紫癜性腎炎患兒血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的關(guān)系研究

謝宇飛，馬彩霞，楊麗萍

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院兒科，上海 201700

紫癜性腎炎(Henoch schonlein purpura nephritis，HSPN)屬于過敏性紫癜(Henoch schonlein purpura，HSP)患者較為嚴(yán)重的一種并發(fā)癥，亦是臨床發(fā)病率較高的一種繼發(fā)性腎臟疾病[1]。若不及時(shí)給予治療，則可能導(dǎo)致患者的腎臟產(chǎn)生明顯的損傷，進(jìn)而危及身體健康[2]，因此，早期準(zhǔn)確診斷HSPN顯得尤為重要，亦是提高臨床治療效果以及改善預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。有研究報(bào)道表明[3]，B淋巴細(xì)胞活化因子(B lymphocyte activating factor，BAFF)介導(dǎo)多種自身免疫類病癥的發(fā)生、發(fā)展過程，但關(guān)于其是否介導(dǎo)了HSPN的發(fā)生、發(fā)展以及免疫功能調(diào)節(jié)過程的研究并不多見。中期因子(Midkine，MK)主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，亦可表達(dá)于部分器官黏膜上皮細(xì)胞中，在正常生理狀態(tài)下微量表達(dá)，而在病理?xiàng)l件下可能出現(xiàn)高表達(dá)，可能具有促進(jìn)炎癥因子釋放、刺激血管生產(chǎn)以及促進(jìn)腫瘤進(jìn)展等作用[4]。Th17細(xì)胞是近年來免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，其和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間的平衡被打破是目前臨床上公認(rèn)的自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵[5]。鑒于此，本文通過研究HSPN患兒血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的關(guān)系，旨在為臨床HSPN的診治提供新的靶點(diǎn)與思路，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 將復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院兒科2017年1月至2020年1月收治的71例HSPN患兒作為研究組。其中男性37例，女性34例；年齡4～11歲，平均(7.42±1.34)歲。另取同期我院收治的70例HSP患兒作為HSP組，其中男性38例，女性32例；年齡4～12歲，平均(7.51±1.31)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HSP患兒均符合《兒童過敏性紫癜循證診治建議》[6]中的有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)HSPN患兒均符合《紫癜性腎炎診治循證指南》[7]中的有關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)納入研究前尚未接受相關(guān)治療；(4)患兒家長或其監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他原發(fā)或是繼發(fā)型腎臟類疾病者；(2)合并感染性疾病，免疫功能異常者；(3)研究前1個(gè)月已實(shí)施免疫抑制劑或是糖皮質(zhì)激素類藥物治療者。另選取同期于我院體檢的70例健康志愿兒童作為對(duì)照組。其中男性35例，女性35例；年齡4～11歲，平均(7.47±1.35)歲。三組受檢者的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法 (1)血清BAFF、MK水平：分別于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集所有受試者的靜脈血6 mL，2 330 r/min離心10 min處理，獲取血清分成兩份置于冰箱中保存?zhèn)溆?，其中一份采用酶?lián)免疫吸附法檢測(cè)血清BAFF、MK水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒(分別購自美國R&D公司以及eBioscience公司)說明書完成。(2)腎損傷指標(biāo)：采用7060型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腎損傷指標(biāo)，包括尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿β微球蛋白、尿素氮以及肌酐，具體操作遵循儀器說明書進(jìn)行。(3)Th17細(xì)胞比例：首先采集血液樣本，以肝素鋰進(jìn)行抗凝，同時(shí)予以RPM1 1640稀釋，加入20μL的離子霉素、25μL的PMA、4μL的佛波酯，置于37℃條件下進(jìn)行時(shí)長為240～360 min的孵育。隨后將其均勻分作兩管，一管加入CD3-PerCP，另一管加入CD8-FITC，室溫條件下予以15 min的孵育，加入100μL的固定液，室溫下避光靜置15 min。隨后分別于兩管中加入IgG1-PE以及IL-17-PE，室溫條件下靜置15 min。采用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)洗滌、重懸后以流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)。(4)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例：通過Ficoll分離液采集外周血PBMCs，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，加入10μL的CD4-FTTC以及CD25-APC抗體，放置在4℃條件下進(jìn)行時(shí)長為20min的孵育，采用PBS洗滌，并加入400μL的固定/穿膜液，放置在室溫條件下靜置40 min。再經(jīng)PBS洗滌，加入800μL的緩沖液，放置在室溫條件下靜置20 min。重懸處理后均勻分作兩管，一管加入F0XO3-PE抗體，另一管加入對(duì)照抗體，放置在室溫條件下孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌及重懸之后通過流式細(xì)胞儀完成測(cè)定。(5)Th17細(xì)胞相關(guān)因子水平：另一份血清樣本采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)以及白細(xì)胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)水平，上述操作遵循試劑盒(購自深圳晶美生物科技有限公司)說明書完成。

