響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2 萃取紅豆草縮合單寧工藝技術(shù)研究

袁英良，唐 丹，魯 英，何建國，李成云，冉桂霞

（1.吉林省白城市畜牧科學(xué)研究院，吉林白城 137000；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；3.吉林省白城市洮北區(qū)畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，吉林白城 137000）

縮合單寧是一種多酚類化合物，存在于植物中。在反芻動物飼養(yǎng)中，縮合單寧作為純天然飼料添加劑被廣泛研究。研究表明，縮合單寧作為過瘤胃蛋白保護劑，具有提高動物對氮的吸收利用率，提高動物生產(chǎn)性能，預(yù)防瘤胃脹氣及寄生蟲病等作用（劉秀麗，2016）。紅豆草是優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，畝產(chǎn)可以達(dá)到4～5 t，因為其含有單寧，所以經(jīng)常與苜蓿草進行混合播種，可以預(yù)防動物瘤胃脹氣的發(fā)生（Huang，2018）。紅豆草的單寧酸含量為2.5%～3.5%，其縮合單寧含量占總單寧的79%，是牧草中含量最高的（袁英良，2010）。因此研究紅豆草中縮合單寧的提取工藝并增加提取率具有重要意義。

超臨界CO2流體萃取技術(shù)是現(xiàn)今工業(yè)中的主要提取技術(shù)，具有無污染、無殘留、提取率高的特點，已被廣泛應(yīng)用到食品、油脂、化學(xué)、包裝、中草藥、茶葉等領(lǐng)域（Zaniol，2020；Soumya，2017）。目前，提取縮合單寧的方式較多，但超臨界CO2萃取縮合單寧的相關(guān)報道較少。響應(yīng)面試驗設(shè)計是通過構(gòu)建二次回歸模型，研究各因素及水平間的關(guān)系對響應(yīng)值的關(guān)聯(lián)性，并通過優(yōu)化處理可得出試驗因素水平之外的最佳工藝，結(jié)果科學(xué)準(zhǔn)確、快速便捷，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到各領(lǐng)域試驗中（宋振康，2021；Roriz，2017）?？s合單寧的過瘤胃保護作用已經(jīng)被充分證實，但是其提取工藝及效果還有待繼續(xù)研究。本試驗采用超臨界CO2萃取技術(shù)手段，應(yīng)用Box-Behnken 試驗設(shè)計進行工藝優(yōu)化，以提高紅豆草縮合單寧的提取率，為縮合單寧添加劑研發(fā)及紅豆草應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 紅豆草由白城市畜牧科學(xué)研究院草地所種植基地提供，均在盛花期進行刈割。

1.2 試驗儀器 Tlyon005150 超臨界萃取儀（瑞士sitec 公司）；F160 型粉碎機（日本島津）；C1-6735-01 型精密電子天平（日本島津）；TU-1910紫外可見光分光光度計（北京普析）；TGL-10C 高速離心機（上海安亭）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程 紅豆草→烘干→粉碎→稱重→超臨界CO2萃取→分離→提取液。

1.3.2 單因素試驗 稱取一定量的紅豆草粉，應(yīng)用超臨界CO2萃取工藝，分別改變提取過程中的萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、夾帶劑種類、夾帶劑流量，提取縮合單寧，應(yīng)用紫外可見分光光度計測定縮合單寧含量，計算提取率。

1.3.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計 參照單因素的試驗結(jié)果，選擇萃取壓力、萃取時間、萃取溫度、夾帶劑流量四因素為考察因子，用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計，然后采用二次多元回歸方程擬合優(yōu)化，最終選出最佳工藝，并記錄縮合單寧的提取率理論值。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

1.3.4 驗證試驗 將應(yīng)用響應(yīng)面試驗優(yōu)化后選擇的超臨界CO2萃取縮合單寧的最佳工藝按照實際操作情況進行調(diào)整，重復(fù)三次試驗計算縮合單寧提取率平均值，與縮合單寧提取率的理論值進行比較，分析顯著性。

