植物有效成分提取工藝及其對細菌性奶牛乳房炎的治療作用機制研究進展

張燕飛，王麗芳

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古大學 乳制品質(zhì)量安全控制技術(shù)教育部工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

奶牛乳房炎是奶牛最常見的疾病，全球奶牛乳房炎平均發(fā)病率為50%［1］。奶牛乳房炎會使奶牛產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)下降造成經(jīng)濟損失。據(jù)報道，我國每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟損失達150億元［2］，美國每年因奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟損失超過20億美元［3］。奶牛乳房炎分為兩類，分別是臨床型奶牛乳房炎和亞臨床型奶牛乳房炎?；寂R床型乳房炎的奶牛乳房特征表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛。亞臨床型乳房炎由乳房持續(xù)感染引起，通常無臨床癥狀，乳房無明顯肉眼可見癥狀，乳汁pH值達到7.0以上，乳汁中有大量絮狀物和纖維，氯化鈉占比達到0.14%以上，細菌含量和電導值顯著增加［4］。亞臨床型乳房炎因發(fā)病特征不明顯，在亞臨床型乳房炎篩查、診治過程中通常會耗費大量的時間和資金，造成的損失較大。引起奶牛乳房炎的病原體包括革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，可分為接觸傳染性致病微生物（如金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、支原體）和環(huán)境性致病微生物（如大腸桿菌、腸球菌、凝固酶陰性葡萄球菌）［5］。

目前獸醫(yī)臨床對奶牛乳房炎多采用抗菌藥物療法，但這一方法存在很多弊端，如抗生素亂用、濫用以及休藥期執(zhí)行不嚴格帶來的乳中抗菌藥物殘留、動物源細菌耐藥性產(chǎn)生及擴散，同時也會對人體健康、環(huán)境安全和公共衛(wèi)生安全造成威脅。因此，開發(fā)預防和治療奶牛乳房炎低毒、低殘留、不易誘導細菌產(chǎn)生耐藥性的綠色藥物尤為緊迫。歐盟和美國分別于2003年和2017年起先后做出限用或禁用抗生素作為飼料添加劑的決定，2004年我國國家市場監(jiān)督管理總局公布了植物提取物對人類食品藥品安全無毒副作用，可以作為飼料添加劑使用。植物提取物中的酚類、多糖、生物堿、有機酸、苷類、精油、大蒜素等活性成分均具有一定的抗菌作用［6］。植物提取物作為天然產(chǎn)品的先天優(yōu)勢是低毒少殘留，不會對牛體健康和牛奶品質(zhì)造成損害［7］。黃酮類化合物不僅可以提高反芻動物的生產(chǎn)力，也會提高奶?？箲?yīng)激的能力［8］。植物提取物飼喂、灌服、外敷、注射等不同牛體施用方式的效果差異還有待驗證。目前植物有效成分的提取方法眾多，筆者詳細介紹了回流提取法、超聲波提取法、微波萃取法和超臨界流體萃取法?；亓魈崛》ê统暡ㄌ崛》ǖ膬?yōu)點在于操作簡單、適用范圍廣，微波萃取法的特點在于加熱均勻、操作簡單，超臨界流體萃取分離技術(shù)的優(yōu)點在于選擇性高、溫度溫和。超聲波提取法在提取酚類化合物方面是快速有效的，而微波萃取法可用于提取植物中的總黃酮、總多酚等活性物質(zhì)。同時，筆者論述了細菌性奶牛乳房炎的發(fā)生機理、植物有效成分抗菌機制以及植物提取物抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)利用植物提取物防控奶牛乳房炎提供理論基礎(chǔ)。

