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    芥菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究

    2013-09-03 02:55:58顧祥昆張淑江章時(shí)蕃孫日飛
    中國(guó)蔬菜 2013年12期
    關(guān)鍵詞:胚狀體靠邊單核

    顧祥昆 李 菲 張淑江 章時(shí)蕃 張 慧 孫日飛

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所,北京 100081)

    小孢子培養(yǎng)技術(shù)是利用植物的未成熟花粉在一定誘導(dǎo)條件下改變正常的花粉發(fā)育途徑,即由配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑,進(jìn)而形成胚狀體的過程。通過小孢子培養(yǎng)可獲得大量單倍體或雙單倍體植株(DH系),在純化親本、突變體篩選、遺傳研究等方面應(yīng)用廣泛。目前,該技術(shù)已經(jīng)成為育種的重要手段之一。Lichter(1982)首次報(bào)道了甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)獲得了胚狀體再生植株;日本學(xué)者Sato等(1989)首次利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)從1個(gè)大白菜品種中得到了小孢子胚和再生植株。隨后,小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蕓薹屬蔬菜中得到廣泛應(yīng)用,目前已經(jīng)涉及蕓薹屬的3個(gè)基本種和3個(gè)復(fù)合種(牛永超 等,2010)。

    芥菜〔Brassica juncea(L.)Czern. et Coss.〕是十字花科蕓薹屬一年或二年生植物,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。隨著消費(fèi)水平的提高,人們對(duì)芥菜品質(zhì)、產(chǎn)量等提出了更高的要求。利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以快速獲得純合的DH材料,大大縮短育種周期,提高育種效率,為芥菜高效優(yōu)質(zhì)育種獲得純合目標(biāo)材料提供了新的途徑。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究較少,且主要集中在油用芥菜上,對(duì)鮮食或加工用芥菜的研究甚少,芥菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系尚不完善。本試驗(yàn)擬通過研究基因型、熱激誘導(dǎo)條件、供體植株生長(zhǎng)條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響,探討適宜芥菜小孢子培養(yǎng)的主要條件,為完善芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系、提高胚胎誘導(dǎo)率奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    選取12份不同基因型的芥菜栽培種為試驗(yàn)材料(表1),分屬于葉用芥菜、莖用芥菜、根用芥菜3個(gè)變種,均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。2011年1月播種于本所玻璃溫室內(nèi),常規(guī)管理,3月初定植于日光溫室,4~6月初取蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

    表1 供試芥菜品種名稱及類型

    1.2 方法

    1.2.1 芥菜游離小孢子提取和培養(yǎng) 早上8:00~9:00取材,在顯微鏡下對(duì)不同基因型不同長(zhǎng)度的芥菜花蕾進(jìn)行鏡檢,確定大部分小孢子處于單核靠邊期時(shí)所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度,進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

    用75%的酒精消毒花蕾30 s,再用8%次氯酸鈉溶液消毒15 min,無(wú)菌水沖洗3次,每次1 min。將無(wú)菌花蕾置于消毒研缽中,并加入一定量的B5洗滌培養(yǎng)液,擠壓花蕾,分離小孢子,用300目消毒濾網(wǎng)過濾,收集濾液于10 mL離心管中,離心3次,轉(zhuǎn)速為1 200 r·min-1,每次4 min,之后棄上清液,用NLN-13培養(yǎng)基制成小孢子懸浮液,用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)小孢子密度為8×104~1×105個(gè)·mL-1。將其分裝于直徑為60 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入約4 mL,用封口膜封口。

    根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì),將分裝好的小孢子懸浮液置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱激誘導(dǎo)后,轉(zhuǎn)入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)暗培養(yǎng),至胚狀體出現(xiàn)。培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)小孢子出胚數(shù)目。

