小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷提取基因組DNA的研究進(jìn)展

范海頁(yè)，陳慧林，朱永航，王嚴(yán)，王若航，趙薇，陶香林，孫恩濤

皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002

近年來(lái)，DNA條形碼技術(shù)發(fā)展迅速，在物種的鑒定分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、遺傳多樣性分析等研究中應(yīng)用廣泛[1]。而樣本DNA的提取是獲取DNA條形碼的關(guān)鍵步驟，也是進(jìn)行后續(xù)相關(guān)研究的基礎(chǔ)[2]。樣本基因組DNA的提取分為取樣和提取兩個(gè)重要部分，依據(jù)取樣方法的不同，可分為傷害性取樣和無(wú)形態(tài)損傷性取樣。其中，傷害性取樣均勻化研磨樣本，破壞了樣本重要外部形態(tài)，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)標(biāo)本的回收和驗(yàn)證[3]；而無(wú)形態(tài)損傷性取樣保留了憑證標(biāo)本，有效彌補(bǔ)了傷害性取樣的不足[4]。小型節(jié)肢動(dòng)物因體型微小，目前常采用傷害性取樣方法，導(dǎo)致現(xiàn)有基因數(shù)據(jù)庫(kù)中大多數(shù)小型節(jié)肢動(dòng)物序列因缺乏相應(yīng)的憑證標(biāo)本，難以進(jìn)行鑒定和錯(cuò)誤修正[4]。因此，小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷提取基因組DNA的研究越來(lái)越受到重視。

本文概述了已報(bào)道的小型節(jié)肢動(dòng)物(體長(zhǎng)0.1～10.0 mm)的無(wú)形態(tài)損傷取樣方法，對(duì)比了小型節(jié)肢動(dòng)物不同DNA提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)，探索出更簡(jiǎn)單、高效的無(wú)形態(tài)損傷性基因組DNA提取方法奠定基礎(chǔ)。

1 小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷取樣方法

無(wú)形態(tài)損傷性取樣指在不破壞實(shí)驗(yàn)樣本重要外部形態(tài)結(jié)構(gòu)的情況下，采集樣本微量組織，抽提樣本內(nèi)容物或收集樣本脫落的羽毛、糞便、尿液、卵等含有遺傳信息的樣品[5]。已報(bào)道的小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷性取樣方法有微量組織取樣、內(nèi)容物取樣、糞便取樣和蛻皮組織取樣。

1.1微量組織取樣 微量組織取樣是指在保證憑證標(biāo)本形態(tài)完整性的同時(shí)，選取樣本微量組織備取DNA的取樣方法。閆振天等[6]利用蚊附肢成功提取基因組DNA，用于分子鑒定和基因型研究。胡佳等[7]對(duì)蠅類后足1/5跗節(jié)進(jìn)行研磨，成功獲得基因組DNA，用于物種鑒定。

微量組織取樣所需樣本組織量較少，能夠較好地保護(hù)樣本重要外部形態(tài)結(jié)構(gòu)，為后續(xù)形態(tài)學(xué)鑒定奠定了良好基礎(chǔ)。但是，微量組織取樣所提供的DNA含量較少，可能無(wú)法進(jìn)行有效的分子生物學(xué)研究。此外，對(duì)于稀有物種，即使只存在小部分的形態(tài)損壞，也可能造成樣本形態(tài)學(xué)信息的巨大損失[8]。

1.2內(nèi)容物取樣 內(nèi)容物取樣是指不破壞樣本重要外部形態(tài)結(jié)構(gòu)的前提下，僅消化樣本的表皮層[9]，獲取內(nèi)容物備取DNA的取樣方法。高艷等[4]通過改進(jìn)消化液濃度，有效縮短了昆蟲表皮層的消化時(shí)間，探索出一種適用于表皮薄、身體柔軟的小型節(jié)肢動(dòng)物(跳蟲)的無(wú)形態(tài)損傷基因組DNA提取方法。單振菊等[10]利用幾丁質(zhì)酶溶液消化甲螨厚幾丁質(zhì)外殼，建立一種無(wú)損傷提取具有厚幾丁質(zhì)外殼的小型節(jié)肢動(dòng)物基因組DNA的方法。

內(nèi)容物取樣僅消化表皮層，極大程度地保護(hù)了樣本形態(tài)，是小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷取樣的有效途徑。但是，不同類型的小型節(jié)肢動(dòng)物表皮構(gòu)成不完全相同[9]，且已報(bào)道的消化方法應(yīng)用于其他類群的實(shí)際效果未知[11]。因此，內(nèi)容物取樣方法的更廣泛應(yīng)用，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證和改進(jìn)。

