復合益生菌和霉菌毒素降解酶對黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的同步降解

王曉敏，常 娟，王 平，尹清強 ，楊明凡，朱 群，胡驍飛，王全亮

（1.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河南鄭州 450046；2.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，河南鄭州 450046；3.河南德鄰生物制品有限公司，河南新鄉(xiāng) 453000；4.河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002；5.河南廣安生物科技股份有限公司，河南鄭州 450001）

霉菌毒素廣泛存在于自然界中，是由霉菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物（Hisako 等，2013），目前大約有100 多種真菌產(chǎn)生300 多種霉菌毒素（Pereira 等，2014）。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，小麥、玉米、花生等都是我國的主要農(nóng)產(chǎn)品，但與此同時，我國也是霉菌毒素污染問題較為嚴重的國家之一。2018 年中國飼料和原料中霉菌毒素污染情況調(diào)查報告顯示，我國99.49%的飼料和原料存在霉菌毒素污染問題，其中85%以上的飼料和原料被2 種或2 種以上的霉菌毒素污染（雷元培等，2018）。飼料中常見且危害較大的霉菌毒素有黃曲霉毒素B1（AFB1）、玉米赤霉烯酮（ZEA）和嘔吐毒素（DON）等。這三種霉菌毒素能夠降低機體免疫力，具有致癌性、基因毒性和生殖毒性等，可嚴重危害機體健康（黃珂等，2019；劉艷麗等2012；Meissonmmier 等，2006；Wang 和 Groopman，1999），而且這些霉菌毒素的疊加毒性遠大于單一毒素的作用（韓文格和高建峰，2019）。因此，關于消除霉菌毒素危害的研究受到越來越廣泛的關注。傳統(tǒng)的物理和化學方法對于霉菌毒素的去除有一定的局限性，物理方法主要靠蒙脫石等的吸附功能，但存在著吸附譜窄、效價低、解吸附及吸附維生素和礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì)的缺點；化學方法通常會影響飼料的營養(yǎng)品質(zhì)和適口性，降低飼料利用率，并存在安全隱患（Cao 等，2011；Yiannikouris 和Jouany，2002），難以大規(guī)模在生產(chǎn)中應用。生物解毒法包括微生物降解法和酶解法，具有高效、特異性強、環(huán)境友好、污染小的特點，因此近些年來成為人們研究的熱點（蔡俊等，2017）。趙雪芹等（2020）選擇遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、羅伊氏乳桿菌、乳酸片球菌、嗜熱鏈球菌和米曲霉6 種益生菌來降解ZEA 和DON，結(jié)果表明，遲緩芽孢桿菌對DON 降解率達到79.59%，對ZEA 降解率達到46.93%。Shetty 等（2007）篩選出了兩株釀酒酵母，對AFB1的吸附能力分別為38.7%和36.1%，并提出起吸附作用的是其細胞壁上的碳水化合物或甘露聚糖。劉暢等（2010）篩選出了一株對AFB1的吸附率高達81.16%的釀酒酵母。鄭文秀等（2019）馴化的酪丁酸梭菌菌株對ZEA 的吸附率可達98.5%。這些都是利用益生菌去除單一霉菌毒素的研究，但實際生產(chǎn)中，一種飼料或飼糧往往受到多種霉菌毒素污染。其協(xié)同或疊加毒性對動物健康和生產(chǎn)性能的影響比單一霉菌毒素單獨作用的危害更大（李彥伸等，2020）。鑒于此，本研究通過將具有解毒功能的枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌與霉菌毒素降解酶進行高效組合，研究其對AFB1、ZEA 和DON 三種霉菌毒素的聯(lián)合降解作用，為多種霉菌毒素的同步生物降解提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 AFB1和ZEA 購自Sigma 公司，DON 購自上海源葉生物科技有限公司，AFB1和ZEA 定量檢測試劑盒購自德國R-BiopHarm 公司，DON 定量檢測試劑盒購自江蘇省蘇微微生物研究有限公司?？莶菅挎邨U菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌和產(chǎn)生霉菌毒素降解酶的米曲霉均由河南農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)與飼料生物技術研究室保存。

