數(shù)字PCR技術(shù)在動物疫病檢測中的應(yīng)用

陳林軍，崔 強，于志超，李軍燕，羅曉平，王海艷，延 涵，劉 丹，趙治國

（1.呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

近幾十年來，基于分子生物學(xué)技術(shù)，已經(jīng)建立了許多核酸檢測方法應(yīng)用于動物疫病的實驗室檢測。這些方法優(yōu)點較多，通常其敏感性及特異性高，并且提供了更簡單的標(biāo)準(zhǔn)化檢測程序。實驗室核酸檢測方法，包括普通PCR、巢式PCR（nested PCR）、限制性片段長度多態(tài)性PCR（PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP）、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplifed polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、多重連接依賴性探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）以及DNA測序［1-4］。上述方法有些已成功用于動物疫病實驗室的檢測，但是有的靈敏度仍然受到自身技術(shù)限制，尤其是在低豐度樣本及復(fù)雜性樣品檢測中。近些年，數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）已被用于核酸檢測，例如轉(zhuǎn)基因成分分析、動植物產(chǎn)品檢測等［5-6］，特別是在腫瘤學(xué)診斷中其顯示出了巨大潛力［7-8］。盡管dPCR在動物疫病實驗室檢測領(lǐng)域的應(yīng)用相對不及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，但該方法可能在將來診斷和控制動物疫病中發(fā)揮重要作用，未來將需要更精確靈敏的診斷手段來支持流行地區(qū)的動物疫病控制，以及在動物疫病非流行地區(qū)所進行的流行病學(xué)監(jiān)測。

1 原理

dPCR能夠?qū)悠分写嬖诘哪繕?biāo)核酸進行絕對定量，避免了qPCR的不足［9］。dPCR，首先通過預(yù)處理，將樣品稀釋和分配到多個獨立分區(qū)中，通過創(chuàng)建“油包水”乳液（微滴式數(shù)字PCR）、使用具有微通道的芯片（微流控芯片數(shù)字PCR）或微流體芯片（微滴芯片式數(shù)字PCR）實現(xiàn)分區(qū)，每個分區(qū)包含很少或者沒有目標(biāo)序列；然后，每個分區(qū)充當(dāng)單獨的PCR微反應(yīng)器，PCR擴增后，每個分區(qū)被量化為具有或不具有靶序列，即為陽性（1）或陰性（0）結(jié)果；最后熒光檢測包含擴增靶序列的分區(qū)，根據(jù)泊松分布原理以及陽性分區(qū)與總數(shù)的比值確定樣品中待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)［10-12］。因為樣品分配可有效地將目標(biāo)序列集中在分隔的微反應(yīng)器中減少了模板競爭，能夠檢測稀有突變以及痕量核酸；此外，它還允許PCR擴增反應(yīng)對樣品中存在的抑制劑具有更高的耐受性［13］。根據(jù)反應(yīng)單元形成方式的不同，數(shù)字PCR主要可分為微滴式數(shù)字PCR、微流控芯片數(shù)字PCR和微滴芯片式數(shù)字PCR等。

1.1 微滴式數(shù)字PCR

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）基于乳液PCR（emulsion PCR）技術(shù)［14］，通過油水不相容的原理，油形成油膜將水包裹在其中，形成一個個微滴作為反應(yīng)室。微滴發(fā)生器可將樣品生成數(shù)萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，每個微滴都成為一個獨立的反應(yīng)器，隨后微滴完成PCR擴增，最后微滴分析儀對微滴逐個進行熒光檢測。相比陰性微滴，包含至少一個目標(biāo)核酸分子的陽性微滴的熒光信號強度增加，最后根據(jù)泊松分布，通過陽性微滴的比例給出目標(biāo)分子的絕對拷貝數(shù)［15-16］。微滴式數(shù)字PCR過程通常包括微滴生成、微滴反應(yīng)以及微滴檢測3個過程，但也有將3個過程高度集成的設(shè)備，如Bio-Rad QX ONE數(shù)字PCR系統(tǒng)整合了微滴生成、熱循環(huán)反應(yīng)及微滴讀取等步驟，最大程度減少人工操作，還配備4個獨立的熒光檢測通道提高了實驗通量。

1.2 微流控芯片數(shù)字PCR

微流控芯片數(shù)字PCR基于微流控芯片技術(shù)，芯片由微米級流體的管道、反應(yīng)器等元件構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比，可以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的特殊性能［17］。如由層流效應(yīng)引發(fā)的微管道中液體的層流狀態(tài)使得在非平衡狀態(tài)下對微流體的操控成為可能，毛細效應(yīng)、快速熱傳導(dǎo)和擴散效應(yīng)使得微流控器件對樣品流體具有高效的處理能力，從而芯片可快速并準(zhǔn)確地將樣品流體分成若干個獨立的分區(qū)［18］。PCR反應(yīng)之后，再讀取每個獨立分區(qū)得到熒光信號并計數(shù)。微流控芯片的優(yōu)勢是在一張芯片上就可以完成樣品加樣、預(yù)處理、PCR、檢測等系列過程。目前使用微流控芯片技術(shù)的數(shù)字PCR系統(tǒng)主要有Fluidigm公司的Biomark HD基因分析系統(tǒng)、Thermo Fisher Scientific公司的QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)［19］。微流控芯片數(shù)字PCR在醫(yī)學(xué)臨床主要應(yīng)用領(lǐng)域是進行多基因位點平行檢測以指導(dǎo)臨床用藥。

