海藻酸鈉/羧甲基微膠囊對副干酪乳桿菌生存率影響的研究

葛得龍，張鴻飛，劉 嬌，李明霞，王文博，范艷萍，鄒鵬飛，高媛媛

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東濰坊 261053；2.濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東濰坊 261053；3.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，國家企業(yè)技術(shù)中心，山東青島 266000；4.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053）

益生菌（Probiotics），被定義為“通過改善腸道微環(huán)境的平衡來有益地影響宿主健康的活微生物補(bǔ)充劑”（Trabelsi 等，2013；Li，2009），其對維持腸道微生態(tài)平衡、腸道屏障免疫功能、促進(jìn)腸道消化、吸收功能具有重要的生理意義，另外，還可用于炎癥性結(jié)腸炎（Li 等，2016），乳糖不耐癥，急性肝衰竭（Lv 等，2014）、肝硬化（Shi 等，2017）、高膽固醇血癥，免疫紊亂和癌癥（Eslami 等，2019；Fareez 等，2015）等。研究表明，益生菌可以減少金黃色葡萄球菌的定植和感染（Piewngam 等，2018）。此外，益生菌（如乳酸桿菌）作為食品添加劑可以增加仔豬的體重并改善其健康狀況，成為畜牧飼料中抗生素的替代品之一（張璐等，2008）。然而，大多數(shù)益生菌對許多食物、人胃腸道的環(huán)境（如氧氣、光照、濕度、pH 等）和儲(chǔ)存溫度等非常敏感（Izquierdo 等，2017；Celik 等，2016），存活率較低。因此，提高食品加工中益生菌活力，以抵抗不利的環(huán)境條件，目前受到越來越多的關(guān)注，具有重要的研究意義（Chavarri 等，2010）。

微膠囊（Yao 等，2017；Dorazio 等，2015）、水凝膠（Dafe 等，2017）等是提高益生菌生存率的有效方法，可以將益生菌固定在材料中，使其與外界環(huán)境隔離開，從而提高其存活率（李漫等，2014）。微膠囊的制備方法主要有冷凍噴霧干燥法（Broeckx等，2017；Ten 等，2016；Broeckx 等，2016）、擠出法（Dafe 等，2017；Rodrigues 等，2017）、乳化法、電噴霧法（Linran 等，2017；Coghetto 等，2016；Dos 等，2014）等。膠囊的壁材主要分為海藻酸鈉（Alg）、殼聚糖（Bepeyeva 等，2017）、乳清蛋白（Soukoulis 等2013；Ying 等，2010）、玉米淀粉（Mandal 等，2015）、大豆蛋白（Gonzalez 等，2018）、羧甲基纖維素及有機(jī)-無機(jī)雜化復(fù)合材料（Li 等，2017）等，在微膠囊中添加保護(hù)劑如乳糖、葡萄糖等可以進(jìn)一步提高益生菌的活力（Jofre 等，2015）。Huq 等（2017）將益生菌（鼠李乳桿菌）包裹在藻酸鹽微球（ACL-1）) 中，在微球中添加納米纖維素和卵磷脂，可以提高鼠李糖乳桿菌在胃通道和胃儲(chǔ)存過程中的生存能力。Fareez 等（2015）將植物乳桿菌LAB12 摻入殼聚糖（Ch）包被的藻酸鹽-黃原膠（Alg-XG）微膠囊中，可以時(shí)間和pH 依賴性釋放，提高了其在模擬胃液和腸液中的存活率。Singh 等（2017）以京尼平為交聯(lián)劑，將益生菌（鼠李糖乳桿菌）成功包封在羧甲基纖維素-殼聚糖微球中，具有耐熱和pH 不敏感的特性。其主要機(jī)理是富含陰離子的材料（如海藻酸鈉、羧甲基纖維素）滴入Ca2+溶液時(shí)，COO-與Ca2+發(fā)生離子交聯(lián)，瞬間固化形成具有“網(wǎng)格結(jié)構(gòu)”的凝膠（Coghetto 等，2016）。但是，這些凝膠是多孔的，孔徑約為17 nm，很難阻斷周圍環(huán)境的小分子和離子（如H 離子、消化酶等）（Yao 等，2018）。目前發(fā)展的技術(shù)如層層自組裝（Anselmo 等，2016）、填充無機(jī)納米顆粒（Cavalu 等，2017）等可以改善這一問題。

