛素蛋白酶系統(tǒng)或自噬溶酶系統(tǒng)的生物學(xué)標(biāo)志物、神經(jīng)炎癥和補(bǔ)體系統(tǒng)的標(biāo)志物、一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及阻遏元件1-沉默轉(zhuǎn)錄因子(REST)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(LRP6)或熱休克蛋白等調(diào)控Aβ表達(dá)的因子，均得出良好的結(jié)論[10, 22～25]。這也提示AD是一個(gè)異常復(fù)雜的病理學(xué)狀態(tài)，其下游事件和旁支末節(jié)的調(diào)控因子非常豐富，有更多未知的標(biāo)志物值得去探索。

綜上所述，基于外周血提取的腦源性外泌體有望成為一種新型AD診斷性、甚至是預(yù)測(cè)性的生物學(xué)標(biāo)志物。目前，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家，普通神經(jīng)科門(mén)診或記憶門(mén)診通常會(huì)收到涵蓋各種疾病的廣泛轉(zhuǎn)診，醫(yī)療資源得不到合理的配置。此外，現(xiàn)有的基于腦脊液或影像學(xué)的診斷標(biāo)志物也都集中在這樣的專(zhuān)業(yè)門(mén)診，但是此時(shí)的患者病情發(fā)展往往錯(cuò)過(guò)了最好的治療機(jī)會(huì)。而基于外周血就可以獲得的腦源性外泌體可以將AD的診斷提前10年，再加上基層大夫就可以獲得的人口學(xué)信息，可以進(jìn)一步提高預(yù)測(cè)AD的準(zhǔn)確性，這對(duì)合理轉(zhuǎn)診、優(yōu)化醫(yī)療保健的利用率和成本會(huì)產(chǎn)生重大和深遠(yuǎn)的影響[12]。考慮到腦源性外泌體的研究尚處于起步階段，且也存在一些矛盾和爭(zhēng)議，未來(lái)在多中心納入更多的受試者、在不同的實(shí)驗(yàn)室完善實(shí)驗(yàn)、進(jìn)行多病種的鑒別以及和AD的“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行匹配，是使腦源性外泌體得到公認(rèn)和大范圍推廣所必須要做的事情。