LncRNA在多能干細(xì)胞早期譜系分化中的作用與機(jī)制研究進(jìn)展

張曉宇， 張 赫

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，上海 200123； 2. 同濟(jì)大學(xué)教育部細(xì)胞干性與命運(yùn)編輯前沿科學(xué)中心，上海 200092；3. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)基地，上海 200123)

多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells， PSCs)是一類具有自我更新、自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞induced pluripotent stem cells, iPSC)，是組織、器官修復(fù)再生的重要細(xì)胞來源[1]。根據(jù)發(fā)育生物學(xué)原理和體外誘導(dǎo)優(yōu)化試驗(yàn)，目前已經(jīng)建立了PSCs向外胚層、中胚層和內(nèi)胚層等3個(gè)胚層以及各種功能性細(xì)胞分化的體系[2-3]。PSCs的早期分化狀態(tài)決定了細(xì)胞的終端分化潛力，因此調(diào)節(jié)和監(jiān)測(cè)干細(xì)胞分化為特定功能性的末端分化細(xì)胞，是干細(xì)胞領(lǐng)域的重要科學(xué)問題，探索PSCs的早期分化機(jī)制將有利于更高效產(chǎn)生末端功能性細(xì)胞。由于干細(xì)胞分化調(diào)控研究的局限性，PSCs的末端分化效率和成功率始終是阻礙干細(xì)胞應(yīng)用的難題。因此，進(jìn)一步探索調(diào)控干細(xì)胞早期譜系分化的新因素，將有利于闡明PSCs的早期譜系分化調(diào)控機(jī)制。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是長度大于200 nt的非編碼RNA。根據(jù)lncRNA的轉(zhuǎn)錄來源，可分為基因間lncRNA、內(nèi)含子區(qū)lncRNA、雙向啟動(dòng)子lncRNA、反義lncRNA、增強(qiáng)子lncRNA、正義鏈或反義鏈lncRNA[4-5]；按作用機(jī)制可以分為信號(hào)分子、誘餌分子、引導(dǎo)或支架分子[6-7]。研究表明，lncRNA廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控、通路激活、染色質(zhì)構(gòu)象改變進(jìn)而調(diào)控腫瘤發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等眾多生物學(xué)過程。PSCs的早期分化機(jī)制復(fù)雜，常受到染色質(zhì)狀態(tài)、多能性因子、非編碼RNA等多種因素的調(diào)控。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)80%的人類基因組序列只能轉(zhuǎn)錄，而不能翻譯成蛋白質(zhì)[4,8]。由此，產(chǎn)生了大量的lncRNA。PSCs具有明顯的lncRNA標(biāo)記，這些lncRNA在PSCs譜系分化中如何發(fā)揮作用尚不明確。因此，本文將著重討論lncRNA在PSCs譜系分化中的作用與機(jī)制。

通過研究人和小鼠的ESCs和iPSCs，研究人員發(fā)現(xiàn)大多數(shù)lncRNA位于基因附近，約65%的lncRNA轉(zhuǎn)錄起始于基因啟動(dòng)子區(qū)[9]。LncRNA因廣泛存在于細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段，在PSCs的分化和自我更新中也發(fā)揮重要作用，通過多種調(diào)控模式參與PSCs早期譜系分化過程[10]。本文將早期譜系分化過程中l(wèi)ncRNA的作用模式歸結(jié)為以下3點(diǎn)： (1) 染色質(zhì)環(huán)調(diào)控；(2) ceRNA模式；(3) 順式調(diào)控。

1 LncRNA介導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)調(diào)控多能干細(xì)胞早期譜系分化

染色質(zhì)環(huán)(chromatin loop)，可以將遠(yuǎn)端調(diào)控元件帶到目的基因附近，引起遠(yuǎn)距離染色質(zhì)相互作用，調(diào)控基因表達(dá)。在上述過程中，lncRNA能招募染色質(zhì)重構(gòu)和修飾復(fù)合體到特定位點(diǎn)，改變DNA/RNA甲基化狀態(tài)、染色體結(jié)構(gòu)和修飾狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控染色質(zhì)環(huán)的形成，控制早期譜系分化相關(guān)基因表達(dá)，精確調(diào)控PSCs早期譜系分化狀態(tài)。