1.4 統(tǒng)計分析 用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)整理，應(yīng)用Design-Expert 11 軟件進行響應(yīng)曲面試驗設(shè)計與結(jié)果分析并進行工藝優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 夾帶劑的選擇 本試驗首先對萃取的夾帶劑進行篩選，因為縮合單寧具有極性，所以選用極性溶劑作為夾帶劑，由圖1 可知，使用95%甲醇、95%乙醇、95%乙酸乙酯作為夾帶劑依次分別較50%甲醇、50%乙醇、50%乙酸乙酯的提取效果好，其中50%乙酸乙酯、95%乙酸乙酯的提取效率最高，綜合考慮夾帶劑對縮合單寧的提取率和成本影響因素，確定50%乙酸乙酯為夾帶劑。

圖1 夾帶劑種類對縮合單寧提取率的影響

2.1.2 夾帶劑流量對提取率的影響 由圖2 可知，夾帶劑的流量增大時，縮合單寧的提取率有所提高，但當(dāng)夾帶劑流量達(dá)到3.0 mL/min 時，縮合單寧的提取率開始下降，這可能是因為夾帶劑的流量過快，造成流體中被萃取的縮合單寧被帶出，造成提取率降低（劉嘉坤，2017）。但是夾帶劑流量在2～3.5 mL/min 內(nèi)差異不顯著（P ＞0.05）?？紤]到成本問題，選擇最佳的夾帶劑流量為2.0 mL/min。

圖2 夾帶劑流量對縮合單寧提取率的影響

2.1.3 萃取壓力對提取率的影響 由圖3 可知，當(dāng)萃取壓力在35 MPa 時縮合單寧的提取率最高，較25 MPa 時，提高17.65%，這可能是因為壓力的增加，提高了被提取物質(zhì)的析出能力。本試驗選擇萃取壓力為35 MPa。

圖3 萃取壓力對縮合單寧提取率的影響

2.1.4 萃取溫度對提取率的影響 萃取溫度是保證夾帶劑流動能力和有效成分分離的重要參數(shù)。由圖4 可知，在溫度超過40 ℃后，縮合單寧提取率出現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為在溫度超過40 ℃時，超臨界流體中攜帶的縮合單寧不能完全析出，造成提取率降低。綜合考慮，溫度對萃取機械的使用壽命和耗能等因素，萃取溫度選擇40 ℃較好。

圖4 萃取溫度對縮合單寧提取率的影響

2.1.5 萃取時間對提取率的影響 萃取時間是保證有效成分被充分溶解并提取的重要指標(biāo)（Huang，2019）。由圖5 可知，隨著萃取時間增加，縮合單寧提取率呈先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢，在120 min 時，提取率增加速度減小，提取率開始降低，這說明在120 min 后，雖然流體萃取劑能夠較好地與樣品接觸并滲入樣品中，但萃取時間過長反而會促使縮合單寧結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所以提取效率不高（張建，2010）。在工業(yè)化生產(chǎn)中，時間直接影響到工作效率，所以最佳萃取時間確定為120 min。

圖5 萃取時間對縮合單寧提取率的影響

2.2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計與優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果及回歸模型 按照表2 的試驗方案進行試驗后，對數(shù)據(jù)進行回歸模型擬合，使用縮合單寧的提取率（Y）作為響應(yīng)值，其對萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、夾帶劑流量的回歸方程為：Y=89.14+0.96A-0.74B+2.03C+1.10D+4.08AB-0.50AC+AD-4.47BC-0.53BD-2.93CD-6.71 A2-11.96B2-10.17C2-12.05D2。結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 回歸模型系數(shù)方差分析 由表3 可知，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著水平（P ＜0.00001），失逆項結(jié)果不顯著（P ＞0.05），表明試驗結(jié)果沒有異常,可用于超臨界CO2提取紅豆草縮合單寧提取率的分析和預(yù)測。方程二次項CD 達(dá)到了顯著水平（P ＜0.05）；方程一次項C，二次項A2，B2，C2，D2及二次項AB，BC 達(dá)到了極顯著水平（P ＜0.00001），表明AB，BC 項有交互作用。