1.2 培養(yǎng)基的配制 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L。YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。丁酸梭菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉3 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉5 g/L，乙酸鈉3 g/L，可溶性淀粉1 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，pH為6.8 g/L。PDA 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，可溶性淀粉6 g/L，酵母浸粉2 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，蛋白胨5 g/L。上述培養(yǎng)基為固體時需要再加入2%瓊脂，用蒸餾水定容至1 L，在121 ℃、1.035×105Pa 條件下高壓蒸汽滅菌20 min 備用。米曲霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮∶豆粕∶玉米=7∶2∶1，固體：蒸餾水=5∶3，滅菌方法同上。

1.3 菌種的活化與培養(yǎng) 將實驗室保存的枯草芽孢桿菌接種到LB 培養(yǎng)基上，37 ℃、180 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h；釀酒酵母接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上，30 ℃、180 r/min 條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h；丁酸梭菌接種到丁酸梭菌培養(yǎng)基上，37 ℃靜置狀態(tài)下培養(yǎng)24 h 后，分別按2%的接種量接入對應高壓滅菌后的新鮮培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)24 h。菌種用平板涂布法測定活菌數(shù)，統(tǒng)一調(diào)整活菌數(shù)至1×108cfu/mL，活菌數(shù)用自然對數(shù)值lg 表示，菌種保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

霉菌毒素降解酶的制備：挑取實驗室保存的米曲霉菌株，將其涂布于PDA 平板上，30 ℃靜置培養(yǎng)，3～5 d 有大量米黃色孢子產(chǎn)生，在平皿中加入5 mL 的滅菌生理鹽水，用涂布棒將平板上的孢子刮下，將其轉(zhuǎn)移至高壓滅菌過的米曲霉固體發(fā)酵培養(yǎng)基中并攪拌均勻，30 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，待有大量孢子產(chǎn)生時晾干。按照固液比1∶20 的比例，將米曲霉固體發(fā)酵培養(yǎng)物與生理鹽水混勻，攪拌2 h 后再靜置2 h，將浸泡液先用8 層紗布過濾，之后濾液在12000 r/min 條件下離心10 min，最后用0.22 μm 的濾膜過濾除菌后，保存于4 ℃冰箱待用。

1.4 復合益生菌最佳配伍比例的確定 采用拉丁方三因素三水平試驗設計，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌為拉丁方試驗設計的三個因素，1×105、1×106、1×107cfu/mL 為三種益生菌的三個活菌數(shù)水平。構(gòu)建得到9 種復合微生物菌株組合來篩選優(yōu)化益生菌組合，試驗分組見表1。根據(jù)本實驗室以前的研究結(jié)果，設置了高劑量毒素組（AFB1、ZEA、DON 分別為30、150、1500 μg/L）和低劑量毒素組（AFB1、ZEA、DON 分別為10、150、600 μg/L）。反應體系為5 mL，試驗組根據(jù)試驗設計加入3 mL MRS 培養(yǎng)基和1.5 mL 復合益生菌菌液，用生理鹽水調(diào)至5 mL。以相同體積的MRS培養(yǎng)基加等劑量的三種霉菌毒素作為空白對照，每個處理3 個重復，各組置于37 ℃、100 r/min 恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，以AFB1、ZEA、DON 的降解率作為參考指標，優(yōu)化得到復合益生菌的最優(yōu)添加比例。

1.5 益生菌組合與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA、DON 的降解 根據(jù)表1 設計得到同時對AFB1、ZEA 和DON 降解效果最優(yōu)的益生菌組合后，把復合益生菌的量定為1.5 mL，霉菌毒素降解酶的用量分別為0.05、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，最后用MRS 培養(yǎng)基調(diào)至5.0 mL。每個處理3 個重復，各組置于37 ℃、100 r/min 恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，測定各組AFB1、ZEA、DON 三種毒素的降解率。