在PSCs的早期譜系分化中，增強(qiáng)子廣泛參與基因表達(dá)調(diào)控。LncRNA通過介導(dǎo)遠(yuǎn)距離染色質(zhì)環(huán)的形成，調(diào)控遠(yuǎn)端增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的相互作用，間接參與早期譜系分化基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[11]。Eomes是中內(nèi)胚層分化的標(biāo)志性基因。Eomes增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄出一個(gè)lncRNAMeteor，參與Eomes啟動(dòng)子-增強(qiáng)子染色質(zhì)環(huán)的形成，調(diào)控Eomes轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。當(dāng)Meteor缺失時(shí)，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的染色質(zhì)狀態(tài)發(fā)生表觀遺傳重構(gòu)，染色質(zhì)環(huán)消失，Eomes轉(zhuǎn)錄被抑制，ESCs被重定向往神經(jīng)外胚層分化。因此，Eomes基因座與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子及MeteorlncRNA在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)，形成控制多潛能譜系分化的調(diào)控元件，在心源性中胚層分化過程中不可或缺[12]。HOXA基因簇是調(diào)控PSCs分化的關(guān)鍵中介[13]，位于HOXA基因簇上游40 kb位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的lncRNAHaunt和其基因座共同構(gòu)成調(diào)控HOXA表達(dá)的調(diào)節(jié)器。Haunt的基因組位點(diǎn)是HOXA基因簇的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但HauntlncRNA能重塑HOXA位點(diǎn)的H3K27me3狀態(tài)，直接與染色質(zhì)結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性阻礙增強(qiáng)子和HOXA啟動(dòng)子之間的染色質(zhì)環(huán)的形成，抑制HOXA的轉(zhuǎn)錄激活。因此，與HauntDNA序列的激活作用相反，HauntRNA可作為基因轉(zhuǎn)錄“制動(dòng)器”來防止HOXA基因的異常激活。HauntDNA和RNA作為基因表達(dá)的“開關(guān)”，精確控制HOXA基因簇適當(dāng)表達(dá)，調(diào)控PSCs早期3胚層分化[14]。HoxBlinc是與HOXB基因座相關(guān)的lncRNA，通過募集SET1/MLL1復(fù)合物，介導(dǎo)長距離染色質(zhì)相互作用而激活HOXB基因轉(zhuǎn)錄。HoxBlinc遺傳缺失降低HOXB基因表達(dá)，且伴隨SET1/MLL1和H3K4me3修飾減少，減少染色質(zhì)環(huán)的形成。因此，HoxBlinc通過調(diào)節(jié)局部染色質(zhì)狀態(tài)控制HOXB轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)活性，調(diào)控胚胎干細(xì)胞的心源性/血源性中胚層分化[15]。LncRNAEvx1as是EVX1位點(diǎn)反向轉(zhuǎn)錄的lncRNA,表達(dá)早于EVX1。Evx1as能與EVX1轉(zhuǎn)錄起始域結(jié)合，整合各種信號(hào)和轉(zhuǎn)錄蛋白酶，招募轉(zhuǎn)錄激活輔助因子Mediator，形成染色質(zhì)環(huán)，促進(jìn)EVX1啟動(dòng)子與增強(qiáng)子相互作用，激活EVX1基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)ESCs中胚層分化[16]。EVX1基因在Evx1as缺失的ESCs中的表達(dá)失調(diào)，嚴(yán)重影響中胚層細(xì)胞及內(nèi)胚層早期譜系分化[17]。

以上研究表明，受lncRNA調(diào)控的染色質(zhì)動(dòng)態(tài)變化在調(diào)控PSCs早期發(fā)育基因的轉(zhuǎn)錄中，發(fā)揮重要作用。LncRNA通過充當(dāng)誘餌分子、支架分子、排斥分子等調(diào)控染色質(zhì)長距離相互作用。一方面，lncRNA可以在PSCs譜系分化的早期調(diào)控增強(qiáng)子等調(diào)控原件與靶基因的長距離相互結(jié)合，促進(jìn)基因表達(dá)。另一方面，lncRNA也可通過形成空間位阻結(jié)構(gòu)阻礙調(diào)控元件與靶基因互相作用，破壞染色質(zhì)環(huán)形成，導(dǎo)致基因沉默。綜上所述，lncRNA調(diào)控的染色質(zhì)環(huán)在干細(xì)胞早期譜系分化中發(fā)揮中間媒介作用，為PSCs早期譜系分化理論提供了染色質(zhì)環(huán)調(diào)控模型，揭示了多能性退出和分化啟動(dòng)的新機(jī)制[17]。