    1.2.2 花粉發(fā)育時(shí)期的熒光顯微觀察 以A12959、V03B0097、V03C0021為試材,在生長(zhǎng)健壯的植株花序上選取不同長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行DAPI染色觀察,染色液的配制參照李菲(2006)的方法。將不同長(zhǎng)度花蕾中的花藥剝離出來,取2~3個(gè)花藥置于載玻片上,并滴1~2滴DAPI染液,用鑷子擠壓花藥,使小孢子分離出來,剔除花藥殘片,蓋上蓋玻片并烤片。室溫下暗處理15 min后置于熒光顯微鏡下觀察、照相,并記錄處于不同發(fā)育時(shí)期的小孢子外部形態(tài)。

    1.2.3 單核靠邊期與花蕾長(zhǎng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系 根據(jù)DAPI染色結(jié)果,得知處于不同時(shí)期的小孢子外部形態(tài)。將12份芥菜品種不同長(zhǎng)度花蕾中的花藥剝離出來,取2~3個(gè)花藥置于載玻片上,滴1~2滴清水,用鑷子擠壓花藥,使小孢子分離出來,剔除花藥殘片,蓋上蓋玻片,置于顯微鏡下觀察小孢子的外部形態(tài),測(cè)量大部分小孢子處于單核靠邊期時(shí)對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度并記錄。

    1.2.4 小孢子發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)小孢子,每天于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

    1.2.5 熱激誘導(dǎo)條件 設(shè)置3個(gè)熱激溫度:32、33、35 ℃,并分別處理1、2、3 d,熱激后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止暗培養(yǎng)。以25 ℃暗培養(yǎng)為對(duì)照。培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)小孢子出胚數(shù)目,計(jì)算出胚率。

    1.2.6 供體植株生長(zhǎng)條件 以A12959、V03B0097、V03C0021為試材,分3個(gè)不同播期播種,常規(guī)栽培管理,使每批材料抽薹開花的日期分別為4月底~5月初、5月底~6月初、6月底~7月初。取材進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)的熱激處理?xiàng)l件為35 ℃、3 d。對(duì) 比不同生長(zhǎng)溫度下供體植株的出胚狀況,探討供體植株生長(zhǎng)條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同發(fā)育時(shí)期花粉的DAPI染色觀察

    對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花粉進(jìn)行DAPI染色并進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察,結(jié)果見圖1。芥菜小孢子發(fā)育過程為四分體時(shí)期→單核中期→單核靠邊期→雙核期→三核期。

    四分體時(shí)期(圖1-a):小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂后會(huì)形成4個(gè)子細(xì)胞粘連在一起的時(shí)期,稱為四分體時(shí)期,經(jīng)熒光染色后有4個(gè)核出現(xiàn)。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈明顯的四裂狀。單核中期(圖1-b):小孢子的核只有1個(gè)且處于細(xì)胞中間。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈近圓形,三棱形初步顯露但不是很明顯。單核靠邊期(圖1-c):細(xì)胞核處于細(xì)胞的邊緣處,靠近細(xì)胞壁。小孢子的外部形態(tài)呈明顯的三棱形,可以看見有3條萌發(fā)溝,并且從總體上看,單核靠邊期的小孢子要比單核中期的小孢子體積要大。雙核期(圖1-d):小孢子經(jīng)第一次有絲分裂在胞壁內(nèi)形成營(yíng)養(yǎng)核和生殖核,其中營(yíng)養(yǎng)核染色較淺,生殖核染色較深。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈圓形。三核期(圖1-e):隨著小孢子的繼續(xù)發(fā)育,生殖核分裂為2個(gè)精子,此時(shí)小孢子內(nèi)有3個(gè)核,即1個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和2個(gè)精子核。精子核較小,營(yíng)養(yǎng)核較大。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈近圓形至橢圓形。由DAPI染色結(jié)果可知:小孢子隨著不斷地生長(zhǎng)發(fā)育,細(xì)胞體積不斷增大。處于單核靠邊期的小孢子可見明顯的3條萌發(fā)溝,呈三棱形,可作為單核靠邊期的形態(tài)指標(biāo)。

