上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與呼吸系統(tǒng)疾病研究進(jìn)展*

陳冠穎 俞萬鈞 王華英

1 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江省寧波市 315211； 2 寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞逐漸失去其原有的特性和功能，并獲得間質(zhì)細(xì)胞(成纖維樣細(xì)胞)表型的過程。在20世紀(jì)70年代末，Elizabeth Hay首先觀察到EMT的過程及其在胚胎發(fā)育中的重要性，提出該概念并展開討論。隨后，EMT在胚胎發(fā)育、原腸胚形成以及神經(jīng)嵴、心臟和其他器官的發(fā)育和成熟中的重要作用被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。1985年，Stocker等[1]證明，成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清能夠誘導(dǎo)犬腎上皮細(xì)胞分散和遷移。EMT還與組織器官的修復(fù)、慢性炎癥、纖維化以及多種腫瘤的發(fā)展有關(guān)，包括腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥性[2]。EMT被劃分為三種不同類型：第一種發(fā)生在胚胎發(fā)育過程中，第二種與組織損傷修復(fù)有關(guān)，第三種類型發(fā)生在癌癥的發(fā)展過程中。

1 EMT的細(xì)胞改變及調(diào)控

1.1 細(xì)胞狀態(tài)變化 上皮細(xì)胞在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)生了重大變化，可分為四大功能轉(zhuǎn)變：基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)變、細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)能力的變化、細(xì)胞黏附功能變化以及細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的成分改變。值得注意的是，無論是生理發(fā)育過程還是在病理狀態(tài)下，從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)轉(zhuǎn)變往往是不完全的，導(dǎo)致細(xì)胞處在中間狀態(tài)，同時(shí)保留有上皮和間充質(zhì)的特征。由于EMT的程度取決于不同的生長環(huán)境，因此EMT不會(huì)導(dǎo)致單一的間充質(zhì)狀態(tài)，而是導(dǎo)致具有不同程度上皮和間充質(zhì)特征的多樣化中間狀態(tài)[3]。

EMT過程中，細(xì)胞間的緊密連接丟失，上皮特異性標(biāo)記如細(xì)胞角蛋白(Cytokeratins)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等表達(dá)下調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)記如纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)增加。細(xì)胞角蛋白是上皮細(xì)胞特有的中間絲，在EMT過程中，細(xì)胞被重編程轉(zhuǎn)而表達(dá)波形蛋白。成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(Fibroblast specific protein-1,FSP-1)與細(xì)胞遷移能力增加、腫瘤侵襲性以及更差的肺癌預(yù)后相關(guān)，在EMT過程中獲得表達(dá)。α-SMA也是評(píng)估EMT的一個(gè)常用指標(biāo)，α-SMA的表達(dá)是肌成纖維細(xì)胞的特征，肌成纖維細(xì)胞通過分泌過多的細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致氣道重塑和纖維化。此外，緊密連接相關(guān)蛋白如Occludins和ZO-1、閉合蛋白(claudins)和E-cadherin在EMT中表達(dá)下調(diào)，引起細(xì)胞間連接的分離。

1.2 EMT的調(diào)控 EMT是通過復(fù)雜的分子途徑調(diào)節(jié)的，這些作用途徑包括microRNAs、表觀遺傳調(diào)控和翻譯后的選擇性剪接[4]。目前的研究表明大量細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控EMT過程，細(xì)胞因子包括轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factor β,TGF-β)、表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)、胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor,IGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)等，轉(zhuǎn)錄因子包括Snail、Slug、Twist、β-catenin、ZEB-1/ZEB-2和Tcf/LEF等[5]。這些轉(zhuǎn)錄因子已被證明可與參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多種蛋白(包括在表觀遺傳修飾中發(fā)揮作用的蛋白分子)相互作用，與之共同形成調(diào)控復(fù)合物。TGF-β是目前EMT中研究最廣泛的細(xì)胞因子之一，可通過Smad信號(hào)通路的激活引起Zeb2和Snail的上調(diào)，進(jìn)而抑制E-cadherin、ZO-1、Occludin等的表達(dá)[6]。此外，細(xì)胞外基質(zhì)如膠原或缺氧條件，在與細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子相互作用并誘導(dǎo)EMT中也發(fā)揮著重要作用。