1.3糞便取樣 糞便取樣指在物種的活動(dòng)區(qū)域內(nèi)采集其糞便樣品，備取DNA的取樣方法。新鮮糞便含有腸道脫落細(xì)胞，提取DNA比較簡(jiǎn)單[3,5]，且糞便取樣對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本不造成任何損傷，是一種具有潛在價(jià)值的取樣方法[12]。Zhu等[13]成功對(duì)5種葉螨糞便的16 SrRNA基因進(jìn)行深度測(cè)序，探討其細(xì)菌群落。但是，由于糞便長(zhǎng)期暴露于外界環(huán)境中，極易造成DNA降解，影響DNA的提取效果[12]。Lefort等[14]利用金龜子糞便進(jìn)行無(wú)損傷DNA的提取，結(jié)果顯示，超過88%的糞便成功提取基因組DNA，少量存放7～8天的糞便未能成功提取。同時(shí)，糞便保存方法、預(yù)處理操作、提取方法等因素也會(huì)影響DNA提取效果，并且糞便中常含大量抑制Taq酶活性的物質(zhì)，可能對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生影響[15]。

目前，糞便取樣更多地應(yīng)用于哺乳類、爬行類、鳥類或體型較大的節(jié)肢動(dòng)物。Scriven等[16]從大黃蜂糞便中成功提取到基因組DNA，應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究。相較而言，小型節(jié)肢動(dòng)物因糞便樣品小，獲取和保存難度較大[5]，糞便取樣法的廣泛應(yīng)用存在困難，需進(jìn)一步優(yōu)化拓展。

1.4蛻皮組織取樣 蛻皮組織取樣指采集物種蛻皮成分作為備取DNA的取樣方法。蛻皮組織被氣管、腺管及前、后腸內(nèi)膜等部分組織附著，可從中提取DNA[17]。目前蛻皮組織更多被運(yùn)用于中大型節(jié)肢動(dòng)物的基因組DNA提取，例如蜜蜂[18]，在小型節(jié)肢動(dòng)物的應(yīng)用相對(duì)較少，例如蚊[19]、金龜子[14]。

由于小型節(jié)肢動(dòng)物的體型較小，產(chǎn)生的蛻皮組織樣本小[20]，通常難以采集。且蛻皮組織暴露時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致DNA降解，影響DNA提取效果。此外，土壤小型節(jié)肢動(dòng)物的蛻皮組織可能存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，影響后續(xù)PCR擴(kuò)增[21]。

2 小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷性DNA提取方法

小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷取樣后，進(jìn)行后續(xù)DNA提取。目前，常被報(bào)道證實(shí)的小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷的DNA的提取方法有Nacl-Tris-EDTA緩沖液(sodium-chloride-Tris-EDTA buffer,STE)法、Chelex-100法、CaCl2緩沖液法和試劑盒法。

2.1STE法 STE法提取DNA是通過STE裂解液和蛋白酶K的共同作用，實(shí)現(xiàn)基因組DNA的提取。該方法操作簡(jiǎn)便，所用試劑少且成本低廉[23]，被廣泛應(yīng)用于小型節(jié)肢動(dòng)物的DNA提取[22-25]。許薇等[22]采取STE法提取腐食酪螨DNA，成功用于腐食酪螨的分子鑒定。近年來(lái)，有相關(guān)研究者將此法創(chuàng)新應(yīng)用于小型節(jié)肢動(dòng)物的無(wú)形態(tài)損傷提取。張利娟等[25]通過用無(wú)菌微針穿刺和STE法相結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)無(wú)形態(tài)損傷從單頭薊馬中提取基因組DNA。

雖然STE法被報(bào)道廣泛用于小型節(jié)肢動(dòng)物基因組DNA的提取，但運(yùn)用于小型節(jié)肢動(dòng)物DNA的無(wú)形態(tài)損傷提取的報(bào)道卻相對(duì)較少。

2.2Chelex-100法 Chelex-100法指在高溫、堿性及低離子強(qiáng)度條件下，使細(xì)胞膜破裂、蛋白質(zhì)變性，再通過離心去除Chelex顆粒及其螯合物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)基因組DNA的分離獲取[26]。該提取方法簡(jiǎn)單、安全，且操作過程未涉及溶液轉(zhuǎn)移，減少了實(shí)驗(yàn)污染和樣本損失，適用于微量DNA的提取[6]，且作為PCR反應(yīng)模板具有良好的效果[6,26]。但Chelex-100法提取到的DNA純度不高，應(yīng)用在限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)這類精細(xì)程度更高的分子實(shí)驗(yàn)時(shí)存在局限性[26]。

近年來(lái)，多位學(xué)者研究證明，Chelex-100法是簡(jiǎn)單而有效的小型節(jié)肢動(dòng)物DNA提取方法，可用于提取如棉蚜[27]、甲螨[28]、麗蚜小蜂[29]等多個(gè)物種的基因組DNA。但是，目前Chelex-100法被報(bào)道應(yīng)用于小型節(jié)肢動(dòng)物的無(wú)形態(tài)損傷提取DNA仍相對(duì)較少。