2 LncRNA作為ceRNA調(diào)控多能干細(xì)胞早期譜系分化

MicroRNA可以通過結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA， ceRNA)通過競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合microRNA來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。ceRNA可以通過應(yīng)答元件(microRNA response elements，MREs)與microRNA結(jié)合導(dǎo)致基因沉默，這是一種RNA-RNA的調(diào)節(jié)通路，具有重要的生物學(xué)意義。LncRNA長度可達(dá)數(shù)千nt，為吸附結(jié)合miRNA提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)，競(jìng)爭(zhēng)占有細(xì)胞內(nèi)大量的miRNA，像海綿一樣緩沖并削減其干涉靶基因mRNA編碼蛋白的能力，這種lncRNA與miRNA互為ceRNA關(guān)系的調(diào)控模式對(duì)PSCs的早期多譜系分化至關(guān)重要，決定了PSCs的早期譜系分化方向和早期功能性細(xì)胞的生成。

Lnc1281是正確啟動(dòng)mESCs早期譜系分化必需的lncRNA。缺乏lnc1281的mESCs向神經(jīng)外胚層和心源性中胚層的早期譜系分化水平顯著降低。lnc1281主要通過內(nèi)部m6A修飾發(fā)揮ceRNA作用，隔離與mESCs多能性相關(guān)的let-7家族miRNAs，激活mESCs早期譜系分化基因Gata4、Mesp1、Sox1和Cxcr4轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)mESCs早期心源性中胚層和神經(jīng)外胚層譜系分化[18]。LncRNAC130071C03-Riken變體Riken-201和Riken-203是大腦中高表達(dá)的lncRNA，共同參與調(diào)控mESCs外胚層早期譜系分化。miR-96和miR-467a-3p是表皮和神經(jīng)外胚層中表達(dá)差異最大的miRNA，可調(diào)控hESCs的神經(jīng)誘導(dǎo)，也能調(diào)控mESCs的神經(jīng)分化。Rik-201和Rik-203作為ceRNA，分別抑制mESCs中miR-96和miR-467a-3p的功能，調(diào)節(jié)Sox6、Sox1的表達(dá)以激活mESCs的神經(jīng)外胚層分化[19]。

人心臟特異性lncRNAHBL1，在未分化的hPSCs中高表達(dá)，是調(diào)節(jié)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)向早期心肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵。HBL1過表達(dá)維持了hiPSCs的多能狀態(tài)，抑制其向心肌細(xì)胞發(fā)育。受SOX2調(diào)控的HBL1在AGO2復(fù)合物中作為ceRNA與miR1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制CTNT、GATA4、NKX2.5、MEF2C、TBX5，TBX20心源性分化關(guān)鍵基因的表達(dá)，調(diào)控hiPSCs心肌細(xì)胞發(fā)育能力。因此，HBL1與SOX2和miR1形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在hiPSCs向早期心肌細(xì)胞的分化過程中至關(guān)重要[20]。Gm10451lncRNA定位于細(xì)胞質(zhì)，是細(xì)胞分化和功能調(diào)節(jié)因子。Gm10451作為miR-338-3p的ceRNA，調(diào)控組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物PTIP活性，促進(jìn)iPSCs向胰島素+/Nkx6.1+Akt樣細(xì)胞分化。Gm10451可作為提高iPSCs分化效率和細(xì)胞功能的表觀遺傳靶點(diǎn)，為iPSCs產(chǎn)生成熟的功能性衍生β樣細(xì)胞提供有效靶標(biāo)[21]。

ceRNA是一種經(jīng)典的基因表達(dá)調(diào)控模型，比起miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，ceRNA調(diào)控更為精細(xì)復(fù)雜。lncRNA中有miRNA響應(yīng)元件(miRNA responsive elements，MRE)，控制與它們的靶向mRNAs結(jié)合，減少對(duì)mRNAs的抑制。ceRNA形成的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，廣泛參與了基因組中的功能性基因的調(diào)控。尤其是在PSCs的早期譜系分化中，基因轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)發(fā)生了重大變化，lncRNA參與的ceRNA為早期譜系分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供了更多模式。此外，lncRNA作為ceRNA發(fā)揮作用也受到RNA修飾(如m6A)的調(diào)控，這種模式是干細(xì)胞精確分化模型的一種有益補(bǔ)充。

3 LncRNA以順式作用模式調(diào)控多能干細(xì)胞早期譜系分化

LncRNA在小鼠和人類基因組中非隨機(jī)定位，常參與鄰域基因組表達(dá)調(diào)控[17]。在常見的lncRNA中，較大比例具有順式作用功能，順式調(diào)控(cis acting)主要依賴順式作用元件(cis-acting element)發(fā)揮作用。lncRNA常位于基因旁側(cè)，作為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、調(diào)控序列和可誘導(dǎo)元件參與基因表達(dá)調(diào)控[22-23]。通過全基因組分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA在PSCs的早期譜系分化中也能調(diào)節(jié)鄰域基因的表達(dá)[17]。