表1 復合益生菌降解AFB1、ZEA、DON 拉丁方試驗設計 lg cfu/mL

1.6 三種霉菌毒素降解率測定與計算 反應結(jié)束后，發(fā)酵液在10000 r/min 條件下離心5 min，取上清液按照檢測試劑盒步驟說明進行AFB1、ZEA、DON 降解率測定。AFB1降解率/%=（24 h 對照組AFB1含量-24 h 試驗組AFB1含量）/24 h 對照組AFB1含量×100；ZEA 和DON 降解率的計算方法同上。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步整理后，采用SPSS 25.0 軟件進行One way ANOVA單因素方差統(tǒng)計分析，利用Duncan’s 法進行多重比較，測定復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA、DON 的降解效果。所有結(jié)果均以“平均值±標準差”表示，以P ＜0.05 表示差異顯著，P ＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 高毒素組復合益生菌對AFB1、ZEA、DON三種毒素的降解效果 由表2 可知，高劑量霉菌毒素處理中，試驗1 組AFB1和DON 降解率最高，分別達到了40.55%和47.22%（P ＜0.05）。雖然試驗1 組ZEA 的降解率為56.05%，不是最高，但與ZEA 降解率最高組差異不顯著。把AFB1、ZEA 和DON 降解率相加得三者總降解率，試驗1組AFB1、ZEA 和DON 總降解率為143.83%，顯著高于其余各組（P ＜0.05）。各因素對霉菌毒素降解率影響的主次關系為A（枯草芽孢桿菌）＞B（釀酒酵母菌）＞C（丁酸梭菌）。極差分析顯示枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌最優(yōu)添加比例為A1B1C1，即1×105、1×105、1×105cfu/mL，與試驗結(jié)果一致。表3 的結(jié)果顯示該試驗結(jié)果有效，其中A（枯草芽孢桿菌）對三種霉菌毒素的同步降解貢獻最大（P ＜0.01），與表2 的結(jié)果一致。

表2 高毒素組益生菌不同配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

表3 各因素之間的主體效應分析

2.2 低毒素組復合益生菌對AFB1、ZEA、DON三種毒素的降解效果 由表4 可知，低劑量霉菌毒素處理中，試驗1 組AFB1降解率最高為43.05%（P ＜0.05），雖然該組ZEA 和DON 的降解率不是最高，但與最高組差異不顯著（P ＞0.05）；該組AFB1、ZEA 和DON 降解率相加，得到霉菌毒素總降解率最高，為161.8%（P ＜0.05）。因而，仍把試驗1 組作為三種霉菌毒素降解的最佳組。各因素對霉菌毒素降解率影響的主次關系為A（枯草芽孢桿菌）＞B（釀酒酵母菌）＞C（丁酸梭菌）。極差分析顯示枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌最優(yōu)添加比例為A1B1C1，即1×105、1×105、1×105cfu/mL，與試驗結(jié)果一致。表5 的結(jié)果顯示，該試驗結(jié)果有效，其中因素A（枯草芽孢桿菌）和B（釀酒酵母菌）對三種霉菌毒素的同步降解貢獻最大（P ＜0.01）。

表4 低毒組益生菌不同配伍比例對AFB1、ZEA、DON 的降解率（n=3）

表5 各因素之間的主體效應分析

2.3 高毒素組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 三種毒素的降解效果 由表6 可知，在高劑量霉菌毒素的降解試驗中，單一復合益生菌、單一霉菌毒素降解酶及復合益生菌與霉菌毒素降解酶比例為30∶1 時，對三種霉菌毒素的總降解率最高，分別到達了190.08%、175.10%和184.44%，顯著地高于其他組（P ＜0.05）。

