牙周組織低氧環(huán)境與牙周炎發(fā)生發(fā)展的研究進展

唐 宋， 張曉南

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室·重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室，重慶 401147)

根據(jù)《第四次中國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報告》，我國成年人的牙周健康率僅約9.1%，且牙周炎患病率與年齡呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。生理情況下牙周膜血流比牙髓或腦血流稍低，其氧含量為2.9%～5.7%，且易受咬合力的影響[1]。牙周炎是低氧相關(guān)疾病之一，近年來，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)牙周組織發(fā)生病變時，因局部炎性因子釋放和組織代謝增強引起氧的供求失衡，以及炎癥環(huán)境引起血液微循環(huán)破壞，均可導(dǎo)致局部牙周組織處于相對缺血、低氧狀態(tài)，而深牙周袋和牙周致病菌可進一步降低牙周組織的氧張力[1-2]。本綜述探討牙周組織低氧與牙周炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及炎性分子機制，為牙周炎的防治提供一定的臨床借鑒。

1 低氧與缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1， HIF-1)

缺氧環(huán)境下機體可通過多種生物學(xué)變化和生化反應(yīng)來提高細胞氧合及存活率[3]，包括促血管新生、改善細胞代謝以及調(diào)控細胞活性相關(guān)分子表達等。HIF是缺氧介導(dǎo)相關(guān)事件(包括炎癥、腫瘤等)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，主要包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，而在缺氧反應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)蛋白是異源二聚體HIF-1，對于HIF-2及HIF-3的研究還需要更進一步地深入。

HIF-1是哺乳動物缺氧反應(yīng)中最重要的響應(yīng)分子之一，它是由兩個亞單位組成的異二聚體： 一個α亞單位，與氧濃度呈負相關(guān)；一個β亞單位，與氧濃度無明顯相關(guān)[4]。HIF-1α和HIF-1β均包含兩種特殊結(jié)構(gòu)： 堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(basic helix-loop-helix)和PAS結(jié)構(gòu)域，其中這兩種結(jié)構(gòu)的羧基半端是HIF-1與DNA結(jié)合的位點?！叭毖鯌?yīng)答元件”(hypoxia response element， HRE)是一類特異性的DNA序列，通過與HIF-1結(jié)合而引起HIF-1相關(guān)靶基因表達的上調(diào)[4]。常氧條件下HIF-1α被脯氨酸羥化酶迅速降解，而低氧干擾脯氨酸羥化酶介導(dǎo)的HIF-1α降解，導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定化，并通過兩個核定位信號在低氧細胞的細胞核中積累，從而與HIF-1β形成異源二聚體，隨后激活HIF-1途徑，然而有研究表明HIF-1β并不是HIF-1α核內(nèi)積累的必要條件[5]，因此猜測HIF-1α可獨立于HIF-1β發(fā)揮功能，其機制需要進一步研究。低氧是包括炎癥、腫瘤等在內(nèi)很多疾病的共同特征，牙周炎是近年來發(fā)現(xiàn)的低氧性疾病之一，揭示低氧與牙周炎的相互關(guān)系對牙周病防治意義重大。

2 低氧對牙周細胞增殖能力的影響

牙周細胞可參與牙周組織形成再生及免疫分泌功能，對牙周組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用，但在牙周炎和正畸治療等過程中，牙周組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，牙周組織易發(fā)生缺氧性改變，明顯影響牙周細胞的正常增殖及遷移能力。研究發(fā)現(xiàn)，低氧與牙周細胞增殖作用存有時間依賴性關(guān)系，且與不同氧濃度相關(guān)。在重度缺氧(1%O2)、中度缺氧(2%O2)和輕度缺氧(5%O2)條件下培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblast, hPLF)，發(fā)現(xiàn)其增殖率在初期(24 h)增加而后期(48、72 h)下降，且隨氧濃度的降低其增殖抑制的現(xiàn)象出現(xiàn)越早且越明顯，牙周膜細胞也有類似的表型[6-7]。但有研究稱短暫缺氧(1 h、2%O2)即可出現(xiàn)人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)增殖活性下降[8]。觀察和培養(yǎng)的方式、缺氧條件的時間框架以及細胞類型的差異都可以導(dǎo)致這些特異性研究結(jié)果產(chǎn)生。在缺氧條件下，人牙周膜韌帶細胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)與細胞呼吸代謝密切相關(guān)的蛋白組學(xué)(包括LDHA、GAPDH等)發(fā)生顯著變化[6]，這些代謝變化為細胞適應(yīng)性反應(yīng)提供了必需的能量，可部分解釋細胞增殖變化的原因。