1 植物有效成分提取方法

1.1 回流提取法

回流提取法是用乙醇等揮發(fā)性有機溶劑提取，浸提液被加熱，揮發(fā)性溶劑蒸餾出后又被冷凝，流回浸出器浸提藥材，直至有效成分提取完全的方法?？紤]到生物安全性，水和乙醇溶液是傳統(tǒng)的提取溶劑，水作為提取溶劑時，影響實驗結(jié)果的單因素主要為反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和料液比，乙醇溶液作為提取溶劑時，影響實驗結(jié)果的單因素主要為反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、料液比和乙醇濃度。先利用控制變量法進行單因素實驗，確定每個條件下的最佳值，以此為基礎(chǔ)進行正交實驗從而確定最佳實驗條件?；亓魈崛》ㄓ玫降闹饕獙嶒瀮x器為：帶冷凝管的數(shù)顯恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵。通常情況下，乙醇提取物比水提取物具有更高的抗菌活性［9］。賽福丁·阿不拉等［10］運用回流提取法，分別以水和乙醇溶液作為提取溶劑提取了小檗果粗提物，通過體外抑菌實驗，對比了提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌3種奶牛乳房炎常見致病菌的體外抑菌效果。該實驗結(jié)果表明，小檗果水提物對無乳鏈球菌高度敏感，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌中度敏感；其醇提物對無乳鏈球菌和大腸桿菌高度敏感，對金黃色葡萄球菌中度敏感。由此可知，醇提物和水提物的抑菌效果還是有一定差別的。梅兆雄［11］運用回流提取法，以乙醇溶液作為提取溶劑提取了黃花蒿中的青蒿素，通過體外抑菌實驗證明了青蒿素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑菌效果。

1.2 超聲波提取法

超聲波提取法是采用超聲波輔助溶劑進行提取，聲波產(chǎn)生高速、強烈的空化效應(yīng)和攪拌作用，改變植物本身的組織，主要作用于植物粉末顆粒的核殼界面，使細胞破碎，活性成分溶解，在擴散和傳質(zhì)超聲的作用下，提取黃酮類化合物、生物堿和酚類等活性成分［12］。在超聲波提取海藻酸酯的過程中，提取時間較短，溫度較低，但活性成分較高［13］。超聲波提取法的優(yōu)點在于操作簡單、提取效率高、適用范圍廣，缺點在于反應(yīng)過程不穩(wěn)定［14］。超聲波提取的主要影響因素有：提取溶劑的種類、溶劑體積分數(shù)、料液比、反應(yīng)溫度、超聲功率和頻率。所選植物的提取率通過以下方程式計算：產(chǎn)量（%）=（X1×100）/X0，X1表示溶劑蒸發(fā)后的提取物重量，X0表示提取前植物粉末的干重［15］。超聲波提取用乙醇溶液或去離子水提取極性化合物，如黃酮和酚類化合物，尤其在提取酚類化合物方面快速有效［16］。超聲波提取技術(shù)可用于提取總多酚（如板栗殼多酚、蜜柑皮多酚和茶多酚）、單寧、多酚類單體（如丹皮酚、厚樸酚）以及黃酮類化合物（如含羞草總黃酮、黃芩總黃酮和半枝蓮黃酮）［17］。羅磊等［14］運用響應(yīng)面試驗優(yōu)化了超聲輔助提取金銀花葉黃酮的工藝。

1.3 微波萃取法

微波萃取法是利用微波輻射，高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達物料內(nèi)部的微管束和腺胞系統(tǒng)，細胞吸收了微波能，細胞內(nèi)部的溫度將迅速上升，使細胞內(nèi)部的壓力超過細胞壁膨脹所能承受的壓力，導致細胞破裂，其內(nèi)的有效成分自由流出，并在較低的溫度下溶解于萃取介質(zhì)中?，F(xiàn)階段，在微波傳輸過程中，根據(jù)不同物質(zhì)的不同性質(zhì)，會發(fā)生反射穿透和吸收現(xiàn)象，分子在接收到微波輻射能量后，會迅速產(chǎn)生熱效應(yīng)。通過進一步的過濾和分離，即可獲得所需的萃取物［9］。微波產(chǎn)生的電磁場可加速被萃取組分的分子由固體內(nèi)部向固液界面擴散。由于微波的頻率與分子轉(zhuǎn)動的頻率相關(guān)，微波能是一種由離子遷移和偶極子轉(zhuǎn)動而引起分子運動的非離子化輻射能，當它作用于分子時，可促進分子的轉(zhuǎn)動運動，若分子具有一定的極性，即可在微波場的作用下產(chǎn)生瞬時極化并作極性變換運動，從而產(chǎn)生鍵的振動、撕裂和粒子間的摩擦和碰撞，并迅速生成大量的熱能，促使細胞破裂，使細胞液溢出并擴散至溶劑中。微波萃取法用到的主要實驗儀器有電熱恒溫鼓風干燥箱、微波爐、紫外可見分光光度計。影響實驗結(jié)果的主要因素有目數(shù)、乙醇濃度、料液比、微波功率和提取時間。首先進行單因素實驗，然后根據(jù)結(jié)果進行極差分析，最終選出3個最主要的影響因素，再通過設(shè)計響應(yīng)曲面進行優(yōu)化實驗［18］。微波萃取法具有加熱均勻、操作簡單、提取效率高的特點［19］。微波萃取法可用于提取植物中的總黃酮、總多酚等活性物質(zhì)［18-19］。

