5種方法制備高尿酸血癥大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

陳建新， 劉剛， 楊麟， 陳亮， 池鳳蘇， 唐璐， 譚婧

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)體育與健康學(xué)院，廣東廣州 510006；2.華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院激光運(yùn)動醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510631；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 511436）

高尿酸血癥（hyperuricemia）是由于尿酸排泄減少、嘌呤代謝紊亂和尿酸持續(xù)升高而引起單鈉尿酸鹽（monosodium urate）結(jié)晶體析出并沉積于組織或器官而表現(xiàn)的代謝性疾病[1]。1 項(xiàng)英國的臨床大數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，高尿酸血癥與腎臟疾病有著緊密聯(lián)系[2]。有研究進(jìn)一步揭示了慢性腎病可以預(yù)示高尿酸血癥高風(fēng)險的發(fā)生，而高尿酸血癥又加劇了慢性腎病的惡化[3]。因此，維持腎臟的正常尿酸水平有利于細(xì)胞抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和維持穩(wěn)定血壓等效用[4-5]。由于高等靈長類動物缺乏編碼尿酸酶易導(dǎo)致高尿酸血癥[4]，而其他大多數(shù)動物體內(nèi)存在固有的尿酸酶可以降低尿酸的產(chǎn)生[3]，故建立以嚙齒類動物為主的高尿酸血癥動物模型是較困難的。本研究應(yīng)用不同造模藥物單用或聯(lián)合處理4周試圖建立穩(wěn)定且高效的高尿酸血癥動物模型，并觀察不同造模藥物對腎臟組織的損傷作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動物 48 只SPF 級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，（5±1）周齡，體質(zhì)量（160 ± 10）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK（粵）2018-0002]，實(shí)驗(yàn)動物喂養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)城校區(qū)SPF 級動物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK（粵）2018-0085]。所有操作均根據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院（NIH）發(fā)布的實(shí)驗(yàn)室動物護(hù)理和使用指南（8th Edition，2011，ISBN 10：0-309-15400-6）進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)方案已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求（審批號：20200717002）。動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內(nèi)12 h 晝夜循環(huán)照明，溫度保持在22 ～ 26 ℃，濕度50%～60%，動物自由進(jìn)食和飲水。

1.2 造模藥物、試劑與儀器 氧嗪酸鉀（potassium oxonate）（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C11528491）；腺嘌呤（adenine）（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y26J8C40561）；酵母膏（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：2665431-02）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；尿酸試劑盒（尿酸酶比色法）、尿素氮試劑盒（脲酶法）、尿肌酐試劑盒（尿肌酐比色法）（南京建成生物工程研究所有限公司）。Multiskan Mk3 型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；離心機(jī)（美國Eppendorf公司）；全自動生化分析儀（日本Hitachi 公司）；ASP200S 全自動脫水機(jī)、5300 全自動染封一體機(jī)、RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國徠卡公司）。

1. 3 動物分組與造模 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，48 只SD 大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為6 組，即正常對照組、氧嗪酸鉀組、腺嘌呤組、氧嗪酸鉀+腺嘌呤組、酵母膏+氧嗪酸鉀組以及酵母膏+腺嘌呤組，每組8只。所有組別均采用灌胃方式進(jìn)行造模，灌胃液用5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為溶媒進(jìn)行配制。造模同期，正常對照組給予CMC-Na 2 mL·d-1灌胃，氧嗪酸鉀組給予氧嗪酸鉀250 mg·kg-1·d-1灌胃，腺嘌呤組給予腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1灌胃，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組給予氧嗪酸鉀250 mg·kg-1·d-1與腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1聯(lián)合灌胃，酵母膏+氧嗪酸鉀組給予酵母膏15 g·kg-1·d-1與氧嗪酸鉀250 mg·kg-1·d-1聯(lián)合灌胃，酵母膏+腺嘌呤組給予酵母膏15 g·kg-1·d-1與腺嘌呤200 mg·kg-1·d-1聯(lián)合灌胃。每日1次，連續(xù)造模4周。

1.4 標(biāo)本制備 每周通過眼球叢取血。第4 周末給藥結(jié)束后12 h（禁食不禁水），以25 g/L戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈取血，處死留取腎臟標(biāo)本。血液標(biāo)本靜置30 min 后，于4 ℃離心機(jī)以10 000g離心10 min，取上層血清，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。腎臟標(biāo)本放置于40 g/L多聚甲醛中性溶液中固定。

1.5 生化指標(biāo)檢測 運(yùn)用全自動生化分析儀檢測血清尿酸（serum uric acid）、尿素氮（urea nitrogen）和肌酐（creatinine）水平，按照試劑盒與儀器操作說明書進(jìn)行操作。