嚴(yán)重炎癥和組織破壞的病變往往具有較低的成纖維細胞密度和較高的炎性細胞浸潤，牙周炎病變越嚴(yán)重，牙齦成纖維細胞的數(shù)量和功能也明顯降低，且成纖維細胞增殖分化和遷移能力隨著年齡的增長而下降[9-10]。體外研究表明，在低氧培養(yǎng)環(huán)境中牙周膜韌帶細胞和成牙骨質(zhì)細胞的多種細胞功能(如增殖分化和細胞因子產(chǎn)生等)發(fā)生改變[11]。低氧對牙周細胞增殖分化及遷移的影響是通過多種信號通路的激活而發(fā)生的，通過Wnt、Notch和Shh等信號途徑，HIF-1α在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和多能性方面發(fā)揮重要作用[12]。低氧可能通過調(diào)節(jié)牙周細胞的增殖分化及遷移促進組織的修復(fù)再生，其機制研究是目前熱點，這可能為牙周組織的新生提供新的策略。

3 低氧對牙槽骨的影響

低氧對牙槽骨的影響一方面是由于多種牙周組織細胞(如hPDLCs、HGFs等)因低氧刺激而產(chǎn)生促炎介質(zhì)及細胞因子(IL-1β、IL-6、MMP、PGE2、NO和TNF-α等)，從而打破牙槽骨正常的代謝平衡，引起骨和膠原的代謝紊亂[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α升高后通過上調(diào)Smad泛素調(diào)節(jié)因子1(Smurf1)水平誘導(dǎo)骨丟失[14]，而牙周炎所致骨丟失的具體機制仍然需要深入研究。亦有研究發(fā)現(xiàn)，PDLCs的增殖和成骨分化因低氧而抑制[15]。更多研究表明低氧激活PDLSCs、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化[7，8，16]。由于細胞活力、種類及觀察培養(yǎng)方法的差異可能導(dǎo)致了低氧對牙周細胞成骨分化的影響呈現(xiàn)出不同的研究結(jié)果。

對低氧介導(dǎo)的骨代謝機制進行研究是理解牙周炎所致牙槽骨丟失機制的重要途徑，研究發(fā)現(xiàn)多條骨代謝相關(guān)通路的激活與低氧相關(guān)。PDLSCs作為牙周組織修復(fù)再生的重要來源，低氧通過MEK/ERK和p38MAPK信號通路可促進PDLSCs成骨分化，而MAPK及ERK信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)對成骨細胞分化、成骨細胞相關(guān)基因表達和MSC向成骨細胞系轉(zhuǎn)化也起關(guān)鍵作用[7-8]，p38MAPK對缺氧的反應(yīng)比ERK更迅速，這說明p38MAPK在低氧誘導(dǎo)的PDLSCs成骨分化中可能發(fā)揮更重要的作用。另外，通過體外低氧模擬實驗發(fā)現(xiàn)hPDLCs中HIF-1α表達增多，隨后炎性介質(zhì)表達通過PI3k、p38、ERK、JNK、PKC和NF-κB途徑而上調(diào)[17]，從而影響骨和膠原代謝，這與低氧下牙周細胞中促炎介質(zhì)及細胞因子表達增加的趨勢一致。已有研究表明低氧環(huán)境下HIF-1途徑參與骨的形成和改建，而且認為HIF-1α在成骨耦合與血管新生中起著重要的調(diào)控作用[18]。動物實驗發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因敲除小鼠的骨小梁體積和骨形成率明顯降低，其皮質(zhì)骨也發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，成骨細胞分化實驗中發(fā)現(xiàn)成骨細胞分化潛能被過表達HIF-1α活性形式所抑制[19-20]；Hirai等發(fā)現(xiàn)HIF-1的激活可下調(diào)NF-κB、促炎/骨吸收因子等，抑制炎癥性骨丟失的上游基因表達水平[21]。這些結(jié)果說明HIF-1α在牙周組織低氧環(huán)境下對骨代謝的重要調(diào)控作用，且隨著HIF-1α水平的改變其生理功能也會發(fā)生相應(yīng)變化，而其機制有待進一步研究。另外，NF-κB通路是炎癥中骨吸收和破骨細胞產(chǎn)生的重要通路，且NF-κB是破骨細胞活性和促炎細胞因子產(chǎn)生的核心轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)低氧可影響細胞中NF-κB和骨保護素的表達水平，進一步促進牙周炎的進展[22-23]。許多研究證明低氧在牙周組織的細胞活力和骨重塑中的關(guān)鍵作用，但低氧是否促進骨形成或骨吸收仍然存在爭議。我們認為低氧初期對牙槽骨的影響以促進作用為主，而后期以吸收作用為主。牙周炎相關(guān)骨吸收與低氧應(yīng)激存在密切關(guān)系，這為牙周炎導(dǎo)致的骨吸收提供了新的機制，同時為預(yù)防和治療牙槽骨丟失提供新的方向。

