正交試驗(yàn)優(yōu)選四時(shí)青總黃酮提取工藝

章燁雯，呂其壯，陳 榮，樊燕萍，臧青民

（玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林 537000）

四時(shí)青又名云實(shí)葉，為豆科云實(shí)屬植物云實(shí)的干燥葉片（魏小華，2012），具有清熱解毒，祛瘀止痛等功效，也可在一定程度上維持動(dòng)物體內(nèi)的代謝平衡，防治疾病，目前已有研究將其作為飼料添加劑使用（王文輝等，2017；田志超等，2012）。四時(shí)青化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要含有萜類、黃酮類及生物堿等，其中高異黃酮和卡薩烷二萜類為特征性成分（Yuben 等，2018）。黃酮類化合物作為普遍存在于植物中的一類成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等生物活性（吳兆華等，2007）；另外，其作為飼料添加劑能促進(jìn)動(dòng)物健康育肥，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，同時(shí)提高肉類品質(zhì)（馮香安等，2011）。目前對(duì)于四時(shí)青的研究主要集中在化學(xué)成分和生物活性上（李昌勤等，2016；李茂星等，2002），但對(duì)其黃酮類成分提取工藝的研究鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在參考相關(guān)植物總黃酮提取工藝的基礎(chǔ)上（唐春偉等，2019），采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)，研究四時(shí)青總黃酮的最佳提取工藝，以期為進(jìn)一步開發(fā)四時(shí)青提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 電子天平（JA2003，舜宇恒平）；新型密封式粉碎機(jī)（雷邁）；數(shù)碼超聲波清洗器（KQ-500DV，昆山）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，國華）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A，亞榮）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III，長城科工貿(mào)）；紫外可見分光光度計(jì)（A360，翱藝）。

四時(shí)青采摘于廣西南寧上林縣的一丘陵地，經(jīng)鑒別為豆科，云實(shí)屬植物云實(shí)的葉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，置于100 mL 量瓶中，用60%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 置100 mL 容量瓶，添加60%乙醇至25 mL；分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10% 硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4% 氫氧化鈉溶液20 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12 min。用紫外分光光度計(jì)（λ=510 nm）測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值，以濃度（C)為橫坐標(biāo)、吸光度（A)為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（黃明堦等，2009）。

1.2.2 四時(shí)青總黃酮提取率的測定 根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的質(zhì)量濃度，提取率按下式計(jì)算：

式中：C 為四時(shí)青總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數(shù)；V 為樣品液體積，mL；M 為樣品質(zhì)量，g；T 為四時(shí)青總黃酮的提取率，%。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 以四時(shí)青總黃酮的提取率為指標(biāo)，分別設(shè)置乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、提取時(shí)間（15、30、45、60、75min）和溶劑倍量（5、10、15、20、25）為考察因素和水平，篩選出影響四時(shí)青總黃酮提取的較優(yōu)水平。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以四時(shí)青總黃酮的提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 20.0 軟件對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=11.864x-0.0019（R2=0.9994），結(jié)果見圖1。表明蘆丁在0.004～0.040 mg/mL 與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響乙醇作為一種常用的綠色溶劑，可以滿足不同類別成分的提取需要，滲透力強(qiáng)。如果乙醇的濃度過小容易導(dǎo)致水溶性雜質(zhì)的溶出，如果過大容易導(dǎo)致色素、樹脂等脂溶性雜質(zhì)的溶出。本單因素試驗(yàn)固定溶劑倍量15、提取時(shí)間60 min，研究系列乙醇濃度對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的升高，四時(shí)青總黃酮的提取率增大，但當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，由于四時(shí)青中葉綠素、苷元等雜質(zhì)的溶出量增加，從而影響總黃酮的提取。

圖2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響提取過程的完成需要一定的時(shí)間，即有效成分溶出、擴(kuò)散達(dá)到平衡的時(shí)間。時(shí)間太短，有效成分浸出不完全，時(shí)間太長，造成浪費(fèi)，導(dǎo)致無效成分和雜質(zhì)溶出增加，甚至使有效成分降解失活。本單因素試驗(yàn)固定溶劑倍量15，乙醇濃度60%，研究不同提取時(shí)間對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。隨著提取時(shí)間的增加，四時(shí)青總黃酮的提取率增大，但當(dāng)提取時(shí)間超過60 min 時(shí)，由于四時(shí)青中其他化合物也會(huì)溶出，從而影響總黃酮的提取。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.2.3 溶劑倍量對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響溶劑用量的加大，有效成分可以充分?jǐn)U散，但用量過大也會(huì)給后續(xù)工藝操作帶來不便。本單因素試驗(yàn)固定提取時(shí)間60 min，乙醇濃度60%，研究不同溶劑倍量對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。隨著溶劑倍量的增加四時(shí)青總黃酮的提取率增大，但當(dāng)溶劑倍量大于10 時(shí)，總黃酮溶出不再增加。

圖4 溶劑倍量對(duì)提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析結(jié)果見表2。由極差分析可知，溶劑倍量和乙醇濃度對(duì)四時(shí)青總黃酮提取影響較大，各因素主次順序?yàn)椋喝軇┍读浚疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間，較優(yōu)提取工藝為A2B2C2。

表2 四時(shí)青總黃酮正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 方差分析 由表3 可知，B、C 對(duì)總黃酮提取率影響顯著（P ＜0.05），A 對(duì)總黃酮提取率影響不顯著（P ＞0.05），影響四時(shí)青總黃酮提取率的主次因素為C ＞B ＞A，與表2 中分析結(jié)果相同。因此四時(shí)青總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間60 min，乙醇濃度60%，溶劑倍量10 倍。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

2.3.3 提取條件的驗(yàn)證 為驗(yàn)證工藝的的準(zhǔn)確性和合理性，按上述最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，平行操作3 份，分別測定吸光度值，計(jì)算總黃酮提取率。結(jié)果顯示，最優(yōu)工藝下，四時(shí)青總黃酮平均提取率為23.82%，RSD 為1.64%，說明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.4 提取次數(shù)的確定 由于提取次數(shù)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果影響較大，因此在篩選出最佳條件后對(duì)其單獨(dú)考察。按正交試驗(yàn)確定的工藝提取四時(shí)青，平行操作3 份，每份分別提取2 次，2 次的提取液分別單獨(dú)處理，測定總黃酮的提取率，結(jié)果見表4。提取2 次與提取1 次相比，總黃酮提取率僅增加了3.04%，結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)成本，四時(shí)青總黃酮的提取次數(shù)確定為1 次。

表4 四時(shí)青總黃酮提取次數(shù)考察%

3 結(jié)論

由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素中溶劑倍量對(duì)四時(shí)青總黃酮提取率影響最大，其次是乙醇濃度，對(duì)提取率影響最小的是提取時(shí)間。得到四時(shí)青總黃酮最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間60 min，乙醇濃度60%，溶劑倍量10 倍，此條件下總黃酮提取率為23.82%，RSD 為1.64%，表明該提取工藝條件穩(wěn)定、可行。