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組受試者的血清BAFF、MK水平，腎損傷相關(guān)指標(biāo)，Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及Th17細(xì)胞相關(guān)因子水平，分析血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受檢者的血清BAFF、MK水平比較 研究組患兒的血清BAFF水平明顯低于HSP組和對(duì)照組，而血清MK水平明顯高于HSP組和對(duì)照組，其中HSP組患兒的血清MK水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但HSP組患兒的血清BAFF水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組受檢者的血清BAFF、MK水平比較(±s)

表1 三組受檢者的血清BAFF、MK水平比較(±s)

注：與對(duì)照組比較，a P<0.05；與HSP組比較，b P<0.05。

組別研究組HSP組對(duì)照組F值P值例數(shù)71 70 70 BAFF(μg/L)0.65±0.20ab 1.27±0.44 1.28±0.45 16.203 0.001 MK(pg/mL)314.22±80.14ab 176.12±48.91a 101.32±40.36 20.585 0.001

2.2 三組受檢者的腎損傷指標(biāo)水平比較 研究組患兒的尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白及尿β微球蛋白水平明顯高于HSP組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而HSP組患兒的尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白及尿β微球蛋白水平分別與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組受檢者的尿素氮及肌酐水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組受檢者的腎損傷指標(biāo)水平比較(±s)

表2 三組受檢者的腎損傷指標(biāo)水平比較(±s)

注：與對(duì)照組比較，a P<0.05；與HSP組比較，b P<0.05。

組別研究組HSP組對(duì)照組F值P值例數(shù)71 70 70尿微量白蛋白(mg/dL)17.37±3.25ab 0.78±0.21 0.72±0.25 22.195 0.001尿轉(zhuǎn)鐵蛋白(mg/dL)1.27±0.34ab 0.18±0.05 0.17±0.02 22.451 0.001尿β微球蛋白(mg/L)0.45±0.08ab 0.22±0.03 0.21±0.04 21.344 0.001尿素氮(μmol/L)3.71±0.68 3.72±0.69 3.66±0.52 1.305 0.734肌酐(mmol/L)30.42±7.33 29.45±7.05 28.47±7.11 1.592 0.721

2.3 三組受檢者的Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及血清IL-6、IL-17水平比較 研究組患兒的Th17細(xì)胞比例及血清IL-6、IL-17水平明顯高于HSP組，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯低于HSP組，且HSP組Th17細(xì)胞比例及血清IL-6、IL-17水平明顯高于對(duì)照組，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組受檢者Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及血清IL-6、IL-17水平比較(±s)

表3 三組受檢者Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及血清IL-6、IL-17水平比較(±s)

注：與對(duì)照組比較，a P<0.05；與HSP組比較，b P<0.05。

組別研究組HSP組對(duì)照組F值P值例數(shù)71 70 70 Th17細(xì)胞比例(%)1.56±0.35ab 0.68±0.14a 0.52±0.11 25.233 0.001調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例(%)2.51±0.52ab 6.31±1.37a 7.91±1.44 17.195 0.001 IL-6(pg/mL)21.45±5.11ab 14.72±3.10a 10.44±2.09 12.290 0.001 IL-17(ng/L)91.56±20.15ab 45.10±14.56a 20.62±3.92 14.106 0.001

2.4 血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示：血清BAFF與Th17細(xì)胞比例、尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿β微球蛋白及血清IL-6、IL-17均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例呈正相關(guān)(P<0.05)；血清MK與Th17細(xì)胞比例、尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿β微球蛋白及血清IL-6、IL-17均呈正相關(guān)(P<0.05)，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡的相關(guān)性

3 討論

HSP作為一種全身性小血管炎，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明[8-9]。相關(guān)研究報(bào)道指出，HSP作為變態(tài)反應(yīng)性疾病之一，全身發(fā)生持續(xù)的微炎癥狀況是導(dǎo)致癥狀反復(fù)及腎臟受損的關(guān)鍵性原因，而患兒的長期預(yù)后受腎臟受累的直接影響[10-11]。HSPN作為HSP的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，其具體發(fā)病機(jī)制仍存在一定的爭議，目前普遍認(rèn)為可能和體液免疫以及細(xì)胞免疫功能紊亂等密切相關(guān)[12]。