1.4 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是利用超臨界流體的溶解能力與其密度密切相關(guān)的特性，通過改變壓力或溫度使超臨界流體的密度大幅改變。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性不同、沸點不同和相對分子質(zhì)量大小不同的成分萃取出來。超臨界流體萃取法將傳統(tǒng)的蒸餾和有機溶劑萃取結(jié)合一體，利用超臨界二氧化碳優(yōu)良的溶劑力，將基質(zhì)與萃取物有效分離、提取和純化。超臨界二氧化碳具有類似氣體的擴散系數(shù)、液體的溶解力，表面張力為零，能迅速滲透固體物質(zhì)，具有高效、不易氧化、純天然、無化學污染等特點。超臨界流體萃取分離技術(shù)有選擇性高、溫度溫和等優(yōu)點，從而避免了熱降解和溶劑殘留，與傳統(tǒng)的溶劑萃取相比，超臨界流體萃取最嚴重的缺點之一是需要更高的設(shè)備成本［20］。實驗裝置為超臨界流體萃取器，該萃取器包含一個2 L圓柱體萃取池、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀。超臨界流體萃取多用于提取植物的親脂部分。Garcia-Risco等［21］運用超臨界流體萃取分離技術(shù)提取菊科和乳草科植物中的酚類化合物，實驗提取壓力為140 bar，提取溫度為40℃，二氧化碳流量為70 g/min，提取時間為180 min，用乙醇收集分離得到的油樹脂。然后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醇，之后采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent Technologies7890A）分析超臨界萃取物的化學成分。實驗結(jié)果表明，乳草科植物提取物的酚類化合物含量高于菊科植物提取物。乳草科植物富含酚類單萜和倍半萜（約32%的香脂和53%的馬郁蘭），環(huán)醇含量為7%～12%。而菊科植物揮發(fā)油中含有大量的二環(huán)醇和三環(huán)醇（52%的蓍草和32%的萬壽菊），幾乎不含酚醇。

2 細菌性奶牛乳房炎的發(fā)生機理

乳房炎的發(fā)生有多種因素，研究表明，奶牛乳房炎的發(fā)生與病原微生物感染、機體代謝失衡、氧化應(yīng)激、腸道菌群失衡都有關(guān)系。細菌感染引起的奶牛乳房炎難以治療主要是由于以下幾個因素：①微生物細胞壁成分中的蛋白質(zhì)和磷壁酸聚合物，在黏附過程中發(fā)揮作用，這是侵入宿主細胞的先決條件［22］。②微生物可以產(chǎn)生多種毒力因子，如毒素、凝固酶和生物膜，這些被認為是乳房炎發(fā)病的主要毒力因子［23］。