YylncRNA是一類與蛋白編碼基因表達(dá)模式幾乎相同的伴隨性lncRNA，是PSCs命運(yùn)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子。yylncT轉(zhuǎn)錄自中胚層調(diào)節(jié)劑BRACHYURY(T)位點(diǎn)，調(diào)控T位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄激活，其功能缺失不影響PSCs向外胚層或內(nèi)胚層分化，但會(huì)誘導(dǎo)中胚層凋亡。在PSCs的早期譜系分化中，DNA甲基化會(huì)造成表觀遺傳障礙，限制分化潛能，yylncT調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B依賴的DNA甲基化，激活T位點(diǎn)，調(diào)控PSCs的中胚層分化[24]。Hand2是mESCs早期心源性中胚層發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因，Hand2過度激活會(huì)導(dǎo)致先天性心臟畸形。Handsdown(Hdn)是Hand2下游轉(zhuǎn)錄的序列保守的lncRNA，活躍于早期心臟細(xì)胞，嚴(yán)格控制Hand2適量表達(dá)。Hdn與Hand2上游調(diào)控位點(diǎn)相互作用，決定Hand2啟動(dòng)子是否與調(diào)控元件結(jié)合，調(diào)控胚胎干細(xì)胞的心源性中胚層發(fā)育[25]。DIGIT是從GSC(Goosecoid)位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄出的保守反義lncRNA，在PSCs的內(nèi)胚層分化過程中表達(dá)。在小鼠和人ESCs內(nèi)胚層分化過程中，DIGIT會(huì)富集在H3K18ac標(biāo)記的染色質(zhì)區(qū)域與BRD3相互作用形成相分離液滴，精確調(diào)控GSC轉(zhuǎn)錄[13]。這個(gè)調(diào)控作用主要是依賴激活素SMAD3結(jié)合在DIGIT的增強(qiáng)子區(qū)域，激活DIGIT的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控GSC轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)中胚層和內(nèi)胚層轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子包括EOMES、MIXL1、SOX17和FOXA2的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)控PSCs的內(nèi)胚層分化[26-27]。

在PSCs的早期譜系分化中，lncRNA可直接與轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合，精密控制這些早期譜系分化多樣性基因位點(diǎn)的時(shí)空表達(dá)，參與PSCs的早期譜系分化和其他生物學(xué)過程。LncRNA可以序列互補(bǔ)原理結(jié)合在未解鏈的染色質(zhì)大溝中，或者和解鏈的DNA鏈結(jié)合；也可招募調(diào)控因子到位點(diǎn)附近的DNA上，調(diào)控基因表達(dá)。同時(shí)，lncRNA 的參與也會(huì)改變鄰近基因上的DNA甲基化和組蛋白修飾，作為分化相關(guān)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域的“開關(guān)”，調(diào)控PSCs的譜系分化。以上研究也進(jìn)一步證明lncRNA的cis調(diào)控在PSCs的早期譜系分化中發(fā)揮重要作用，為PSCs的早期分化研究提供了更多的模式。

4 展 望

綜上所述，lncRNA在PSCs的早期譜系分化調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，通過反式和順式等多種作用方式，廣泛參與早期譜系分化中關(guān)鍵基因表達(dá)調(diào)控。既可以作為基因轉(zhuǎn)錄激活的直接調(diào)控元件發(fā)揮作用，也可作為染色質(zhì)調(diào)控因子，調(diào)控染色質(zhì)的遠(yuǎn)程相互作用(染色質(zhì)環(huán)的形成)，或作為miRNA的調(diào)控元件，間接調(diào)節(jié)PSCs譜系分化過程中基因表達(dá)和相關(guān)通路的激活或抑制。因此，將現(xiàn)有的lncRNA作為調(diào)控多能干細(xì)胞早期譜系分化的調(diào)控靶點(diǎn)，開發(fā)小分子化合物或生物制劑，精確調(diào)控PSCs早期譜系分化，可作為下一階段研究的重要問題。由于lncRNA數(shù)量龐大，作用范圍廣，作用機(jī)制復(fù)雜，目前的研究只是冰山一角，lncRNA在PSCs早期譜系分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的更多作用模式尚待發(fā)掘；lncRNA是否也廣泛參與早期譜系分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后修飾，尚不完全清楚，是一個(gè)值得高度關(guān)注和探索的領(lǐng)域。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，lncRNA的研究已不再局限在點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的研究上，已經(jīng)可以從更精細(xì)的全基因組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖譜中，全面了解PSCs早期譜系分化的調(diào)控機(jī)制。