    2.2 小孢子處于單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度

    對(duì)于芥菜,適于培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時(shí)期一般是單核靠邊期。劉冬等(1997)以芥菜為試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng),結(jié)果顯示單核晚期的小孢子培養(yǎng)效果最好。Prem等(2005)選取單核晚期占較大比例的花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng),培養(yǎng)效果較好。

    對(duì)供試的12份芥菜材料的不同長(zhǎng)度花蕾中的小孢子進(jìn)行鏡檢,依據(jù)單核靠邊期小孢子的細(xì)胞學(xué)特征,找出大部分小孢子處于單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度,即為適宜小孢子培養(yǎng)的花蕾長(zhǎng)度。從表2可以看出,除了南平大頭芥(V03B0001)小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度是3.0~3.5 mm外,其余芥菜材料小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度為2.0~3.0 mm。但不同基因型的芥菜材料,其小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度也有所不同。如包心芥(A12959)的小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度為2.5~3.0 mm,而兒菜(V03B0109)的小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度為2.0~2.5 mm。在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)根據(jù)基因型選擇適宜長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng),在分離提取小孢子之前用顯微鏡快速鏡檢,找到大部分小孢子為三棱形時(shí)所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度即為適宜的花蕾長(zhǎng)度。

    圖1 不同發(fā)育時(shí)期芥菜小孢子的DAPI熒光染色結(jié)果(10×20)

    表2 不同基因型芥菜小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度

    2.3 小孢子培養(yǎng)過程中的細(xì)胞學(xué)觀察

    在小孢子培養(yǎng)過程中,用倒置顯微鏡觀察小孢子各個(gè)發(fā)育時(shí)期的形態(tài)。經(jīng)熱激處理24 h后,部分小孢子明顯膨大,細(xì)胞呈圓球形,細(xì)胞直徑增大到原來的2~3倍(圖2-a);3 d后,部分膨大的小孢子發(fā)生第一次分裂,大部分為均等分裂(圖2-b),也有極個(gè)別的為不均等分裂(圖2-c),不均等分裂的小孢子一般不能發(fā)育成胚;5 d后,較多的小孢子發(fā)生第二次均等分裂(圖2-d);7 d后,可觀察到分裂多次的細(xì)胞團(tuán)(圖2-e);9 d后,可觀察到球形幼胚(圖2-f);第10~11天時(shí),可觀察到球形胚(圖2-g)和心形胚(圖2-h),第12~15天時(shí),可觀察到魚雷形胚和子葉形胚(圖2-i,j,k)。

    此外,還觀察到不同基因型芥菜的小孢子胚胎發(fā)生均具有不同步性,在1個(gè)培養(yǎng)皿中可以同時(shí)觀察到球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚并存(圖2-l)。

    2.4 熱激條件對(duì)芥菜小孢子出胚率的影響

    圖2 芥菜小孢子離體發(fā)育過程

    表3 不同熱激條件對(duì)芥菜小孢子出胚率的影響

    從表3可以看出,V03B0012和B92975-201在35 ℃、2 d的熱激處理下出胚率較高,V03C0021在35 ℃、1 d的熱激處理下出胚率較高,其余6份出胚的芥菜材料均在35 ℃、3 d的熱激條件下產(chǎn)胚量最多??傮w來說,35℃、3 d是本試驗(yàn)條件下大多數(shù)芥菜材料小孢子培養(yǎng)較為適宜的熱激誘導(dǎo)條件。

    表4 不同基因型對(duì)芥菜小孢子出胚率的影響

    2.5 基因型對(duì)芥菜小孢子胚產(chǎn)量的影響

    由表4可見,供試的12份芥菜材料中有9份誘導(dǎo)出胚,其中V03B0097和A12959出胚率較高,達(dá)5.87胚·蕾-1和5.54胚·蕾-1;A12960、V03C0001、V03B0012、V03B0109、V03A0223、B92975-201的出胚率相對(duì)較低,均在0.5胚·蕾-1以下;而V03A0235、V03B0001、V03C0004很難誘導(dǎo)出胚。由此可見,不同基因型的芥菜小孢子胚胎發(fā)生能力有很大的差異,基因型是影響芥菜小孢子培養(yǎng)成功與否的重要因素。