4 低氧對人牙周細胞凋亡和自噬的影響

細胞凋亡(apoptosis)是基因控制的細胞程序性死亡，Bnip3基因被認為是缺氧狀態(tài)下的初級促死亡基因(primary pro-death gene)，能在低氧環(huán)境下誘導(dǎo)表達。自噬(autophagy)是一種“自食”的胞內(nèi)機制，整個自噬過程主要受雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1和Beclin1復(fù)合體調(diào)節(jié)，LC3蛋白是目前常用的自噬標(biāo)記蛋白[24]。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α依賴性途徑和HIF-1α非依賴性途徑是低氧誘導(dǎo)自噬發(fā)生的兩條主要途徑，已證明缺氧條件下hPDLCs的自噬和凋亡與HIF-1α的激活明顯相關(guān)[1，25]。HIF-1通路的激活是抑制間充質(zhì)干細胞凋亡的有效保護途徑，低氧時凋亡抑制因子核仁蛋白3(apoptosis repressor nucleolar protein 3, NOL3)表達增加[26-27]，而自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值因低氧刺激升高，提示低氧環(huán)境對細胞凋亡起到一定的抑制作用，且在缺氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的是細胞自噬。低氧培養(yǎng)環(huán)境中常發(fā)生成骨細胞及hPDLCs中線粒體腫脹和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，不僅導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)，還誘導(dǎo)線粒體的自噬作用和細胞凋亡活性，通過抑制線粒體的自噬作用可降低因低氧所誘導(dǎo)的凋亡活性[28]，這可能是導(dǎo)致細胞能量代謝和蛋白合成改變的重要原因，但其具體機制還需深入研究。研究根尖周病變時發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、HIF-1α和BNIP3的表達均增加[25]，提示低氧可通過調(diào)控相關(guān)蛋白表達介導(dǎo)自噬。

另外，在低氧環(huán)境下泛素相關(guān)酶和熱休克蛋白的表達參與自噬和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)泛素結(jié)合酶E2、泛素相關(guān)蛋白1和泛素樣蛋白5等可靶向蛋白酶體降解的底物[29]，這可能對低氧誘導(dǎo)的細胞自噬起到一定的促進作用。HSPA8作為伴侶介導(dǎo)的自噬中一個重要組成部分，可通過它將蛋白質(zhì)導(dǎo)入溶酶體，還能與HSPβ1和HSPA5等蛋白廣泛作用，協(xié)同發(fā)揮抗hPDLCs凋亡作用[30]，亦有研究發(fā)現(xiàn)HSP60也參與了牙周炎進展和牙齒發(fā)育[31]。凋亡和自噬通常是細胞對刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，關(guān)于牙周炎所致低氧引起的牙周細胞凋亡和自噬機制還需要進一步研究，以求從一方面揭示牙周炎的發(fā)病機制。

