腫瘤標(biāo)志物P16INK4A在器官纖維化治療中的研究進(jìn)展

施建伷，韋天文綜述，劉加寶，王連生審校

0 引 言

P16INK4A蛋白是由ink4a基因編碼的一種16 kDa的小分子蛋白，又被稱之為細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子2A (cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A)。在細(xì)胞周期調(diào)控中，P16INK4A蛋白通過(guò)P16INK4A/Rb通路競(jìng)爭(zhēng)性下調(diào)CDK4和CDK6，影響下游蛋白磷酸化，使得E2F因子無(wú)法被激活，進(jìn)而阻遏細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[1-3]。DNA在遭受損傷后，細(xì)胞會(huì)暫時(shí)停止復(fù)制并啟動(dòng)DNA修復(fù)。如果損傷程度嚴(yán)重，細(xì)胞會(huì)永久性地退出細(xì)胞周期并進(jìn)入程序性死亡，即稱之為細(xì)胞衰老[4]。就真核細(xì)胞而言，細(xì)胞增殖調(diào)控主要發(fā)生在G1-S和G2-M這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，由于G1-S期在細(xì)胞周期調(diào)控中處于更加重要的位置，因此阻遏G1-S期即可推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞衰老[1]。

衰老細(xì)胞和其他終末分化細(xì)胞不同在于其特征性的衰老標(biāo)志物，一種常用的標(biāo)記組合為衰老相關(guān)的β半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase，SA-β-GAL)聯(lián)合細(xì)胞周期抑制因子P16INK4A蛋白[5]。目前的理論認(rèn)為，細(xì)胞衰老在腫瘤和纖維化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中有著重要的作用。作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志物之一，P16INK4A蛋白及其調(diào)控的相關(guān)因子與腫瘤和纖維化關(guān)系密切。目前熱點(diǎn)領(lǐng)域正在進(jìn)行P16INK4A蛋白作為治療干預(yù)靶點(diǎn)的探索，本文就P16INK4A蛋白目前的主要研究進(jìn)展作一綜述。

1 P16INK4A蛋白作為腫瘤標(biāo)志物的應(yīng)用

P16INK4A蛋白的水平受細(xì)胞狀態(tài)的影響具有高度動(dòng)態(tài)性。在健康正常的組織中，P16INK4A蛋白處于低表達(dá)甚至不表達(dá)狀態(tài)，并且表達(dá)量和年齡呈正相關(guān)[5]。P16INK4A蛋白通過(guò)P16INK4A/Rb通路對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞衰老，由于Rb蛋白在惡性腫瘤中常處于失活狀態(tài)，受P16INK4A/Rb通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)影響，P16INK4A蛋白在惡性腫瘤中呈高表達(dá)，但此種由于自身負(fù)反饋調(diào)節(jié)引起的P16INK4A升高僅能作為腫瘤標(biāo)志物為臨床提供指示作用，并不能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞周期起到調(diào)控功能[6]。這種負(fù)反饋表達(dá)的特點(diǎn)使得研究者們將P16INK4A蛋白作為腫瘤標(biāo)志物用于臨床診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)[7-8]，同時(shí)將其作為潛在的治療靶點(diǎn)進(jìn)行新型靶向藥物的探索。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已證實(shí)在部分腫瘤模型中敲除ink4a基因?qū)е履[瘤的快速惡化，而在腫瘤的癌前病變階段，P16INK4A蛋白存在高表達(dá)現(xiàn)象。這一結(jié)論提示細(xì)胞衰老可在癌前病變階段阻止腫瘤進(jìn)一步惡變，某些關(guān)鍵的衰老標(biāo)志物如P16INK4A蛋白可能在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著預(yù)警和屏障作用[9]。