    2.6 供體植株生長(zhǎng)條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響

    為探討不同溫度條件下生長(zhǎng)的供體植株對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響,本試驗(yàn)以A12959、V03B0097、V03C0021為試材,分3批播種,常規(guī)栽培管理,每批材料抽薹開花的日期分別為4月底~5月初、5月底~6月初、6月底~7月初,取材進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng),并統(tǒng)計(jì)同種材料在不同抽薹開花日期的出胚情況。4月底~5月初平均氣溫為25.7 ℃/14.25 ℃(平均最高氣溫/平均最低氣溫,下同),5月底~6月初為29.8 ℃/17.95 ℃,6月底~7月初為30.25 ℃/21.95 ℃。結(jié)果顯示:只有4月底~5月初抽薹開花的材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)后可誘導(dǎo)出胚,其余兩批材料均沒有誘導(dǎo)成胚??梢?,供體植株的生長(zhǎng)溫度對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)有較大的影響。在運(yùn)用小孢子培養(yǎng)技術(shù)時(shí),應(yīng)盡量確保供體植株處于較低的溫度環(huán)境中生長(zhǎng)。但由于本試驗(yàn)沒有進(jìn)行多年多點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn),還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)詳細(xì)的試驗(yàn)進(jìn)行研究。

    2.7 芥菜小孢子胚狀體的繼代培養(yǎng)

    將培養(yǎng)25 d后的胚狀體(圖3-a)轉(zhuǎn)接到B5固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),待胚狀體萌發(fā)分化后轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)(圖3-b),大部分的子葉形胚均能正常發(fā)育、分化,并形成健全的植株(圖3-c),而球形胚、心形胚和魚雷形胚均褐化死亡。表明幼期胚狀體不容易成活,子葉形胚易于進(jìn)行繼代培養(yǎng)。為了使更多的胚狀體得以應(yīng)用,還需要進(jìn)一步探究繼代培養(yǎng)中各種條件對(duì)胚狀體發(fā)育的影響,以優(yōu)化芥菜繼代培養(yǎng)體系。

    圖3 芥菜小孢子胚狀體的萌發(fā)與植株再生

    3 結(jié)論與討論

    在游離小孢子培養(yǎng)中,小孢子發(fā)育時(shí)期與誘導(dǎo)胚胎發(fā)生能力密切相關(guān),選擇合適發(fā)育時(shí)期的小孢子至關(guān)重要。對(duì)于芥菜,單核靠邊期的小孢子易于誘導(dǎo)啟動(dòng)胚狀體發(fā)生途徑(劉冬 等,1997;Prem et al.,2005)。本試驗(yàn)采用DAPI染色法確定了單核靠邊期小孢子的細(xì)胞形態(tài),對(duì)12份芥菜材料不同長(zhǎng)度花蕾的小孢子進(jìn)行顯微觀察,找到了單核靠邊期的小孢子所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度。三棱形是單核靠邊期小孢子最為明顯的細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征,可以作為此發(fā)育時(shí)期的形態(tài)學(xué)標(biāo)志。本試驗(yàn)選取的12份芥菜小孢子處于單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度主要在2~3 mm的范圍內(nèi),但適宜的花蕾長(zhǎng)度隨基因型的不同而有差異,在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)基因型確定適宜長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