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腎臟組織病理變化 將腎臟組織放置于多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、分化、制片（4 μm厚）、HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。1. 7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠狀態(tài)、體質(zhì)量變化比較 造模1～4 周，正常對照組大鼠均反應(yīng)靈敏，皮毛致密有光澤，體質(zhì)量增長較快，而各造模組大鼠表現(xiàn)為精神萎靡，活動減少，反應(yīng)遲鈍，毛色焦黃且無光澤，應(yīng)激性較高，敏感且易怒，攻擊性也較強(qiáng)。

隨著造模時間的延長，所有組別大鼠體質(zhì)量均有所增加。造模第0 周，各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）。造模從造模第1周開始到第4周結(jié)束，氧嗪酸鉀組、酵母膏+氧嗪酸鉀組和酵母膏+腺嘌呤組的體質(zhì)量顯著高于正常對照組、腺嘌呤組和氧嗪酸鉀+腺嘌呤組（P＜0.05）。具體結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body mass of rats in various groups（±s，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body mass of rats in various groups（±s，g）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；③P ＜0.05，與氧嗪酸鉀+腺嘌呤組比較

組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組造模第4周300±17 313±16①②③284±29 291±12 336±25①②③323±23①②③鼠數(shù)（只）888888造模第0周163±5 167±6 164±9 164±7 169±6 163±7造模第1周188±11 201±7①②③183±10 181±10 213±9①②③202±9①②③造模第2周230±16 255±6①②③216±20 214±16 269±16①②③245±15①②③造模第3周264±13 285±13①②③259±25 249±11 305±26①②③296±18①②③

2.2 各組大鼠血清尿酸水平比較 在為期4 周造模過程中，與正常對照組比較，所有造模組的尿酸值均顯著升高（P＜0.05），其中，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組尿酸值最高（P＜0.05）。在造模第4 周，腺嘌呤組的尿酸值顯著高于正常對照組、氧嗪酸鉀組、酵母膏+氧嗪酸鉀組和酵母膏+腺嘌呤組（P＜0.05）。表明腺嘌呤單用或聯(lián)合氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥模型效果較好。具體結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清尿酸水平比較Table 2 Comparison of serum uric acid level of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

表2 各組大鼠血清尿酸水平比較Table 2 Comparison of serum uric acid level of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與氧嗪酸鉀組比較；③P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；④P ＜0.05，與酵母膏+氧嗪酸鉀組比較；⑤P ＜0.05，與酵母膏+腺嘌呤組比較

造模第4周118.36±15.74 157.41±23.59①184.37±32.62①②④⑤253.68±45.12①②③④⑤162.91±25.64①142.50±28.53①組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組鼠數(shù)（只）888888造模第0周78.36±11.23 72.58±10.96 75.33±13.20 79.56±12.38 73.11±11.72 76.40±13.08造模第1周94.63±18.63 131.72±24.96①148.94±26.31①193.38±38.07①②③④⑤140.84±29.19①139.78±37.12①造模第2周105.16±23.24 152.22±26.09①167.78±32.31①223.45±40.13①②③④⑤159.85±27.42①153.71±31.69①造模第3周104.63±18.68 159.13±21.27①170.20±28.56①⑤249.52±39.34①②③④⑤165.18±27.32①157.45±20.39①

2.3 各組大鼠血清尿素氮水平比較 在造模4 周后，與正常對照組比較，所有造模組的尿素氮值均顯著升高（P＜0.05），其中，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組的尿素氮值最高（P＜0.05），腺嘌呤組其次（P＜0.05）。表明腺嘌呤單用或聯(lián)合氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥模型效果較好。具體結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清尿素氮水平比較Table 3 Comparison of serum urea nitrogen level of rats in various groups（±s，mmol·L-1）

表3 各組大鼠血清尿素氮水平比較Table 3 Comparison of serum urea nitrogen level of rats in various groups（±s，mmol·L-1）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與氧嗪酸鉀組比較；③P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；④P ＜0.05，與酵母膏+氧嗪酸鉀組比較；⑤P ＜0.05，與酵母膏+腺嘌呤組比較

造模第4周5.24±0.71 7.89±1.59①10.57±2.55①②④⑤12.57±2.86①②③④⑤10.91±2.38①②10.50±2.80①②組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組鼠數(shù)（只）888888造模第0周4.31±0.81 4.14±0.69 4.19±0.92 4.40±0.94 4.06±0.56 3.96±0.78造模第1周4.88±0.73 4.67±0.89 5.87±1.09 7.61±0.83①②③④⑤5.34±1.13 5.01±1.04造模第2周4.79±0.69 4.93±1.29 8.32±2.11①②9.30±2.34①②③④⑤8.69±1.42①②8.74±1.89①②造模第3周4.82±0.89 6.31±1.17①9.97±2.36①②11.43±2.69①②③④⑤9.08±2.61①②9.45±2.06①②