BAFF在B淋巴細(xì)胞成活以及成熟過程中個(gè)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，主要表達(dá)于髓系細(xì)胞，在機(jī)體自身的免疫類疾病中的有關(guān)作用已廣受關(guān)注，已有研究報(bào)道證實(shí)多種腎臟疾病患者的血清BAFF水平存在顯著改變，可能參與疾病的形成及發(fā)展進(jìn)程[13-14]。此外，MK介導(dǎo)了多類疾病的形成，可通過調(diào)控Th1細(xì)胞分化以及Treg細(xì)胞分化等途徑發(fā)揮促炎作用，于急慢性腎臟疾病中的表達(dá)明顯升高，值得臨床重點(diǎn)關(guān)注[15]。此外，相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)[16]，HSP患兒存在不同程度的Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失衡，即Th17細(xì)胞水平升高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平下降，且兩者比例失衡程度和疾病以及腎臟損害程度高度相關(guān)。由此推測(cè)，上述相關(guān)指標(biāo)可能在HSP以及HSPH的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，通過探討其臨床意義，可為疾病的診治提供參考依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，HSPN患兒血清BAFF存在異常低表達(dá)，而MK存在異常高表達(dá)?？紤]原因可能是BAFF主要功能在于調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞的大小以及功能，刺激B淋巴細(xì)胞存活、增殖抗原呈遞等，間接參與了機(jī)體免疫反應(yīng)。其中HSPN患者體內(nèi)的BAFF受體存在明顯的表達(dá)增加，在和其受體特異性結(jié)合后，會(huì)引起血循環(huán)中的游離BAFF水平下降。MK既具有促血管形成以及加速內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要作用，同時(shí)可發(fā)揮一定的刺激IL-17以及IFN-γ合成、分泌的作用，繼而起到促炎的目的，因此其水平的升高往往預(yù)示機(jī)體炎癥反應(yīng)的加劇，故此，在HSPN患兒血清中存在明顯高表達(dá)[17]。

有研究表明，尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白以及尿β微球蛋白等指標(biāo)能夠有效地反映出人體腎功能的有關(guān)狀態(tài)，已被廣泛地應(yīng)用于臨床監(jiān)測(cè)過程中[18]。本研究顯示，研究組尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白以及尿β微球蛋白水平均高于HSP組及對(duì)照組，而HSP組與對(duì)照組上述指標(biāo)比較無明顯差異，這提示了研究組患兒的腎功能存在較為明顯地?fù)p害，原因主要考慮與HSPN患兒的腎炎病情處于較為強(qiáng)烈的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)等因素有關(guān)，而這將從腎功能相關(guān)監(jiān)測(cè)指標(biāo)中得到明顯地反饋，因此上述三項(xiàng)指標(biāo)的含量水平明顯升高。

此外，HSPN患兒存在明顯Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失衡。過度活化的Th17細(xì)胞可通過大量合成、分泌IL-17以及IL-6等多種促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞形成多類細(xì)胞因子以及趨化因子，從而致使炎癥反應(yīng)被放大，引起血管的炎癥性損傷，介導(dǎo)了HSPN的發(fā)生、發(fā)展過程。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在明顯的免疫抑制效果，其可經(jīng)由多個(gè)差異性的環(huán)節(jié)有效抑制各類效應(yīng)T細(xì)胞的自主活化、增殖以及效應(yīng)，繼而維持自身免疫耐受，但其水平降低時(shí)可能提升B細(xì)胞數(shù)量和活力，進(jìn)一步促進(jìn)免疫球蛋白的分泌，從而誘導(dǎo)大量的免疫復(fù)合物在腎小球的有關(guān)毛細(xì)血管壁亦或是基底膜中發(fā)生沉積，最終引起腎臟免疫損傷[5]。進(jìn)一步研究表明，血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡存在密切相關(guān)。究其原因可能是隨著血清BAFF水平的降低以及MK水平的升高，使患兒病情不斷加重，腎臟損傷程度無疑隨之增加，最終引起各項(xiàng)腎功能指標(biāo)水平發(fā)生對(duì)應(yīng)改變。同時(shí)，BAFF、MK可能經(jīng)由抑制機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的有關(guān)途徑，提升了Th17和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞二者失衡的風(fēng)險(xiǎn)，間接介導(dǎo)HSPN的發(fā)生。

綜上所述，HSPN患兒血清BAFF過低表達(dá)，而MK過高表達(dá)，兩者可能是通過調(diào)控Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞平衡狀態(tài)間接參與HSPN的發(fā)生。