2 EMT在慢性阻塞性肺疾病中的作用

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以肺氣腫為特征，同時(shí)伴有氣道重塑和炎癥，并且與肺癌密切相關(guān)[7]。氣道阻塞會(huì)導(dǎo)致COPD患者的氣流受限，而香煙煙霧引起的氣道重構(gòu)是其重要原因[8]，但氣道重塑的機(jī)制目前尚未完全闡明。EMT過程可能是這一病理過程中一個(gè)重要的潛在機(jī)制。近幾年的研究表明，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在吸煙者和COPD患者的氣道中進(jìn)展活躍[9]，氣道上皮和網(wǎng)狀基底膜裂隙的細(xì)胞中出現(xiàn)更多的EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和間充質(zhì)標(biāo)記物，而且與肺功能下降和戒煙相關(guān)。此外，幾種細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9、基質(zhì)金屬蛋白酶12、彈力蛋白、FSP-1也被發(fā)現(xiàn)表達(dá)升高[10]。

TGF-β和SHH信號(hào)通路被證明在誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病和EMT時(shí)受到顯著激活，是COPD發(fā)生EMT的主要通路。Nishioka等[11]將COPD患者的肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基與人支氣管上皮細(xì)胞(Human bronchial epithelial cells, HBEs)共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)后者部分上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這表明慢性阻塞性肺疾病中常駐的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的相互作用可能是驅(qū)動(dòng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。

EMT已經(jīng)被證明與良性肺疾病如COPD轉(zhuǎn)變?yōu)榉螑盒阅[瘤有關(guān)。吸煙是肺癌和慢性阻塞性肺疾病有一個(gè)共同的病因。此外，即使戒煙后，慢性阻塞性肺疾病的存在可使肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加4～5倍，這表明慢性阻塞性肺病的特定機(jī)制可能與肺癌的發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)的EMT活性與未受腫瘤影響的氣道壁上皮的EMT活性密切相關(guān)，這表明氣道壁的EMT活性水平可以潛在地用作最有可能發(fā)展為COPD和肺癌的吸煙者的標(biāo)志物[12]。這些研究結(jié)果明確地表明，EMT是慢性阻塞性肺疾病和肺癌之間存在的潛在聯(lián)系。

3 EMT在支氣管哮喘中的作用

哮喘是一種復(fù)雜的氣道慢性炎癥性疾病，其表現(xiàn)為可逆性氣流受限、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑[13]。Johnson等[14]通過塵螨誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶標(biāo)記的氣道上皮細(xì)胞逐漸失去上皮特征如E-cadherin、Occludin，而間充質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白、α-SMA等表達(dá)增加，并遷移到上皮下組織，這為慢性哮喘小鼠模型發(fā)生EMT提供了證據(jù)。作者認(rèn)為該哮喘模型中，由Th2細(xì)胞主導(dǎo)的慢性炎癥增加了嗜酸性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分泌的TGF-β，并儲(chǔ)存在細(xì)胞外基質(zhì)中，進(jìn)而誘發(fā)EMT。卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)哮喘模型小鼠是最常用的哮喘動(dòng)物模型，在研究中被觀察到支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤增加、平滑肌層增厚和膠原沉積，伴有間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加及上皮標(biāo)志物表達(dá)減少[15-16]，Liu等[17]同時(shí)在哮喘患者及OVA哮喘模型小鼠中觀察到了EMT現(xiàn)象，這些研究表明哮喘的氣道重塑過程伴隨著EMT的發(fā)生。

一般認(rèn)為哮喘是一種過敏性炎癥，其特征是氣道的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)氣管內(nèi)滴注嗜酸性粒細(xì)胞可以誘發(fā)小鼠氣道上皮EMT，體外肺上皮細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)也獲得了同樣結(jié)果[17-18]，進(jìn)一步說明氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎性浸潤可以促進(jìn)EMT。然而，有觀點(diǎn)認(rèn)為目前哮喘肺組織中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是有爭議的，原因是與慢性阻塞性肺病不同，成人哮喘患者的肺氣道上皮組織中沒有表現(xiàn)出活躍EMT的核心結(jié)構(gòu)特征，如網(wǎng)狀基底膜斷裂、細(xì)胞增生或血管過多的跡象。