2.3CaCl2緩沖液法 CaCl2緩沖液法通過CaCl2裂解緩沖液和蛋白酶K的共同作用，實(shí)現(xiàn)基因組DNA的粗提取。近年來(lái)，CaCl2緩沖液法是節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷基因組DNA提取常用的方法之一。Gilbert等[30]利用該方法成功擴(kuò)增了50年前甲蟲舊樣本的COⅠ和28S rDNA序列基因，且有效保留了甲蟲外部形態(tài)。此后，多位學(xué)者對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，用于研究不同節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷性DNA提取的實(shí)驗(yàn)[8，31]。Suaste-Dzul等[31]在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行試劑濃度的改進(jìn)，并成功用于3種中小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷提取。

迄今，CaCl2緩沖液法被多位研究者證實(shí)適用于節(jié)肢動(dòng)物的無(wú)損傷性基因組DNA提取，但研究對(duì)象多數(shù)為大中型的節(jié)肢動(dòng)物，有關(guān)小型節(jié)肢動(dòng)物的研究報(bào)道較少。高艷等[4]對(duì)CaCl2緩沖液法的消化液濃度及純化方法進(jìn)行改進(jìn)，有效減少了實(shí)驗(yàn)步驟，進(jìn)一步提高了DNA質(zhì)量，更大程度提高了小型節(jié)肢動(dòng)物DNA提取的成功率，使CaCl2緩沖液法更加適用于小型節(jié)肢動(dòng)物的無(wú)損傷性DNA提取。

2.4試劑盒法 試劑盒配備了提取DNA所需的成套試劑和用品，可直接用于提取基因組DNA，操作便捷精準(zhǔn)，排除了人為配置試劑的誤差，并減少了試劑的浪費(fèi)。葉琳雄等[32]在研究中用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒結(jié)合蛋白酶K對(duì)粉蚧進(jìn)行基因組DNA的無(wú)形態(tài)損傷提取，獲得了高質(zhì)量DNA。

然而，現(xiàn)階段DNA提取試劑盒種類比較多，不同試劑盒提取速度與效果也存在較大差異[3]。魏亦寒等[35]在粉蚧DNA提取方法的探究中，分別使用GenMag Bio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組磁珠法試劑盒和Gene JET Genomic DNA純化試劑盒法對(duì)粉蚧成蟲進(jìn)行基因組DNA提取，獲得不同處理?xiàng)l件下的粉蚧DNA，使用前者試劑盒提取的DNA質(zhì)量均優(yōu)于后者。因此，選用試劑盒法提取小型節(jié)肢動(dòng)物DNA時(shí)需關(guān)注其適用性和實(shí)用性。其次，試劑盒價(jià)格普遍較高，是限制其廣泛應(yīng)用的重要因素。

3 總結(jié)與展望

近年來(lái)，無(wú)形態(tài)損傷性DNA提取在小型節(jié)肢動(dòng)物分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、系統(tǒng)地理學(xué)、行為生態(tài)學(xué)、動(dòng)物保護(hù)學(xué)等領(lǐng)域中的運(yùn)用具有重要意義[3]?；跓o(wú)形態(tài)損傷性取樣所提取的基因組DNA能夠成功擴(kuò)增并測(cè)序，同時(shí)還保證了實(shí)驗(yàn)樣本重要外部形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性，為后續(xù)憑證標(biāo)本的回收奠定良好基礎(chǔ)。但目前無(wú)形態(tài)損傷取樣應(yīng)用于小型節(jié)肢動(dòng)物時(shí)仍存在一定局限性，如體型太小致使取樣困難，適用性局限，需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷優(yōu)化等。此外，還有一些提取動(dòng)物基因組DNA的經(jīng)典方法，例如酚氯仿法、SDS法、CTAB法、鹽析法，能否應(yīng)用于小型節(jié)肢動(dòng)物的無(wú)形態(tài)損傷DNA的提取，仍需更多探索和驗(yàn)證。因此，小型節(jié)肢動(dòng)物無(wú)形態(tài)損傷提取DNA方法的優(yōu)化改進(jìn)和創(chuàng)新，是未來(lái)無(wú)損傷提取研究的發(fā)展趨勢(shì)之一。

本研究總結(jié)整理了目前常用的小型節(jié)肢動(dòng)物的DNA無(wú)形態(tài)損傷取樣方法，對(duì)比了小型節(jié)肢動(dòng)物不同DNA提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為后續(xù)的相關(guān)研究奠定了理論基礎(chǔ)，為更好地開發(fā)利用無(wú)形態(tài)損傷提取小型節(jié)肢動(dòng)物DNA提供了有力工具。