金黃色葡萄球菌是奶牛傳染性乳房內(nèi)感染的重要病原，金黃色葡萄球菌引起的乳腺炎是幾種毒力因子產(chǎn)生的結(jié)果，這些毒力因子可以在不同的致病方式中起作用［23］。金黃色葡萄球菌的毒力因子大致可分為兩大類，一類是作為毒力因子的表面局部結(jié)構(gòu)成分，另一類是分泌的毒力因子，它們共同幫助金黃色葡萄球菌逃避宿主的防御并定植于乳腺［24］。作為毒力因子的一些表面局部結(jié)構(gòu)成分包括膜結(jié)合因子（膠原結(jié)合蛋白、纖維蛋白原結(jié)合蛋白、彈性蛋白結(jié)合蛋白和青霉素結(jié)合蛋白）、細胞壁結(jié)合因子（蛋白A、β-內(nèi)酰胺酶和蛋白酶）以及細胞表面相關(guān)因子（莢膜和黏液）［25］。一些已知的分泌性毒力因子是毒素（葡萄球菌腸毒素、中毒性休克綜合征毒素、溶血素和脫落素）和酶（凝固酶、葡萄激酶、脫氧核糖核酸酶、磷酸酶、脂肪酶和磷脂酶）。除了特定的毒力因子外，金黃色葡萄球菌還通過不同的機制或途徑，如生物膜的形成、對乳腺上皮細胞的黏附和侵襲、小菌落變體（small colony variant，SCV）的形成等，使其能夠抵抗宿主防御［24］。其中一些毒素被認為是超抗原，可以增強宿主的免疫反應(yīng)性。生物膜的形成可以促進金黃色葡萄球菌在乳房中的黏附和定植，細菌不斷地增殖和積累，這將保護金黃色葡萄球菌免受奶牛的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的影響，以及抵抗抗生素的影響［26］。金黃色葡萄球菌菌株產(chǎn)生的莢膜多糖增強了其對巨噬細胞的抵抗力［27］。對微生物持久性機制的透徹理解將有助于開拓新的治療方法。在感染的初始階段，中性粒細胞會從血管移動到感染部位。中性粒細胞的數(shù)量是炎癥感染過程中的一個關(guān)鍵因素，在牛乳腺炎期間，遺傳會影響中性粒細胞的數(shù)量和濃度。之后，模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）的機制被激活，通過其特殊的傳感器對病原體進行重組，最終激活免疫反應(yīng)。PRRs包括Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）、NOD樣受體（NOD-like receptor，NLR）和RIG樣受體（RIG-like receptor，RLR），它們識別各種病原體基序，也稱為微生物相關(guān)分子模 式 （microbial-related molecular patterns，MAMPs）［28］。

在大腸桿菌引起的奶牛乳房炎發(fā)病過程中，一個非特異性但起到關(guān)鍵作用的因素是內(nèi)毒素或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）［29］，一方面它誘導防御機制，另一方面它是一種有毒化合物。反芻動物內(nèi)毒素的病理生理效應(yīng)是劑量依賴性的，并引起多種代謝和臨床癥狀［30］。大腸菌群的毒性和對炎癥反應(yīng)的誘導取決于它們在機體內(nèi)復制和破壞細胞結(jié)構(gòu)的能力。在增殖、破壞和裂解過程中，它們釋放一種外膜成分，即內(nèi)毒素或脂多糖，這是一種耐高溫分子，是革蘭陰性病原體細胞壁的獨特結(jié)構(gòu)成分。許多研究表明，大腸桿菌在乳腺的致病性與LPS有關(guān)。這是基于以下事實：①LPS是大腸桿菌在泌乳竇內(nèi)裂解和生長的結(jié)果。一旦細菌到達乳頭池，它們會迅速生長，每2 h細菌數(shù)量增加8～10倍，釋放大量LPS。②LPS誘導的局部體征與大腸桿菌乳腺炎相同。③多黏菌素B（一種LPS中和劑）預處理或同時給藥可減少和延緩腹腔注射脂多糖引起的發(fā)熱和白細胞減少反應(yīng)，并防止血漿鋅減少。反芻動物在革蘭陰性菌感染過程中觀察到許多病理生理變化，如發(fā)熱、循環(huán)白細胞數(shù)量的變化（白細胞減少或增多）、補體激活、巨噬細胞激活、靜脈通透性增加、血漿代謝物、礦物質(zhì)、急性期反應(yīng)物和激素水平的變化等［30］。