2.4 各組大鼠血清肌酐水平比較 在4 周造模過程中，與正常對照組比較，所有造模組的肌酐都有顯著性升高（P＜0.05），其中，氧嗪酸鉀+腺嘌呤組的肌酐值最高（P＜0.05）。表明腺嘌呤聯(lián)合氧嗪酸鉀構(gòu)建高尿酸血癥模型效果較好。具體結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠血清肌酐水平比較Table 4 Comparison of serum creatinine of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

表4 各組大鼠血清肌酐水平比較Table 4 Comparison of serum creatinine of rats in various groups（±s，μmol·L-1）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與氧嗪酸鉀組比較；③P ＜0.05，與腺嘌呤組比較；④P ＜0.05，與酵母膏+氧嗪酸鉀組比較；⑤P ＜0.05，與酵母膏+腺嘌呤組比較

造模第4周34.25±15.74 60.36±16.75①59.84±22.62①67.68±25.30①②③④⑤54.53±14.64①53.50±17.53①組別正常對照組氧嗪酸鉀組腺嘌呤組氧嗪酸鉀+腺嘌呤組酵母膏+氧嗪酸鉀組酵母膏+腺嘌呤組鼠數(shù)（只）888888造模第0周30.86±12.33 29.78±11.57 33.64±13.26 30.70±11.31 29.47±8.43 30.94±9.74造模第1周30.88±10.06 45.43±14.56①42.69±16.25①55.38±18.87①②③④⑤47.84±19.23①48.55±17.58①造模第2周31.23±13.78 52.14±18.09①56.78±32.31①63.89±20.24①②③④⑤53.69±17.94①55.97±12.28①造模第3周33.63±18.68 58.08±17.25①④57.30±28.56①④66.52±19.34①②③④⑤50.58±12.30①57.25±15.39①

2.5 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 圖1 肉眼結(jié)果顯示：正常對照組腎臟結(jié)構(gòu)完好，腎臟顏色暗紅，組織表面光澤度較高，外觀無腫脹現(xiàn)象；各造模組腎臟均較肥大，特別是腺嘌呤組與氧嗪酸鉀+腺嘌呤組腎臟外表有明顯結(jié)晶顆粒狀，腎臟顏色暗黃。HE染色結(jié)果顯示：正常對照組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)正常，無異變，無結(jié)晶體積聚產(chǎn)生；各造模組均出現(xiàn)了腎小管排列不規(guī)則，且出現(xiàn)不同程度的尿酸鈉鹽結(jié)晶體積聚，其中，腺嘌呤組與氧嗪酸鉀+腺嘌呤組有大量尿酸鈉鹽結(jié)晶體積聚，腎小管周圍炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，上皮細(xì)胞胞質(zhì)空泡明顯。表明腺嘌呤單用或聯(lián)合氧嗪酸鉀對腎臟組織的損傷最為嚴(yán)重。

圖1 各組大鼠腎臟大體（A）及HE染色病理（B，×200）表現(xiàn)比較Figure 1 Comparison of kidney（A）and HE staining pathological features（B，×200）of rats in various groups

3 討論

尿酸是嘌呤（鳥嘌呤和腺嘌呤）和含嘌呤的化合物（如核酸、三磷酸腺苷）分解生成的嘌呤降解產(chǎn)物[6]。尿酸（主要為人體）和尿囊素（主要為嚙齒類動物）是肝臟中肝細(xì)胞嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。尿酸可以通過肝臟（膽汁）排出，也可以通過腎臟（尿液）或腸道循環(huán)系統(tǒng)排出[7]。高尿酸血癥主要發(fā)生在包括人類在內(nèi)的高等靈長類動物中，主要是由于編碼尿酸酶（也稱尿酸氧化酶）基因失活導(dǎo)致的。尿酸酶是代謝尿酸轉(zhuǎn)化為水溶性尿囊素的3種酶序列中的第一種[3]，在靈長類動物進(jìn)化過程中，該基因啟動子區(qū)域及蛋白質(zhì)編碼序列的多個獨(dú)立突變導(dǎo)致了基因沉默[3，8]。因此，高尿酸血癥的主要病理特征是當(dāng)血清尿酸鹽（serum urate）濃度高于408 μmol/L且pH值高于7.4時就可以形成單鈉尿酸鹽結(jié)晶體，由于人體缺乏尿酸酶，致使尿酸鹽在腎臟和（或）腸道中過量生成或排泄不足[9]。因此，高尿酸血癥的發(fā)生主要有2種途徑，包括生成過多和排泄障礙。70%的亞洲人群高尿酸血癥患者為排泄障礙型，而排泄障礙型主要是尿酸在腎臟近端腎小管的重吸收出現(xiàn)障礙。導(dǎo)致的血尿酸水平異常升高，臨床上表現(xiàn)為肌酐升高或腎小球?yàn)V過率偏低，提示腎損傷是排泄障礙型高尿酸血癥的病理機(jī)制之一。從中醫(yī)學(xué)角度來看，緩解期高尿酸血癥患者多見脾腎兩虛，亦提示“腎”與高尿酸血癥有密切關(guān)系。因此認(rèn)為，腎損傷可能是高尿酸血癥發(fā)生的重要原因。