羧甲基殼聚糖是由殼聚糖改性合成（程佳兒等，2018），具有良好的水溶性、生物相容性和無毒性（Jiang 等，2015）；此外，向Alg 中加入N,O-羧甲基殼聚糖（CMCS），可以形成比Alg 凝膠更緊湊的“蛋殼”結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)镃MCS 上的COO-也參與了Ca2+的離子交聯(lián)（Mi 等，2005）。這種混合凝膠體系具有pH 響應(yīng)性（Chen 等，2004），可以運(yùn)用于胃腸道蛋白藥物的定位釋放（Yang 等，2013；Lin等，2005）。此外，該體系還可以作為傷口敷料。例如，Shi 等（2016）開發(fā)了一種羧甲基殼聚糖-海藻酸-膠原（稱為CSCM）組成的生物相容性復(fù)合微球，作為一種新型止血材料。但是，由Alg 和CMCS 包埋益生菌用于胃腸道遞送的研究鮮有報(bào)道。因此，在本研究中，以海藻酸鈉和N,O-羧甲基殼聚糖為壁材制備微膠囊，研究其對副干酪乳桿菌活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 海藻酸鈉和氯化鈣均購自國藥集團(tuán)；N,O-羧甲基殼聚糖購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MRS 肉湯、MRS 培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司）、數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（HPX-9272 MBE 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、高速冷凍心機(jī)（賽默飛公司）、潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）和渦旋機(jī)（VORTEXKylin-bell5）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 副干酪乳桿菌生長曲線的測定 取少量副干酪乳桿菌凍干粉接種于無菌MRS 肉湯中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3 次，1%接種量再次培養(yǎng)，每隔2 h 測定菌懸液的吸光度（OD600）。

1.2.2 靜電液滴法微膠囊的制備 副干酪乳桿菌過夜培養(yǎng)24 h 后，離心（4 ℃，4000 r/min，10 min）收集，洗滌3 次，5 mL 生理鹽水重懸。與45 mL 的1.5%（wt%）海藻酸鈉及1%葡萄糖凝膠溶液充分混合，使用靜電紡絲設(shè)備將混合液噴入0.2 moL 的氯化鈣溶液中，硬化30 min 后過濾洗滌，轉(zhuǎn)移至1.5% CMCS 溶液中，繼續(xù)交聯(lián)10 min 后過濾洗滌，0.2 moL 的氯化鈣溶液中，硬化30 min。將樣品在-80 ℃中預(yù)凍過夜，在冷凍干燥機(jī)中凍干24 h。

1.2.3 傳統(tǒng)擠出法微膠囊的制備 副干酪乳桿菌過夜培養(yǎng)24 h 后，離心（4 ℃，4000 r/min，10 min）收集，洗滌3 次，5 mL 生理鹽水重懸。與45 mL 1.5%（wt%）海藻酸鈉、1%葡萄糖、1.5%的CMCS溶液凝膠溶液充分混合，使用靜電紡絲設(shè)備將混合液噴入0.2 moL 的氯化鈣溶液中，硬化30 min后過濾洗滌。將樣品在-80 ℃中預(yù)凍過夜，冷凍干燥機(jī)凍干。

1.2.4 微膠囊包埋產(chǎn)率的測定 稱取0.1 g 微膠囊置于9 mL 磷酸鹽緩沖液中，37 ℃恒溫振蕩，微膠囊溶解并釋放包埋的干酪乳桿菌，過一系列10倍梯度稀釋后，取合適稀釋度的菌懸液于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃下厭氧培養(yǎng)48 h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。相應(yīng)微膠囊的包埋產(chǎn)率計(jì)算公式如下：

包埋產(chǎn)率/%=微膠囊中活菌數(shù)量/最初加入的活菌數(shù)量。

1.2.5 紅外波譜（FTIR）分析測定 采用傳統(tǒng)的固體溴化鉀壓片法。簡而言之，取出適量的溴化鉀粉末置于60 ℃烘箱中過夜烘干。取凍干的1 mg微膠囊和100 mg 溴化鉀晶體，將溴化鉀倒入研缽中充分研磨至粉末并放入紅外干燥箱中充分干燥。然后加入壓片磨具并用千斤頂制備成透明的溴化鉀片。先將空白溴化鉀壓片的紅外結(jié)果選為背景，樣品的紅外光譜就自動(dòng)扣除了溴化鉀紅外光譜的影響。波譜測量范圍為4000～450 cm，每次測量結(jié)果為16 次測量結(jié)果平均值。