3 植物有效成分抗菌機制

奶牛乳房炎難以治療的一個原因在于微生物可以產(chǎn)生多種毒力因子，如毒素、凝固酶和生物膜，而微生物產(chǎn)生毒力因子依賴微生物群體感應(yīng)的調(diào)控作用，因此干擾微生物群體感應(yīng)對毒力因子的產(chǎn)生是治療奶牛乳房炎的一個思路。群體感應(yīng)是細菌能自發(fā)產(chǎn)生、釋放一些特定的信號分子，并能感知其濃度變化，調(diào)節(jié)微生物的群體行為的化學通信系統(tǒng)。群體感應(yīng)不僅有助于細菌的生存，還可以在種群水平上組織細菌的活動，包括協(xié)調(diào)分泌毒力因子，形成生物膜。在革蘭陰性菌中，群體感應(yīng)的自身誘導劑分子是?；呓z氨酸內(nèi)酯，而在革蘭陽性菌中，它們是自誘導信號肽。群體感應(yīng)的基本機制包括可擴散信號與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相互作用，直接或間接激活傳感器激酶［31］。Ta等［32］發(fā)現(xiàn)，具有顯著抗群體感應(yīng)和抗生物膜活性的植物屬于十字花科、野牡丹科、洋酢漿草科、無患子科和苦木科。葉下珠（葉下珠科）、茄子（茄科）和茄子黃果（茄科）的植物部位對歐文菌和青枯假單胞菌表現(xiàn)出群體感應(yīng)抑制作用［33］。從肉豆蔻干樹皮丙酮提取物的乙酸乙酯可溶部分中分離出的巨型糖苷酮對大腸桿菌表現(xiàn)出抗群體感應(yīng)活性［34］。濃度為63.5 g/mL的小檗堿能抑制克雷伯菌的生物被膜生長［35-36］，從蘿芙木屬中分離得到的生物堿對克雷伯菌生物被膜有抑制作用［37］。天竺葵精油對金黃色葡萄球菌的生物被膜有較強的殺滅作用［38］。丁香提取物的主要成分丁香酚（丁香酚結(jié)構(gòu)式見圖1）可抑制大腸桿菌毒力因子的產(chǎn)生，包括紫羅蘭素、彈性蛋白酶、綠色素和生物膜的形成［39］。另外，三個丁香酚衍生物異丁香酚（異丁香酚結(jié)構(gòu)式見圖2）、2-甲氧基-4-丙基酚（2-甲氧基-4-丙基酚結(jié)構(gòu)式見圖3）和4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-乙基愈創(chuàng)木酚結(jié)構(gòu)式見圖4）具有抗生物膜活性，表明丁香酚苯環(huán)上的C-1羥基單元、C-2甲氧基單元和C-4烷基或烷烴鏈對抗生物膜活性有貢獻［40］。植物單寧酸通過轉(zhuǎn)糖基酶抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成［41］。Maria等［26］研究了反膠束法制備的殼聚糖納米粒（chitosan nanoparticles，Ch-NPs）的抗菌性能，發(fā)現(xiàn)開發(fā)的納米制劑對乳房炎病原體具有劑量依賴性的抗菌活性。此外，不同的實驗證實了Ch-NPs的抗菌效果比用于制備這些納米復合材料的天然聚合物的抗菌效果更好。Ch-NPs對細菌細胞造成膜損傷，抑制細菌生物膜的形成，但不影響牛細胞的活力。這些發(fā)現(xiàn)顯示了Ch-NPs作為治療牛乳腺炎藥物的巨大潛力。Hu等［42］研 究 表 明 山 蒼 子 精 油（Litsea cubeba essential oil，LC-EO）對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細胞膜（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）有破壞作用，可使細胞內(nèi)生物大分子滲漏，最終導致細菌死亡。