1.1人乳頭瘤狀病毒(human papilloma virus,HPV)相關(guān)癌癥HPV可廣泛感染人類皮膚黏膜，全球約5%的癌癥是由高危型 HPV感染引起，包括幾乎所有的宮頸癌、80%的肛門癌、65%的陰道癌、50%的外陰癌和35%的陰莖癌等。高危型HPV表達(dá)的E7蛋白可與Rb蛋白結(jié)合，同時(shí)抑制了對(duì)P16INK4A蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致P16INK4A蛋白表達(dá)升高。因此，在HPV感染相關(guān)的腫瘤中，P16INK4A蛋白被認(rèn)為是HPV-DNA檢測(cè)的替代性標(biāo)志物[10,11]。

1.1.1宮頸癌高危型HPV感染已明確是宮頸癌的病因之一，已有研究驗(yàn)證了P16INK4A蛋白檢測(cè)作為HPV替代物在宮頸癌診斷中的替代價(jià)值[10]。將P16INK4A蛋白和Ki-67兩者結(jié)合，在宮頸癌和癌前病變的診斷中有更高的敏感性和特異性，在危險(xiǎn)分層、診斷和治療中有廣闊的應(yīng)用前景[12-13]。一項(xiàng)薈萃分析認(rèn)為P16INK4A蛋白高表達(dá)和宮頸癌患者更好的預(yù)后相關(guān)[14]，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)盡管P16INK4A蛋白在宮頸癌中呈高表達(dá)，但主要定位于細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核，因此如何促進(jìn)胞質(zhì)中的P16INK4A蛋白進(jìn)入胞核發(fā)揮作用可能是宮頸癌潛在的治療方向之一[15]。

1.1.2頭頸部鱗狀細(xì)胞癌頭頸部鱗癌的經(jīng)典高危因素主要包括吸煙和酗酒等不良生活習(xí)慣，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，高危HPV感染導(dǎo)致的頭頸部鱗癌的比例不斷上升。有學(xué)者觀察了頭頸部鱗癌病理組織中P16INK4A蛋白和HPV病毒表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果提示在頭頸部鱗癌樣本中，通過(guò)組織免疫化學(xué)法檢測(cè)的P16INK4A蛋白和通過(guò)PCR檢測(cè)的HPV病毒表達(dá)高度相關(guān)[11]。

1.1.3肛門和生殖器腫瘤超過(guò)80%的肛門癌合并高危型HPV感染，高危型HPV感染的肛門組織免疫組化顯示為彌漫性P16INK4A蛋白陽(yáng)性，而低危型則為斑點(diǎn)狀。Eva 等人進(jìn)行的一項(xiàng)小規(guī)模回顧性研究表明，在肛門癌組織中，HPV感染和P16INK4A蛋白陽(yáng)性有著高度一致性，同時(shí)P16INK4A蛋白檢測(cè)陽(yáng)性的患者預(yù)后顯著優(yōu)于陰性的患者[16]。最近的一項(xiàng)Meta分析得出了同樣的結(jié)論，認(rèn)為P16INK4A蛋白陽(yáng)性的病人生存時(shí)間大約是陰性患者的3倍，同時(shí)聯(lián)合進(jìn)行HPV-DNA和P16INK4A蛋白檢測(cè)對(duì)預(yù)后有積極影響[17]。