5 低氧對牙周組織血管的影響

慢性炎癥引起牙周組織發(fā)生微循環(huán)障礙、低灌注，從而導(dǎo)致牙周組織低氧微環(huán)境形成。低氧能調(diào)節(jié)血管張力，被認為是血管生成的有利刺激，已證明血管生成與低氧聯(lián)系緊密[32]，其中VEGF和HIF-1在該過程中發(fā)揮核心調(diào)控作用。低氧環(huán)境下HIF-1的激活和聚集可導(dǎo)致VEGF的轉(zhuǎn)錄激活，從而引導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移到低氧環(huán)境中，促進血管新生以增加高氧血液向缺氧組織的輸送，VEGF作為血管生成的主要標(biāo)志物，也是HIF-1α主要的下游靶基因[33]。有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路是VEGF調(diào)控的關(guān)鍵信號級聯(lián)，COX2/PGE2/VEGF信號通路可能參與了缺氧條件下內(nèi)皮細胞的遷移和旁分泌[8，34]。在低氧炎癥微環(huán)境下，活性HIF-1的不斷產(chǎn)生和核聚集還引發(fā)其下游基因的廣泛轉(zhuǎn)錄，參與血管生成及舒縮調(diào)節(jié)、細胞生長及凋亡、屏障及離子轉(zhuǎn)運功能，HIF-1α也被認為在成血管與成骨的耦合關(guān)系中起著重要的調(diào)節(jié)作用[18]。與健康牙齦相比，牙周炎組織中VEGF和HIF-1α的表達有明顯增加[35]，進一步說明VEGF和HIF-1α在牙周炎組織血管再生中起關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)HIF-1α和HIF-2α在組織血管調(diào)控方面具有互補作用： HIF-1α促進血管生長，HIF-2α促進血管成熟[36-37]。另外，牙周致病菌來源的肽聚糖導(dǎo)致牙周組織細胞TLR2激活，而炎癥環(huán)境下TLR2激活可顯著增強HIF-1α和BMP-2的表達，從而上調(diào)其下游成骨和血管生成相關(guān)基因的表達，以促進牙槽骨骨血管生成和組織血管化[16]，這些研究結(jié)果提示牙周致病菌對牙周血管生成發(fā)揮間接作用。

研究表明，VEGF表達上調(diào)和血管新生在炎癥、傷口愈合和骨重塑中發(fā)揮重要的作用[38]。炎癥牙周組織的血管新生被認為是牙周組織低氧下的適應(yīng)性表現(xiàn)。低氧培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞時發(fā)現(xiàn)，細胞早期增殖情況與常氧組相似，但延長缺氧后其增殖活性與前面提及的PDLCs具有相似的表型[39]。這些研究提示低氧對血管形成并非單一的促進作用，而是在培養(yǎng)條件發(fā)生改變的情況下，其對機體的生理功能影響亦發(fā)生變化。

6 低氧與lncRNAs對牙周組織的影響

通常把長度大于200個核苷酸的非編碼RNA稱為lncRNA，其在維持干細胞分化和多能性方面具有重要生理作用[40]。牙周炎屬于低氧性疾病，而低氧與眾多l(xiāng)ncRNAs的表達存在密切聯(lián)系。低氧下不同lncRNA的生物學(xué)行為不同。如針對缺血性中風(fēng)的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-GAS5、lncRNA NR_120420、lncRNA NKILA在糖氧剝奪模擬條件下表達上調(diào)，并加重細胞凋亡，其作用機制還與mi-RNAs、si-RNAs以及NF-κB信號通路密切相關(guān)[41-43]；而lncRNA ANRIL的表達在糖氧剝奪后明顯降低，促進其表達可減輕糖氧剝奪所誘導(dǎo)的細胞損傷[44]。另外，lncRNA MALAT1可減輕糖氧剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細胞凋亡，降低低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能紊亂[45-46]。研究對牙周炎患者和正常人牙周組織樣本中的lncRNA進行芯片篩查，發(fā)現(xiàn)lncRNA-01126在牙周炎組織中特異性高表達，提示低氧與某些lncRNA的差異性改變及生理功能存在關(guān)聯(lián)[47]。眾多研究還表明疾病的發(fā)展和預(yù)后與lncRNAs的表達有關(guān)，而lncRNAs的表達與組織低氧聯(lián)系緊密，如胃腸道腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷、腎細胞癌等[48-50]，其潛在機制的研究仍在不斷深入。

7 展 望

牙周炎作為眾多低氧性疾病中的一種，牙周組織低氧環(huán)境對牙周炎的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。一方面，低氧導(dǎo)致機體產(chǎn)生損害性應(yīng)激(產(chǎn)生炎性因子和自由基、引起細胞自噬與凋亡、激活炎癥信號通路等方式)，從而導(dǎo)致牙周組織破壞。另一方面，機體在低氧條件下發(fā)生適應(yīng)性反應(yīng)(包括牙周細胞的成骨分化以促進牙槽骨再生、缺氧耐受增強、細胞代謝相關(guān)酶活性提高以及牙周血管再生與改建等)。低氧與牙周炎有著緊密的聯(lián)系，近年來關(guān)于低氧與lncRNAs的研究也逐漸引入到牙周疾病方面。本綜述主要探討牙周組織低氧環(huán)境對牙周炎發(fā)生發(fā)展的影響及相關(guān)機制，希望為牙周炎的預(yù)防和治療提供新的思路。