1.2.6 模擬液的配制 人工模擬胃液（SGF）：用濃鹽酸將0.2%（m/V）NaCl 溶液pH 調(diào)至2.0，加入定量的胃蛋白酶并使其最終濃度為3.0 g/L，最后0.22 μm 的膜過濾除菌。

人工模擬腸液（SIF）：將胰蛋白酶和膽鹽均勻分散于磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，NaH2PO4，pH 7.0）中，使其最終濃度分別為1.0 g/L 和4.5 g/L，用0.1 mol/L 的NaOH 將溶液pH 調(diào)至7.4，最后用0.22 μm 的膜過濾除菌。

1.2.7 微球在模擬胃腸液中的存活試驗(yàn) 稱取0.1 g 濕微膠囊置于9 mL 人工胃液中，37 ℃、100 r/min的水浴搖床中振蕩溫育，分別于0、5、30、60、120 min時(shí)離心收集微球，無菌水洗滌后在9 mL 10%檸檬酸鈉溶液中溶解，當(dāng)稀釋后采用涂布平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)以0.1 mL 未微膠囊化的副干酪乳桿菌懸液作對照試驗(yàn)。

1.2.8 在連續(xù)的模擬胃腸液中的存活試驗(yàn) 稱取0.1 g 濕微膠囊，置于9 mL 人工胃液中，37 ℃、100 r/min 的水浴搖床中振蕩溫育1 h 后，離心收集微球，生理鹽水洗滌后加入9 mL 人工腸液，60 min和120 min 時(shí)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)以1 mL 未微膠囊化的桿菌懸液作對照試驗(yàn)。

1.2.9 長期儲(chǔ)存試驗(yàn) 游離細(xì)菌和包裹在生理鹽水中的細(xì)菌微膠囊在4 ℃中保存4 周，模擬長期儲(chǔ)存的水基商業(yè)產(chǎn)品。每周采用平板計(jì)數(shù)法檢測細(xì)菌活力；將1 g 微球懸浮于9 mL 10%檸檬酸鈉水溶液中，使微膠囊溶解。連續(xù)稀釋48 h，MRS 瓊脂平板計(jì)數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 每組試驗(yàn)做3 個(gè)平行，運(yùn)用Graph Pad 8.0.2 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理，并用軟件中ANOVA 分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P ＜0.05 和P ＜0.01 作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)，P ＞0.05 作為無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 副干酪乳桿菌生長曲線的測定 副干酪乳桿菌的生長曲線如圖1 所示。在6 h 左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期，12 h 左右增殖最快；在16 h 左右，進(jìn)入平臺(tái)期；這與益生菌自身的生長習(xí)性相關(guān)。

圖1 副干酪乳桿菌的生長曲線

2.2 微膠囊性能評價(jià)

2.2.1 微膠囊平均粒徑 如表1 所示，傳統(tǒng)滴注法制備的不同配比的微膠囊（AC-1、AC-2、AC-3）的平均粒徑分別為（2.30±0.08）mm、（2.39±0.09）mm 和（2.56±0.08）mm，粒徑無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而采用靜電液滴方法制備的微膠囊，平均粒徑為（1.03±0.09）mm，與傳統(tǒng)滴注法相比，平均粒徑較小，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.01）；但制備工藝較復(fù)雜，耗時(shí)較長。造成這種粒徑大小顯著性差異的原因主要是靜電液滴法中施加的電荷降低了聚合物液滴的表面張力，使其在重力的作用下產(chǎn)生的液滴更小。

2.2.2 微膠囊包埋產(chǎn)率 如表1 所示，傳統(tǒng)滴注法制備的配比為1∶1 的微膠囊的包埋產(chǎn)率為（92.37±2.74）%,與同為傳統(tǒng)滴注法制備的AC-1 和AC-3微膠囊相比，包埋產(chǎn)率分別提高了38.42%和39.58%，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.01）；而與采用靜電液滴法制備的E-AC 微膠囊相比，包埋產(chǎn)率僅提高了0.17%，無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。