外陰癌是女性生殖道第四常見的惡性腫瘤，80%～90%的外陰癌為鱗狀細(xì)胞癌，約1/5合并HPV感染。相關(guān)學(xué)者分析發(fā)現(xiàn)，P16INK4A蛋白過(guò)表達(dá)和HPV感染之間存在不匹配現(xiàn)象[18-19]，這種矛盾的結(jié)果可能和研究樣本中P16INK4A蛋白陽(yáng)性率相關(guān)。由于HPV的E6和E7蛋白分別作用于p53和Rb蛋白進(jìn)而促使癌細(xì)胞進(jìn)入無(wú)限增殖狀態(tài)，因此p53和P16INK4A蛋白過(guò)表達(dá)均可作為外陰癌的獨(dú)立預(yù)后因子[20]。更進(jìn)一步的研究表明，外陰癌中P16INK4A蛋白過(guò)表達(dá)可能是更強(qiáng)的獨(dú)立預(yù)后因子[21]。由于是否存在其他機(jī)制導(dǎo)致P16INK4A蛋白在HPV感染的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)尚不明確，因此該結(jié)論需要在更大規(guī)模的人群中進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2非HPV相關(guān)腫瘤在包括淋巴瘤、皮膚和黑色素瘤、頭頸部腫瘤、胰腺癌、肺癌、食管癌、消化系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌、前列腺癌和腎癌等多種類型腫瘤中均檢測(cè)出不同形式的P16INK4A基因突變(包括啟動(dòng)子甲基化、組蛋白缺失和純合子缺失等)[22-24]，進(jìn)一步導(dǎo)致了P16INK4A蛋白在不同起源的腫瘤和同一部位但不同組織學(xué)類型的腫瘤之間的意義不同[25-27]。除原發(fā)性腫瘤外，國(guó)外學(xué)者進(jìn)一步探討了P16INK4A蛋白在轉(zhuǎn)移性腫瘤中的價(jià)值。通過(guò)對(duì)灌洗液進(jìn)行免疫組化染色分析，研究者發(fā)現(xiàn)P16INK4A蛋白過(guò)表達(dá)在腫瘤診斷中的特異性高達(dá)96.96%，可作為補(bǔ)充的診斷標(biāo)志物[28]。

2 P16INK4A作為治療靶點(diǎn)在器官纖維化中的應(yīng)用

早期的研究已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞周期抑制劑P53和P16INK4A和細(xì)胞衰老進(jìn)程密切相關(guān)[29]。健康細(xì)胞或組織在遭受急慢性損傷后處于一種炎癥反應(yīng)狀態(tài)，受損傷的細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，募集包括中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等在內(nèi)的炎性細(xì)胞推動(dòng)纖維化進(jìn)程[30]。衰老細(xì)胞隨著年齡增加而增加，最終超過(guò)機(jī)體清除能力在體內(nèi)蓄積。衰老細(xì)胞雖然停止進(jìn)入細(xì)胞周期，但是會(huì)產(chǎn)生衰老相關(guān)分泌表型(SASP)持續(xù)推動(dòng)纖維化疾病進(jìn)展[31]。

2.1腎纖維化Valentijn等[32]總結(jié)發(fā)現(xiàn)在多種腎臟疾病中均可觀察到細(xì)胞衰老現(xiàn)象，其主要標(biāo)志物包括了SA-β-Gal、P16INK4A和P21這三種組合。在INK4A基因敲除鼠中進(jìn)行單側(cè)輸尿管結(jié)扎以誘導(dǎo)急性腎損傷模型，術(shù)后發(fā)現(xiàn)INK4A基因敲除鼠腎臟組織中膠原蛋白沉積增加約1.5倍，同時(shí)腎臟基質(zhì)纖連蛋白沉積增加約2倍[33]。除直接干預(yù)P16INK4A基因表達(dá)會(huì)影響腎纖維化外，Baker等[34]進(jìn)一步驗(yàn)證干預(yù)P16INK4A陽(yáng)性的衰老細(xì)胞是否有相同的價(jià)值。在自然衰老的INK-ATTAC轉(zhuǎn)基因小鼠中通過(guò)藥物靶向敲除INK4A陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)清除INK4A陽(yáng)性細(xì)胞可以顯著延緩隨年齡進(jìn)展的腎小球硬化，保護(hù)了腎功能。這些研究均提示P16INK4A蛋白可能通過(guò)基因表達(dá)和衰老細(xì)胞分泌這兩種途徑影響腎纖維化，并且在調(diào)控上存在時(shí)空差異，為未來(lái)不同疾病模型的干預(yù)提供了新的手段。