此外，經(jīng)LC-EO處理后，MRSA的己糖單磷酸途徑（hexose monophophate pathway，HMP）及其關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性也受到抑制，從而抑制了MRSA的呼吸代謝。紫外吸收光譜結(jié)果表明，LC-EO的主要成分檸檬醛可以與MRSA的DNA形成嵌合體，從而抑制其生物活性。筆者總結(jié)了根據(jù)DNA/RNA、三磷酸腺苷（adenosine triphosphatese，ATPase）、可溶性蛋白、β-半乳糖苷酶的含量判別作用機制見表1［42］。DNA/RNA、三磷酸腺苷、可溶性蛋白、β-半乳糖苷酶是細胞存活至關(guān)重要的生物大分子。260 nm波長處的光密度變化可以揭示細胞內(nèi)物質(zhì)的核酸。經(jīng)LC-EO處理后260 nm波長處的值增加，說明被測細菌的DNA和RNA都有泄漏。另外，添加DAPI（4，6-二脒基-2-苯基吲哚）可以穿透細胞并與核酸反應(yīng)形成熒光信號［43］。與對照組相比，LCEO處理MRSA后的熒光顯微照片細胞熒光斑點圖的數(shù)量和強度明顯降低。激光共聚焦顯微鏡圖譜分析結(jié)果表明，LC-EO處理在破壞細胞膜后可導致DNA泄漏。酶在催化細胞內(nèi)各種生理代謝過程中起著重要作用，因此，細胞內(nèi)幾乎所有的代謝過程都需要酶催化來維持生命活動。為進一步評價LC-EO對MRSA的破壞作用，采用ATP生物發(fā)光法測定LC-EO處理前后MRSA細胞中4種典型ATP酶Ca2+/Mg2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性的影響。Ca2+/Mg2+-ATP酶在肌肉收縮后能轉(zhuǎn)運鈣，其活性依賴于ATP和Mg2+的結(jié)合；Na+/K+-ATP酶存在于細胞膜上，幫助細胞內(nèi)鈉離子交換細胞外鉀，與濃度梯度相反。在LC-EO處理過程中，4種ATP酶的活性均下降，可判斷LC-EO處理可以有效降低MRSA的酶活性，這被認為是導致細菌死亡的一個重要因素［44］。有機大分子蛋白質(zhì)是細胞的基本有機體，是生命活動的關(guān)鍵元素。用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和蛋白檢測試劑盒分析LC-EO對MRSA蛋白的影響，可溶性蛋白的SDS-PAGE結(jié)果顯示，LC-EO處理過程中蛋白質(zhì)條帶減少，表明LC-EO可能導致蛋白質(zhì)通過MRSA細胞膜滲漏。β-半乳糖苷酶是微生物的主要能量提供者，它催化乳糖水解成單糖［45］。在β-半乳糖苷酶的催化下，鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG）可以穿透細胞膜進一步水解為鄰硝基苯酚，紫外分光光度計可在405 nm處檢測到鄰硝基苯酚的存在。LC-EO處理后OD405nm值下降表明其有效地抑制了ONPG的水解。結(jié)果表明，LC-EO能有效抑制金黃色葡萄球菌β-半乳糖苷酶的活性，且隨著濃度的增加，抑制作用增強［42］。Gonelimali等［15］測量了植物提取物處理后金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細胞內(nèi)pH值和膜電位的變化。結(jié)果表明，植物提取物顯著影響革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的細胞膜，表現(xiàn)為pH值的下降以及細胞膜超極化。Burt等［46］證明百里香的抗菌性能是由于其含有的百里香酚可以通過疏水鍵和氫鍵與膜蛋白結(jié)合，從而改變膜的通透性。