表6 高毒素組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

2.4 低毒組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA、DON 三種毒素的降解效果 由表7 可知，在低劑量霉菌毒素的降解試驗中，單一霉菌毒素降解酶對三種霉菌毒素的總降解率最高，達到了219.23%（P ＜0.05）；其次為單一復合益生菌、復合益生菌與霉菌毒素降解酶比例為30∶1 和3∶2 時，對三種霉菌毒素的總降解率較高，分別達到了178.07%、181.84%和170.33%，顯著高于其他組（P ＜0.05）。

表7 低毒素組復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解率（n=3）

3 討論

3.1 復合益生菌對AFB1、ZEA 和DON 三種霉菌毒素的降解效果 許多學者對如何消除霉菌毒素對畜禽健康和生產(chǎn)性能的不良影響，降低霉菌毒素及其代謝產(chǎn)物在畜產(chǎn)品中的殘留等方面作了大量研究。結(jié)果證明，微生物降解對霉毒素的去除效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的物理和化學脫毒方法（張俊南等，2019；劉水靈等，2018；Farbo 等，2016；李文明，2013）。梁含等（2019）從土壤和發(fā)霉秸稈等材料中篩選的淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對DON 的降解率分別為19.1%和51.3%。將兩種菌株組合后對DON 的降解率可達71%。何潤霞（2016）篩選出14 株降解ZEA 的細菌，其中一株紅球菌對ZEA 降解率達87.1%。研究已經(jīng)證實，許多真菌能夠?qū)FB1降解成低毒或無毒的產(chǎn)物（王佳興等，2020；Rushing 和Selim，2018）。本研究結(jié)果表明，將枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、丁酸梭菌進行有效配伍，可有效同步降解AFB1、ZEA 和DON，優(yōu)于前人對單一毒素的降解，更切合生產(chǎn)實際。這些復合益生菌除具有降解多種霉菌毒素外，還具有調(diào)節(jié)動物胃腸道微生物區(qū)系，提高機體健康和免疫力的功效，對于畜牧業(yè)的健康和安全生產(chǎn)意義重大。

3.2 復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍對AFB1、ZEA 和DON 的降解效果趙雪芹等（2020）將米曲霉與AFB1共培養(yǎng)，AFB1降解率為46.93%。左瑞雨（2012）篩選到一株米曲霉，其所分泌的酶制劑對AFB1降解率達到77.0%，當該酶制劑與枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌配伍后，可更有效地降解AFB1（左瑞雨等，2018）。王開萍等（2015）從土壤樣品中篩選出一株能夠降解DON的米曲霉，降解率達到60%以上。劉超齊（2017）等將復合益生菌（枯草芽孢桿菌K3、枯草芽孢桿菌K4 和產(chǎn)朊假絲酵母）與來自米曲霉的霉菌毒素降解酶配比為2∶1 時，對ZEA 降解率達到95.15%。米曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生多種酶系，能夠促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收利用，其分泌的胞外酶還可以降解多種霉菌毒素（Garda-Buffon 和Badiale-Furlong，2010）。通過復合益生菌與霉菌毒素降解酶的配伍試驗可以看到，無論是高劑量或是低劑量霉菌毒素存在，單一的復合益生菌或者單一的霉菌毒素降解酶都可提高其對AFB1、ZEA 和DON 總降解率。雖然復合益生菌與霉菌毒素降解酶的配伍也可以提高AFB1、ZEA 和DON 總降解率，但是兩者配伍的優(yōu)勢沒有體現(xiàn)出來?？紤]到該產(chǎn)品未來將在動物胃腸道發(fā)揮作用，因而單一復合益生菌、單一霉菌毒素降解酶及適宜的復合益生菌與霉菌毒素降解酶配伍，都將會在多種霉菌毒素的同步降解中發(fā)揮重要作用，對畜禽健康養(yǎng)殖和畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)具有重要意義。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，復合益生菌、霉菌毒素降解酶或兩者適宜的配伍均能有效降解AFB1、ZEA 和DON，為畜牧業(yè)和飼料業(yè)生產(chǎn)中消除多種霉菌毒素對動物的危害奠定了基礎。