2.2肺纖維化和腎纖維化類似，過(guò)表達(dá)P16INK4A基因和清除P16INK4A陽(yáng)性細(xì)胞均可減輕肺纖維化。支氣管發(fā)育不良是一種早產(chǎn)兒的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，疾病終末期表現(xiàn)為不可逆的肺廣泛纖維化。早期研究發(fā)現(xiàn)大鼠暴露于高氧環(huán)境后P16啟動(dòng)子甲基化水平會(huì)逐漸升高，這導(dǎo)致了P16的顯著低表達(dá)并導(dǎo)致肺組織纖維化[35]。Zhao等[36]用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞嘧啶核苷上調(diào)了P16INK4A基因表達(dá)后小鼠肺纖維組織減少，肺羥脯氨酸水平顯著下降，肺纖維化程度減輕。特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是各種彌漫性肺病的終末階段，表現(xiàn)為肺間質(zhì)重塑和肺功能受損[37]。最新的觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞衰老可能通過(guò)以下三種機(jī)制誘導(dǎo)IPF纖維化：①干細(xì)胞衰老削弱了肺組織修復(fù)和再生能力；②衰老的細(xì)胞通過(guò)SASP加速纖維化；③肺成纖維細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞衰老逃逸細(xì)胞凋亡[38]。目前已證實(shí)在IPF患者的肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞P16INK4A基因表達(dá)明顯升高且和IPF嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[39]。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，和單純博來(lái)霉素干預(yù)組相比，靶向清除INK4A陽(yáng)性的細(xì)胞可以消除肺組織中的衰老細(xì)胞，削弱其旁分泌作用，延緩了21天內(nèi)Mcp1，IL-6，Mmp12和TGF-β等SASP的增加，改善了肺功能[40]。

2.3心肌纖維化心肌纖維化是由心肌缺血、系統(tǒng)性疾病或藥物等有害刺激作用于心臟導(dǎo)致的，是所有心臟疾病的最終轉(zhuǎn)歸，其特征主要包括心臟成纖維細(xì)胞的聚集和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。在心肌梗死這類急性心臟疾病中，纖維瘢痕在早期替代壞死的心肌細(xì)胞有利于穩(wěn)定心臟結(jié)構(gòu)，防止心臟破裂。但是在心衰這一類慢性心臟疾病中，心肌纖維化逐漸增加導(dǎo)致心室壁硬化，嚴(yán)重影響心臟功能，增加死亡率[41-44]。

Meyer等[45]在P53和P16INK4A基因敲除鼠中構(gòu)建橫向主動(dòng)脈狹窄(transverse aortic constriction，TAC)模型，和野生型小鼠相比，基因敲除鼠在TAC術(shù)后6周纖維化顯著加重，心功能受損。這一結(jié)果初步揭示了P16INK4A蛋白可能在心臟纖維化調(diào)控中扮演重要的角色，但目前直接或間接干預(yù)P16INK4A蛋白對(duì)心臟纖維化影響的研究相對(duì)較少，需要未來(lái)進(jìn)一步探索和發(fā)現(xiàn)其應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

P16INK4A蛋白作為細(xì)胞周期抑制因子，從基因?qū)用鎸?duì)其表達(dá)進(jìn)行干預(yù)或靶向清除其陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞已經(jīng)在不同疾病中展現(xiàn)出其生物學(xué)價(jià)值。靶向抑制CDK4/6的抗腫瘤藥物Palbociclib，Ribociclib和Abemacilib在機(jī)制上模擬了P16INK4A蛋白對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，目前主要應(yīng)用于乳腺癌治療，未來(lái)有望推廣到其他腫瘤的治療中。同樣地，過(guò)表達(dá)P16INK4A基因或清除衰老細(xì)胞可以有效緩解器官纖維化，這一結(jié)論為纖維化疾病的治療提供了新的思路。

除了在腫瘤和器官纖維化領(lǐng)域的應(yīng)用外，最新的研究發(fā)現(xiàn)肝臟部分切除術(shù)后，P16INK4A水平的降低會(huì)影響肝臟組織的再生[46]。這一結(jié)論初步揭示了P16INK4A蛋白在組織再生領(lǐng)域的潛在價(jià)值，為未來(lái)不可再生器官的治療如神經(jīng)修復(fù)和心肌再生提供了一定的理論基礎(chǔ)。關(guān)于P16INK4A蛋白的功能目前仍在不斷地探索中，希望未來(lái)有更多的研究對(duì)其價(jià)值進(jìn)行更全面地挖掘。