圖1 丁香酚［40］

圖3 2-甲氧基-4-丙基酚［40］

圖4 4-乙基愈創(chuàng)木酚［40］

表1 DNA/RNA、三磷酸腺苷、可溶性蛋白、β-半乳糖苷酶的含量判別作用機制[42]

4 植物提取物抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用

植物提取物中的酚類、多糖、生物堿、有機酸、苷類、精油等活性成分均具有調(diào)節(jié)免疫和抗炎抑菌的作用。已有多種植物成分被證明具有防控奶牛乳房炎的作用，大蒜中的大蒜素［47］、莪術(shù)中的生物 堿 和 黃 酮［48］、連 翹 中 的 連 翹 苷［49］、白 頭 翁 中 的白頭翁皂苷［50］、香菇中的多糖［51］、黃花蒿中的青蒿素［11］都對奶牛乳房炎具有良好的防控作用。

多酚化合物能夠影響細胞內(nèi)信號通路，如NF-κB（nuclear factorκB）、MAPK（mitogen-activated protein kinases）和JAK-STAT（just another kinase，signal transducer and activator of transcription），這些信號通路負責產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細胞介素IL-1β和IL-12，參與產(chǎn)生活性物質(zhì)的酶，如誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和超氧化物脫氫酶（superoxide dehydrogenase，SOD），以及參與產(chǎn)生二十烷類化合物的酶，如環(huán)氧酶（cyclooxygenase，COX）和脂合酶（lipoxygenase，LO）［28］。一些研究認為多酚可能通過抑制Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Laura等［52］在體外評估可可多酚提取物處理的人外周血的單核細胞（tamm horsfall protein，THP-1）時，證明可降低促炎巨噬細胞（M1巨噬細胞）的炎癥反應(yīng)，促進抗炎細胞TNF-α和IL-12的分泌，從而誘導表型。減少巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α和IL-6，以應(yīng)對干擾素-γ和脂多糖的刺激。沈留紅等［50］通過對患病奶牛進行頸部肌肉注射白頭翁皂苷B4的試驗，試驗證明白頭翁皂苷B4可顯著促使臨床型奶牛乳房炎免疫因子IgA、IgD、IgG、IgE、IgM和血清炎性因子SAA、CRP、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、HP恢復到健康水平。

5 小結(jié)

植物提取物的提取率受提取時間、提取溫度、提取溶劑的極性以及提取方法的影響較大，因此，必須通過確定合適的溶劑類型、方法和提取條件來優(yōu)化每個植物樣品的提取過程，以獲得最大的得率。植物提取物的提取方法也可以采取多種提取方法相結(jié)合以提高提取效果。回流提取結(jié)合超聲預處理對酚類物質(zhì)的提取效果優(yōu)于超聲提取和單獨回流提?。?］。Garcia-Risco等［21］研究比較了二氧化碳超臨界流體萃取、綠色溶劑［乙醇、乙醇∶水（50∶50）］超聲波提取2種工藝，認為所研究的品種，超臨界提取物的抗氧化活性最低，乙醇提取物的抗氧化活性最大。由于實驗過程繁瑣復雜且會受到很多不確定因素的干擾，從而影響實驗結(jié)果，因此，使用模型計算機模擬實驗過程以取得最佳實驗方案會是未來趨勢。Oiagaray等［8］采用了響應(yīng)面方法（Box-Behnken Design，BBD）對提取蒲公英中的酚類化合物進行設(shè)計和分析，證明了該模型成功地用于預測萃取條件，優(yōu)化酚類化合物的提取。通過應(yīng)用BBD，可以用較少的測試評估大量的參數(shù)及其相互作用，從而減少了工作量，同時研究發(fā)現(xiàn)有利于改進工業(yè)流程以提高大規(guī)模萃取系統(tǒng)的效率。

植物提取物對細菌性奶牛乳房炎的防控作用是多方面多因素作用的結(jié)果，一方面植物提取物的活性成分可以通過提高牛體免疫力，刺激免疫因子和血清炎性因子恢復到正常水平來抵抗乳房炎的發(fā)生；另一方面也可以作用于主要致病菌的毒力因子，破壞致病菌的細胞結(jié)構(gòu)，阻斷其繁殖途徑達到抑菌效果。研究植物提取物的有效成分，也可以對有效成分的分子式進行進一步探討，明確主要作用基團，以期對抑菌成分進行有效改進，以達到抑菌效果最大化。Wang等［53］系統(tǒng)地繪制了黃酮的抗炎結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系，并與黃酮、黃烷醇和異黃酮進行交叉比較。羥基（-OH）對黃酮的抗炎功能必不可少，C-5和C-4′位置的-OH增強抗炎活性，而C-6、C-7、C-8和C-3′位置的-OH減弱其活性。此外，C-3和b環(huán)上的C2-C3單鍵和-OH破壞了黃酮苷元的活性。Wu等［54］的研究也證實了這一結(jié)論。黃酮分子式見圖5。這一發(fā)現(xiàn)為今后研究提供了新思路，可以根據(jù)活性成分的分子結(jié)構(gòu)，明晰基團對于抗炎功能的作用，整合不同成分的有效基團，開發(fā)出全新無毒的抗炎物質(zhì)，以提高生產(chǎn)效率。

圖5 黃酮分子式［54］