1.3 微滴芯片式數(shù)字PCR

以主流的法國Stilla Technologies公司開發(fā)的Naica Crystal全自動微滴芯片數(shù)字PCR為例，由微滴生成/擴增儀和微滴閱讀分析系統(tǒng)組成，全程僅需唯一耗材，即Sapphire芯片（cutting-edge微流體芯片），可封閉式完成從加樣、微滴生成和擴增，到采集數(shù)據(jù)獲得結(jié)果的全程。先將PCRmix加入芯片，再置于微滴生成擴增系統(tǒng)反應(yīng)，即可自動獲得25 000～30 000個均勻一致的微滴，且以單層平鋪方式形成2D陣列；進入PCR擴增步驟，無需將生成微滴轉(zhuǎn)移至PCR管中；隨后使用微滴閱讀分析系統(tǒng)和專用軟件對微滴成像，用以檢測包含擴增片段的微滴，通過對陽性微滴計數(shù)從而得到核酸絕對數(shù)量［20］。基于Naica數(shù)字PCR平臺開發(fā)的針對新型冠狀病毒（2019-nCoV）的高度特異、高靈敏的數(shù)字PCR絕對定量檢測方法，可降低由假陰性帶來的病原擴散潛在風(fēng)險。

2 應(yīng)用

在進行核酸絕對定量時，數(shù)字PCR技術(shù)因極高的靈敏度，充分彌補了依靠Ct值（qPCR技術(shù)）不能達到較好分辨效果的不足。在動物疫病檢測中，可以用與qPCR相同的反應(yīng)混合物和循環(huán)條件設(shè)計dPCR方案，使結(jié)果更準(zhǔn)確，從而可以進行更精確的診斷。

2.1 dPCR在細菌性動物疫病檢測的應(yīng)用

梅力等［21］建立的布魯菌微滴數(shù)字PCR檢測方法，最低檢測下限可達1.12拷貝/μL，可對布魯菌感染的臨床樣品進行定量檢測。田國忠等［22］建立了布魯菌微滴數(shù)字PCR方法，布魯菌核酸DNA為3.68 fg/反應(yīng)時，ddPCR檢出靶標(biāo)基因拷貝數(shù)可達1拷貝/反應(yīng)，可檢測微量核酸DNA。Song等［23］利用ddPCR檢測結(jié)核分支桿菌特異性基因（M.tb-specific CFP10），對于ddPCR，CFP10的檢測限為1.2拷貝/μL，而qPCR為15.8拷貝/μL。王建峰等［24］針對幼蟲芽孢桿菌16SrRNA基因建立幼蟲芽孢桿菌微滴式數(shù)字PCR檢測方法，檢測靈敏度可達2.9拷貝/μL。

2.2 dPCR在病毒性動物疫病檢測的應(yīng)用

Zhao等［25］利用ddPCR檢測法分別對副痘病毒屬（PAPV）目前已知所有病毒［羊口瘡病毒（ORFV）、偽牛痘病毒（PCPV）和牛丘疹性口炎病毒（BPSV）］等進行了檢測。Benjamin等［26］首次應(yīng)用ddPCR技術(shù)在高通量樣品條件下對二代測序技術(shù)進行驗證。Boettger等［27］首次證明了ddPCR試驗結(jié)論與NGS結(jié)論高度吻合。鄔旭龍等［28］建立的非洲豬瘟病毒ddPCR方法，dd PCR的最低檢測限度可達到0.36拷貝，靈敏度是qPCR的10倍。蘭德松等［29］研究建立的dd PCR方法對PRV gD、gE基因的敏感性比相應(yīng)的qPCR方法高10倍。董桂偉［30］建立了禽腺病毒檢測方法，qPCR檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為100拷貝/μL，而dd PCR方法為10拷貝/μL。

2.3 dPCR在寄生蟲病檢測的應(yīng)用

目前對于低豐度目標(biāo)序列的檢測，定量PCR、雜交等方法都因受到背景DNA的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達不到精確定量的要求。與相同生物材料上進行的qPCR相比，dPCR顯示出高靈敏度的檢測，尤其是在含有PCR擴增抑制劑的樣品中，如對糞便中隱孢子蟲的定量分析［31］。dPCR在要求高精度進行定量檢測的診斷中是一種較有效的方法，例如臨床樣品中的寄生蟲負(fù)荷，以及患者之間或在不同時間點采集的樣品中寄生蟲的統(tǒng)計比較。在血吸蟲病檢測中，某種程度上dPCR結(jié)果能夠更早和特異性檢測到日本血吸蟲［32］。據(jù)報道，dPCR檢測法是檢測和定量核酸小片段（例如cfDNA和micro-RNA）的新方法，是一個有希望的潛在診斷應(yīng)用，尤其是在針對血吸蟲病消除的國家和地區(qū)［33］。Yu等［34］建立羊鞭蟲病的早期診斷檢測方法，對于重組質(zhì)粒，qPCR結(jié)果顯示每個反應(yīng)的檢測限為31.7拷貝，而ddPCR能夠檢測到每個反應(yīng)低于3.17拷貝的濃度。