4 EMT在特發(fā)性肺纖維化中的作用

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種原因不明的進(jìn)行性纖維化肺疾病，隨著病程的發(fā)展，肺組織形成纖維化瘢痕，從而阻礙氧氣的肺內(nèi)交換，并導(dǎo)致呼吸困難。由于缺少有效的治療手段，目前IPF患者確診后的中位生存期僅2～5年[19]。該疾病的主要病理特征是纖維化區(qū)大量的成纖維細(xì)胞聚集，并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，形成成纖維細(xì)胞病灶(Fibroblast foci，F(xiàn)F)[20]。這些成纖維細(xì)胞病灶出現(xiàn)在正常組織和纖維化組織之間，是組織纖維化和疤痕的形成中心[21]。FF的形成主要有三種假說，包括組織常駐成纖維細(xì)胞來源、骨髓源性成纖維祖細(xì)胞來源以及肺泡上皮細(xì)胞經(jīng)EMT而來，目前越來越多的證據(jù)支持肺泡上皮細(xì)胞來源說。IPF患者成纖維細(xì)胞病灶周圍正常組織中的肺泡上皮細(xì)胞被證實(shí)同時(shí)表達(dá)上皮和間充質(zhì)標(biāo)志物[22]，且小鼠肺纖維化模型中的細(xì)胞譜系示蹤實(shí)驗(yàn)也表明肺纖維化小鼠氣道的間充質(zhì)表型細(xì)胞來源于上皮組織[23]，這些研究成果都將FF的形成源頭指向EMT。

IPF中EMT的激活可能有幾種潛在的觸發(fā)因素，除了TGF-β、Notch和Wnt/β-catenin等公認(rèn)EMT相關(guān)的信號(hào)通路，近些年來的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response, UPR)等在肺纖維化中的EMT過程中也發(fā)揮著重要作用，是目前研究的熱點(diǎn)。雖然TGF-β抑制劑如比菲尼酮已被廣泛用于延緩肺纖維化進(jìn)展，但目前臨床上仍缺乏特效藥物。已有研究表明多種miRNAs能影響Smad蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的EMT[24]，此外，Liu等[25]發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙酰化酶(HDAC)能通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)肺上皮細(xì)胞EMT，這些新發(fā)現(xiàn)可能為IPF的治療提供新的靶點(diǎn)。

5 EMT在肺癌中的作用

癌變的上皮細(xì)胞可以通過3型上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生遷移，侵入周圍組織間質(zhì)，并通過血液和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散到遠(yuǎn)處形成癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移。發(fā)生EMT的細(xì)胞可能獲得對(duì)凋亡的抗性和循環(huán)腫瘤細(xì)胞表型[26]，研究表明，EMT與腫瘤發(fā)病率的增加、對(duì)多種治療方案耐藥性的產(chǎn)生、免疫逃避、代謝改變和基因組的不穩(wěn)定性息息相關(guān)。

在非小細(xì)胞肺癌中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型與耐藥性、EGFR(表皮生長因子受體)突變和腫瘤干細(xì)胞的形成密切相關(guān)，其特征在于豐富的腫瘤干細(xì)胞表型和更強(qiáng)的癌變潛能[27]。研究表明E-鈣粘蛋白和連環(huán)蛋白表達(dá)的減少或喪失是非小細(xì)胞肺癌的不利預(yù)后因素，而波形蛋白和Snail蛋白的表達(dá)也與非小細(xì)胞肺癌的惡性表型相關(guān)[2]。此外，吉非替尼耐藥的A549表現(xiàn)出紡錘形形態(tài)以及間充質(zhì)標(biāo)記波形蛋白的較高水平表達(dá)，并伴隨著E-鈣粘蛋白的降低，提示存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。而激活非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的TGF-β信號(hào)可誘導(dǎo)EMT，使腫瘤細(xì)胞對(duì)埃羅替尼不敏感；并且在進(jìn)行埃羅替尼治療前，埃羅替尼耐藥的間充質(zhì)表型細(xì)胞已經(jīng)存在于細(xì)胞系和腫瘤中。Tripathi等[28]研究發(fā)現(xiàn)EMT可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的免疫逃避，間充質(zhì)表型的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表達(dá)低水平的免疫蛋白酶體，并抑制CD8+T細(xì)胞相關(guān)抗原的呈遞，而免疫蛋白酶體缺乏與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良相關(guān)。

綜上所述，目前關(guān)于EMT在纖維化和腫瘤中的意義逐漸得到揭示，人們也意識(shí)到EMT并不是一個(gè)雙終點(diǎn)的二元過程。但關(guān)于抗EMT藥物的研究還相對(duì)較少，主要為體外實(shí)驗(yàn)，人體和臨床研究尤其稀少，因此對(duì)于EMT的治療方案目前仍處于起步階段。隨著研究的逐漸深入， EMT和呼吸道疾病的相關(guān)機(jī)制得到闡明，可為其在部分肺部疾病的治療上提供新的治療策略。