建立高尿酸血癥動物模型主要通過2個途徑來進(jìn)行，一是增加尿酸來源，二是抑制尿酸排出與抑制尿酸酶的活性[10-12]。本研究通過5 種造模方法——氧嗪酸鉀、腺嘌呤、氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤、酵母膏聯(lián)合氧嗪酸鉀以及酵母膏聯(lián)合腺嘌呤構(gòu)建高尿酸血癥動物模型。其中，氧嗪酸鉀和酵母膏的作用途徑主要為增加尿酸來源，腺嘌呤的作用途徑為抑制尿酸排出與抑制尿酸酶的活性。本研究結(jié)果顯示，氧嗪酸鉀和酵母膏對大鼠體質(zhì)量的作用更加明顯。盡管肥胖是高尿酸血癥的一個重要相關(guān)因子[13-14]，但是從本研究具體的生化指標(biāo)來看，兩者對高尿酸血癥的作用并不突出，因此，肥胖是否為高尿酸血癥的重要相關(guān)因素還有待進(jìn)一步的考證。

尿酸、尿素氮和肌酐水平是判斷高尿酸血癥動物模型構(gòu)建成功與否的黃金指標(biāo)[15-16]。孟笑瑋等[17]連續(xù)3 d 腹腔注射氧嗪酸鉀復(fù)制高尿酸血癥動物模型，發(fā)現(xiàn)存在血尿酸高于僅注射1 次的趨勢，但無顯著性差異。但再次重復(fù)這2個模型發(fā)現(xiàn)，尿酸水平升高不明顯。認(rèn)為該種方法存在著較大的不穩(wěn)定性。楊桂梅等[18]使用氧嗪酸鉀灌胃10 d造模成功，但孟笑瑋等[17]的研究中使用相同方法未成功得到穩(wěn)定的高尿酸血癥動物模型。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤法對尿酸、尿素氮和肌酐3 個指標(biāo)的作用尤為突出，從造模第1 周開始，不僅與正常對照組有顯著差異，而且與其余造模組都有顯著差異，這種優(yōu)勢也保持到了造模4周以后。此外，從病理切片結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)，嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤造模組出現(xiàn)了大量腎尿酸鹽結(jié)晶沉積，腎小管變性及壞死，炎性細(xì)胞浸潤。因此，該聯(lián)合藥物對高尿酸血癥動物模型的建立具有重要的指導(dǎo)意義。

由于嚙齒類動物有固有的尿酸酶可以促進(jìn)尿酸降解為尿囊素從而隨尿液排出[5，19]，故高尿酸血癥動物的建立是較為困難的。如果只是一過性的損傷，而非長期性給予刺激，則很難造模成功[7]。本研究結(jié)果顯示，從高尿酸血癥造模4 周過程來看，5 種造模方式造模成功的時間效應(yīng)具有差異性，其中，只有在第4周時高尿酸血癥動物模型全部造模成功。生物節(jié)律固定下來的活動稱為習(xí)慣性行為，維持習(xí)慣性行為功能的負(fù)反饋機(jī)制會抑制非靶組織細(xì)胞以及其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活[20-21]。靶組織細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子或外泌體在盡可能多的細(xì)胞中激活特異信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過抑制相應(yīng)的功能將它們的能量消耗節(jié)省下來維持效率更高的習(xí)慣性行為[20-21]。有研究表明，人類長期不良生活方式可能是影響高尿酸血癥的主要原因[13]。不良的飲食習(xí)慣（食用紅肉、海鮮、魚類、果糖、含糖軟飲料和酒精飲料）和運(yùn)動不足都會增加偶發(fā)性高尿酸血癥的風(fēng)險[22]。因此，從習(xí)慣性行為角度更改不良的生活方式可能是扭轉(zhuǎn)日趨嚴(yán)重的高尿酸血癥發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

綜上所述，為期4 周的氧嗪酸鉀、腺嘌呤和酵母膏藥物處理均可以建立穩(wěn)定的高尿酸血癥的動物模型。氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤對高尿酸血癥的作用尤其突出。本研究模型的建立對高尿酸血癥藥物的篩選與開發(fā)以及對非藥物干預(yù)治療有重要的意義。