    很多作物小孢子培養(yǎng)過程中,高溫?zé)峒な钦T導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的關(guān)鍵步驟。其作用機(jī)理是通過脅迫改變小孢子的發(fā)育途徑,阻止小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展,促進(jìn)其沿胚胎發(fā)育途徑發(fā)展,最后形成小孢子胚(栗根義 等,1993a,1993b)。目前高溫?zé)峒ぬ幚硪呀?jīng)廣泛地運(yùn)用于十字花科作物小孢子培養(yǎng)中。芥菜小孢子培養(yǎng)同樣需要熱激誘導(dǎo),但目前所采用的熱激條件各有不同,難以統(tǒng)一。劉冬等(1997)的研究中只有在33 ℃、3 d熱激處理下有芥菜小孢子胚形成;牛永超等(2010)認(rèn)為32 ℃、5 d熱激處理對(duì)大多數(shù)芥菜小孢子再生成胚狀體較為有效;Hiramatsu等(1995)對(duì)24份葉用芥菜材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng),采用的熱激條件為32.5 ℃、1~3 d,只有7份材料出胚,對(duì)于出胚情況最好的Hsueh Li Hung來說,最佳的熱激條件是32.5 ℃、2 d;Pradeep等(2006)的研究表明35 ℃、2 d的熱激條件最好,比32、33 ℃處理2 d后的產(chǎn)胚量高10~15倍。本試驗(yàn)探究了熱激溫度和熱激天數(shù)對(duì)12份芥菜小孢子培養(yǎng)的影響,35 ℃、3 d是大多數(shù)材料較為適宜的熱激條件。這與Pradeep等(2006)的研究結(jié)果較為一致。為了進(jìn)一步確定適于芥菜小孢子培養(yǎng)的熱激條件,今后還需要增加芥菜基因型的種類和數(shù)量進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

    目前,小孢子培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于蕓薹屬的很多作物中,在探究大白菜(曹鳴慶 等,1993;栗根義 等,1993a;趙俊 等,2008)、甘藍(lán)型油菜(余鳳群和劉后利,1995;王漢中 等,2004)、花椰菜(張曉芬 等,2005;趙前程 等,2007)、蘿卜(張麗,2004)等小孢子培養(yǎng)的影響因素試驗(yàn)中,基因型仍是決定小孢子培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素。在本試驗(yàn)中,基因型亦是影響芥菜小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素,這與前人的研究結(jié)果相同(Hiramatsu et al.,1995;Agnihotri et al.,1996;Lionneton et al.,2001;Prem et al.,2005;Deepak et al.,2008;牛永超 等,2010),不同基因型芥菜的小孢子胚胎發(fā)生能力有很大的差異。

    在探討基因型對(duì)芥菜小孢子胚產(chǎn)量的影響時(shí),本試驗(yàn)綜合了所有條件下的出胚情況進(jìn)行探討。因?yàn)榻娌说倪z傳背景較為復(fù)雜,可能存在較多的內(nèi)在因素影響芥菜小孢子胚胎發(fā)生能力,沒有較為統(tǒng)一的熱激條件。本試驗(yàn)中,雖然35 ℃、3 d的熱激條件對(duì)大多數(shù)芥菜材料而言是較為適宜的誘導(dǎo)條件,但并不是對(duì)所有的基因型都適用,有的在其他熱激條件下出胚的材料在35 ℃、3 d熱激后并不出胚。如V03B0097和A12959在任何熱激條件下均能誘導(dǎo)出胚,是易出胚材料;而B92975-201只有在35 ℃熱激2 d后有胚狀體發(fā)生,V03C0004、V03B0001和V03A0235在任何熱激條件下均不能誘導(dǎo)出胚,由此表現(xiàn)出基因型差異。此外,本試驗(yàn)所用的基因型較少,很可能隨著基因型的增加,會(huì)表現(xiàn)出依賴于基因型的熱激條件多樣性,因此需要考慮在一定熱激條件范圍內(nèi)的出胚總體情況進(jìn)行基因型影響的探討。今后也應(yīng)當(dāng)增加芥菜的種類和數(shù)量作進(jìn)一步的研究。

    本試驗(yàn)也初步探究了供體植株生長(zhǎng)條件尤其是溫度條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)4月底~5月初抽薹開花的材料小孢子易于誘導(dǎo)出胚,說明供體植株在較低的溫度環(huán)境下生長(zhǎng)有利于小孢子培養(yǎng)。在常規(guī)栽培管理中,應(yīng)盡量使芥菜抽薹開花時(shí)的氣溫相對(duì)較低。

    曹鳴慶,李巖,劉凡.1993.基因型和供體植株生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響.華北農(nóng)學(xué)報(bào),8(4):1-6.

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