2.4 dPCR在動物疫病檢測其他方面的應(yīng)用

在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制領(lǐng)域，生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制逐漸成為研究熱點，同時基于核酸檢測技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用推動了核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的進程。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即為用于核酸擴增技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一種。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在醫(yī)療診斷、轉(zhuǎn)基因檢測、生物安全等方面有著極大的發(fā)展空間。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有通用屬性，可以用于定性檢測，也可以用于定量檢測。核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需要高級別精準(zhǔn)的定值方法，數(shù)字PCR作為單分子定量技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。與qPCR不同，dPCR不需要依賴分析樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)品間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行絕對定量分析，并可用于qPCR測定參考標(biāo)準(zhǔn)品絕對定量［35］。國內(nèi)已有研究通過數(shù)字PCR法制備出了豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬塞內(nèi)卡病毒、非洲豬瘟病毒等國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［36-39］。采用高精確度的數(shù)字PCR技術(shù)替代熒光定量PCR技術(shù)進行定值，充分保障了定值結(jié)果的可靠性和技術(shù)權(quán)威性。此外，dPCR被越來越多地用于定量分析包括單核苷酸多態(tài)性（SNP）在內(nèi)的序列變異，用于檢測稀有基因序列，分析藥物敏感性和進行人畜共患病篩查。

3 存在的問題及發(fā)展趨勢

目前，數(shù)字PCR技術(shù)依靠其絕對定量的技術(shù)優(yōu)勢已經(jīng)在各個領(lǐng)域嶄露頭角，但是也面臨一些挑戰(zhàn)。多路熒光通道方法依賴特定的平臺，dPCR平臺以及擴增混合物試劑的選擇可能會受到限制，具體取決于可用的商用儀器。盡管dPCR優(yōu)于qPCR，但它不可能在臨床實驗室中完全取代qPCR。一些研究表明，在高核酸濃度下dPCR可能變得飽和，因此其性能比qPCR差，這強調(diào)了適當(dāng)稀釋的重要性［40-41］。多重PCR是在一個樣本中可以獲得各種信息的方式，可充分利用極少量的和難以獲得的生物樣品，尤其是臨床樣本，減少病例的痛苦及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前，伯樂QX200檢測通道可覆蓋雙通道（FAM/HEX），新推出的QX ONE系統(tǒng)配備4個獨立的熒光檢測通道檢測；BioMarkHD選配IFC微液流芯片（耗材）-Digital Array最多能兼容4種熒光染料進行多通道PCR；QuantStudio 3D系統(tǒng)支持多色熒光系統(tǒng)（FAM/VIC）；Naica數(shù)字PCR系統(tǒng)已經(jīng)在多重方面使用了三通道技術(shù)；關(guān)于更多通道的需求各大廠商也在繼續(xù)研發(fā)中。

目前，另外一個弱勢是新技術(shù)使用的接受度，成熟方法以qPCR為主，傳統(tǒng)數(shù)字PCR方法和qPCR方法相比，操作太過復(fù)雜和獲得數(shù)據(jù)時間更長，耗材成本高。因此，一些實驗室僅使用dPCR進行標(biāo)準(zhǔn)品的精確定量，而qPCR仍然是常規(guī)技術(shù)。迄今為止，dPCR在傳染病，尤其是動物疫病診斷中的臨床應(yīng)用仍不廣泛。根據(jù)大多數(shù)研究，相對于qPCR，dPCR帶來的最積極的改進是，dPCR提供了無標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量分析，對低負(fù)荷DNA更為敏感。一些證據(jù)表明，dPCR測定法在瘧疾控制程序領(lǐng)域或輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有望用于無癥狀和低密度感染中的寄生蟲血癥測定［42］。dPCR的技術(shù)缺點較少，但是迄今為止，當(dāng)前dPCR平臺的更大復(fù)雜性、較少的通量阻止了它在常規(guī)實驗室中的應(yīng)用。這需要儀器公司和研究人員對dPCR分析進行最佳配置規(guī)劃，以克服當(dāng)前在動物臨床實驗室中實施的局限性。伴隨技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字PCR成本必將逐漸降低，被大家廣泛應(yīng)用。

4 結(jié)語

隨著dPCR技術(shù)與儀器的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，以及大量成熟產(chǎn)品上市應(yīng)用，可以合理地預(yù)期，一旦技術(shù)變得更加普及，dPCR的設(shè)備和試劑的成本（目前高于qPCR的成本）將大大降低，更加簡便、敏感、特異、高效以及可檢測潛伏感染的dPCR分子診斷手段將是未來疫病檢測診斷的發(fā)展趨勢。