表1 不同配比的微膠囊平均粒徑和包埋產(chǎn)率

2.2.3 FTIR 測定 對Alg 和CMCS 的單分子生物材料（圖2A 和圖2B)，強(qiáng)吸收帶和寬吸收帶分別代表波長3481 cm 和3363 cm 附近的峰，這是由于-OH 的伸縮和強(qiáng)不對稱吸收引起的。在波長1616 cm 和1596 cm 附近存在羧酸陰離子，在波長1029 cm 和1310 cm 處存在C-O-C 伸縮振動(dòng)，這是天然多糖Alg 的固有特性。微膠囊在波長2928 cm 和2962 cm 處顯示出雙峰（圖2C 和圖2D）。這是由于CH3-和CH2-基團(tuán)的不對稱伸縮振動(dòng)造成的。這些峰歸因于脂肪酸中存在的典型官能團(tuán)，它們是細(xì)胞膜成分的一部分，這表明益生菌被包封在微膠囊中。

圖2 FTIR 結(jié)果

2.2.4 微膠囊表面形態(tài) 圖3 分別為SEM 捕獲的凍干E-AC 和AC-2 珠微膠囊的珠狀結(jié)構(gòu)和表面形貌。所有配方的微膠囊表明存在明顯褶皺，形狀不規(guī)則。E-AC 為長梭形珠狀結(jié)構(gòu)，而AC-2 為珠狀結(jié)構(gòu)。這種不均勻性反映了表面聚合物濃度較高；特別是外層CMCS，在冷凍干燥過程除水后表現(xiàn)出更高的收縮率。表面形貌觀察表明，微膠囊表面光滑、致密。SEM 圖像顯示，細(xì)菌并沒有出現(xiàn)在表面，這說明它們被包埋在了基質(zhì)中。無孔的致密表面提供了更強(qiáng)的物理屏障，阻止SJF 在通過腸道時(shí)擴(kuò)散，從而保護(hù)細(xì)菌不從被包裹的基質(zhì)中逃逸。細(xì)菌表面呈桿狀結(jié)構(gòu)，表明細(xì)胞均勻分布在材料基質(zhì)表面，直至珠子的核心。

圖3 SEM 結(jié)果

2.2.5 微膠囊抗酶降解試驗(yàn) E-AC 微膠囊在人工模擬胃液SGF（加入胃蛋白酶）中的結(jié)果顯示，E-AC 在0、30、60 min 和120 min 內(nèi)形態(tài)呈珠狀，未發(fā)生明顯變化，表明微膠囊有pH 敏感性和抗酶降解性。

2.2.6 微膠囊胃腸道模擬試驗(yàn) 益生菌在經(jīng)過人胃腸道時(shí)，有相當(dāng)一部分損失；因此，在模擬胃腸道條件下研究了包埋對細(xì)胞存活率的影響。將游離和包裹的益生菌暴露在模擬的胃和腸道環(huán)境中，以評估其存活率。由圖4 可知，游離的益生菌在1 h 內(nèi)損失了3 log10cfu/mL，而2 h 時(shí)損失了7 log10cfu/mL，而微膠囊E-AC 在2 h 時(shí)仍有8.4 log10cfu/mL。說明微膠囊對胃酸的耐受性明顯高于游離益生菌，這主要是由于CMCS 和Alg 形成了更加致密的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，有利的保護(hù)了益生菌免受外界不利環(huán)境的殺傷。在進(jìn)入SIF 溶液后，未檢測到游離益生菌，微膠囊依然有7.58 log10cfu/mL的存活率，存在顯著性差異。說明益生菌對堿性環(huán)境不耐受，而微膠囊化可以明顯提高益生菌的存活率。

圖4 微膠囊胃腸道模擬試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 長期儲(chǔ)存性試驗(yàn) 微膠囊在4 ℃的生理鹽水中保存4 周，以模擬長期存儲(chǔ)條件。由圖5 可知，4 周后，游離的益生菌減少了4.5 log10cfu/mL，而在儲(chǔ)存過程中，微膠囊化的益生菌下降了2.9 log10cfu/mL。結(jié)果表明，在長期儲(chǔ)存過程中，微膠囊化在一定程度上對于提高益生菌的存活率非常有效。

圖5 微膠囊長期儲(chǔ)存試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

綜上所述，靜電液滴法制備的微膠囊粒徑比傳統(tǒng)滴注法較小，在提高益生菌長時(shí)間儲(chǔ)存和胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的生存能力方面具有很大的優(yōu)勢?？梢酝茰y，Alg 和CMCS 交聯(lián)形成的緊湊的“蛋殼”結(jié)構(gòu)和pH 敏感性提高了益生菌的生存能力。因此，本研究開發(fā)的微膠囊有望用于功能性食品和藥品中敏感益生菌的封裝和傳遞。