2.2.3 因素間交互作用 圖6～圖8 為兩個因素對縮合單寧提取率的響應(yīng)面及交互作用等高線圖。響應(yīng)面曲線越陡峭或等高線接近橢圓形表明兩個因素的交互作用越顯著（王婉愉，2018）。由圖可以看出，萃取溫度與萃取壓力、萃取壓力與萃取時間、萃取時間與夾帶劑流量形成的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，等高線為橢圓形，表明萃取溫度與萃取壓力、萃取壓力與萃取時間、萃取時間與夾帶劑流量兩兩相互作用對縮合單寧的提取率有較大影響，與表3 結(jié)果一致。這可能是由于當(dāng)萃取溫度、萃取時間、萃取壓力及夾帶劑流量達(dá)到相對較高程度時，溶解度下降，致使縮合單寧的提取率下降（李金鳳，2020）。

表3 響應(yīng)面模型方差分析及回歸方程系數(shù)顯著檢驗

圖6 萃取溫度及萃取壓力影響紅豆草縮合單寧提取率的響應(yīng)曲面及等高線

圖7 萃取壓力及萃取時間影響紅豆草縮合單寧提取率的響應(yīng)曲面及等高線

2.2.4 最佳工藝優(yōu)化及驗證試驗 通過響應(yīng)面的優(yōu)化，得出縮合單寧提取率最佳工藝條件為：萃取溫度40.27 ℃、萃取時間123.09 min、萃取壓力34.79 MPa、夾帶劑流量2.02 mL/min，縮合單寧提取率的理論值為89.31%。根據(jù)實際操作情況，將最佳工藝進行修整改為：萃取溫度40.3 ℃、萃取時間123 min、萃取壓力34.8 MPa、夾帶劑流量2 mL/min，經(jīng)過驗證試驗，得到縮合單寧平均提取率為（89.23±0.0043）%，試驗值與理論值沒有顯著差異。

3 討論

超臨界CO2萃取對不同極性物質(zhì)都有較好的萃取能力。在萃取過程中添加夾帶劑可以改變萃取時流體的極性，適宜的夾帶劑具有提高有效成分流動速度和溶解率的能力（Diaz，2005）?？s合單寧是強極性物質(zhì)，添加適宜的夾帶劑可以提高縮合單寧提取率。王春雨（2019）對超臨界流體有機溶劑進行研究，證實了溶液中有機溶劑殘留率低，可以保證提取物的純度，采用相同極性的有機溶劑能夠提高有效成分提取率。劉雯等（2017）研究表明，夾帶劑的加入量及流速分別為100～400 mL 及5～20 mL/min 時對銀杏葉中總黃酮醇苷的提取率影響不顯著（P ＞0.05）。這與本試驗結(jié)果相似。萃取壓力在萃取過程中直接影響被提取物的溶解程度，還可以增加CO2的濃度及夾帶劑的濃度，使物質(zhì)間的接觸頻率增加，最終影響被提取物的提取效率。段蕾等（2020）在油莎豆油提取的研究中表明,萃取壓力影響超臨界流體密度，同時過大的壓力會對設(shè)備有損害，所以萃取壓力不宜過大。萃取溫度是紅豆草縮合單寧提取率的限制參數(shù)，宋金慧（2014）在對葡萄加工剩余物的有效成分進行提取中，驗證了適當(dāng)增加萃取溫度對提取物的分離具有重要影響。姜萍等（2005）在單寧酸提取中發(fā)現(xiàn)，溫度過高會直接降低單寧酸的提取率。本試驗優(yōu)選了提取率，并考慮工藝中的成本因素，確定最佳的萃取溫度。萃取時間影響著縮合單寧的提取率，當(dāng)萃取時間超過臨界點后，縮合單寧的提取率差異不顯著。張學(xué)彬等（2021）在超臨界CO2萃取辣椒紅色素的工藝研究中也得出類似結(jié)論。響應(yīng)曲面優(yōu)化工藝被廣泛應(yīng)用到酚類物質(zhì)的提取中，Ghafoor 等（2010）在多酚類物質(zhì)的提取上應(yīng)用了響應(yīng)面曲面法優(yōu)化工藝，使總酚提取率達(dá)到2.156 mg/100 mL。

4 結(jié)論

通過響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果優(yōu)化，超臨界CO2萃取紅豆草縮合單寧的工藝參數(shù)為：萃取壓力34.8 MPa、萃取時間123.0 min、萃取溫度40.3 ℃、萃取夾帶劑流量2.0 mL/min、夾帶劑50%乙酸乙酯，在此條件下，紅豆草縮合單寧提取率達(dá)到89.23%。