鹵牛肉貯藏過(guò)程中氣味活性化合物變化及異味分析

潘曉倩，周慧敏，李 素，張順亮，趙 冰，劉 夢(mèng)，朱 寧，吳倩蓉，王守偉，喬曉玲，臧明伍，劉博文

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

鹵牛肉滋味醇厚，口感鮮美，是中國(guó)傳統(tǒng)美食中最具代表性的產(chǎn)品之一，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。傳統(tǒng)鹵牛肉通過(guò)鹵制、包裝、二次殺菌等工藝加工后，產(chǎn)品貨架期大幅度延長(zhǎng)，擴(kuò)大了銷售范圍[1]。但研究表明，二次熱殺菌會(huì)對(duì)產(chǎn)品的口感和風(fēng)味等食用品質(zhì)造成不同程度的損害[2-3]，且熱殺菌肉制品貯藏過(guò)程中易出現(xiàn)出油、出水、色澤變暗、香氣明顯減弱等品質(zhì)劣變現(xiàn)象[4-5]。

風(fēng)味是衡量熱殺菌肉制品，尤其是高溫殺菌肉制品貯藏期間品質(zhì)變化的重要指標(biāo)，研究認(rèn)為，高溫殺菌肉制品風(fēng)味劣變一般早于其他品質(zhì)的變化，是導(dǎo)致其可接受性喪失的主要原因[4]。風(fēng)味變化主要包括滋味和氣味兩方面[6]，滋味主要來(lái)源于非揮發(fā)性呈味物質(zhì)，包括無(wú)機(jī)鹽、游離氨基酸和小肽等；氣味主要來(lái)源于能夠刺激鼻腔嗅覺(jué)受體的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括醛、酮等不飽和羰基化合物、含硫化合物及一些雜環(huán)化合物等[7-8]。肉制品風(fēng)味的形成與變化是多種化合物共同作用的結(jié)果，貯藏對(duì)肉制品風(fēng)味有較大影響，適當(dāng)?shù)馁A藏時(shí)間可以為風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行氨基酸的Strecker降解、美拉德反應(yīng)等創(chuàng)造條件，進(jìn)而呈現(xiàn)更好的風(fēng)味。但貯藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，脂肪等物質(zhì)過(guò)度氧化會(huì)生成導(dǎo)致異味的風(fēng)味化合物[9-10]，影響產(chǎn)品品質(zhì)。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者多采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用[11]、氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）[12]和電子鼻（electronic nose，E-nose）[13]等分析方法對(duì)牛肉制品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究。李娟[13]采用頂空固相微萃取-GC-MS聯(lián)用的方法分析了我國(guó)不同地區(qū)23 種醬牛肉中揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成、含量和整體貢獻(xiàn)。Ma等[14]采用響應(yīng)面法優(yōu)化煮制牛肉風(fēng)味物質(zhì)提取的固相微萃取條件。Lepper-Blilie等[15]研究了不同尺寸大小、烹飪方法和加熱過(guò)程對(duì)烤牛肉過(guò)熱味形成的影響；St.Angelo等[16]通過(guò)感官評(píng)價(jià)和GC-MS分析發(fā)現(xiàn)己醛和2,3-辛二酮與感官評(píng)分和硫代巴比妥酸值顯著相關(guān)，其可能是牛肉過(guò)度加熱產(chǎn)生異味的主要成分；Gong Hui等[17]分析了辣牛肉煮制過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)煮制4 h可獲得最佳和最穩(wěn)定的風(fēng)味。還有學(xué)者研究比較了不同牛的品種[18]、不同部位[19]、熬煮時(shí)間[20]、滾揉時(shí)間[21]和腌制時(shí)加水量[22]等因素對(duì)牛肉制品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。但針對(duì)鹵牛肉制品在常溫貯藏過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物變化及異味物質(zhì)的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)采用吹掃捕集-熱脫附（purge and trap-thermal desorption，P&T-TDS）技術(shù)對(duì)貯藏0（即成品）、3、6、9、12 個(gè)月的鹵牛肉風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行提取富集，借助氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometrymass spectrometry，GC-O-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)樣品揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行定性定量分析，再結(jié)合氣味活性值（odor activity value，OAV）和感官分析，研究鹵牛肉產(chǎn)品貯藏過(guò)程中風(fēng)味化合物變化規(guī)律，分析異味的主要來(lái)源，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），以期為開(kāi)發(fā)鹵牛肉保鮮劑、優(yōu)化貯藏條件及貯藏過(guò)程中品質(zhì)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食鹽、白糖等 市售；牛霖 五豐福成食品有限公司；花椒、大料、小茴香等香辛料 河北思味特食品有限公司；鋁箔復(fù)合袋 北京萬(wàn)華鋁塑包裝有限公司。

2-甲基-3-庚酮標(biāo)品、C8～C25系列正構(gòu)烷烴（均為分析純） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KBF恒溫恒濕箱 德國(guó)Binder公司；Gerstel TDS半自動(dòng)熱脫附進(jìn)樣器、Tenax-TA石英玻璃吸附管、嗅聞儀德國(guó)Gerstel公司；TSQ8000 GC-MS聯(lián)用儀、TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Cascada BIO純水機(jī) 美國(guó)Pall公司；F6/10-10G超細(xì)勻漿器 上海Fluko流體機(jī)械制造有限公司；動(dòng)態(tài)頂空制樣瓶 自制。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備與貯藏

鹵牛肉由實(shí)驗(yàn)室小型加工車間自制，工藝流程：原料肉解凍、修整分割、焯水、鹵制、包裝、二次殺菌（115 ℃、20 min）；鹵牛肉大小約為10 cm×8 cm×6 cm，采用鋁箔復(fù)合袋真空包裝。產(chǎn)品制作完成后取足量樣品放置于實(shí)驗(yàn)室恒溫恒濕箱（25 ℃、相對(duì)濕度50%）中，分別在貯藏第0、3、6、9、12 個(gè)月共5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣。該鹵牛肉產(chǎn)品在貯藏12 個(gè)月時(shí)，色澤明顯變暗，香氣較弱，異味較強(qiáng)，已不具備該產(chǎn)品的特有品質(zhì)。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味化合物提取

為保證取樣均一性，室溫條件將鹵牛肉用破壁機(jī)切碎混勻，然后準(zhǔn)確稱取10 g樣品置于動(dòng)態(tài)頂空制樣樣品瓶，迅速加入質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL 2-甲基-3-庚酮1 μL作為內(nèi)標(biāo)，旋緊瓶蓋，一端通氮?dú)猓祾吡魉贋?0 mL/min，另一端接老化后的Tenax-TA石英玻璃吸附管進(jìn)行樣品富集，55 ℃吸附40 min，取出吸附管插入TDS進(jìn)樣口進(jìn)行分析，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次取平均值。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味化合物測(cè)定程序

TDS和GC-MS程序參照周慧敏等[23]的方法，并適當(dāng)修改。

TDS程序：采用標(biāo)準(zhǔn)加熱模式，氦氣不分流，流速為20 mL/min；初始溫度40 ℃；然后以40 ℃/min的速率升溫至210 ℃，保持5 min；傳輸線溫度為215 ℃。

冷進(jìn)樣條件：標(biāo)準(zhǔn)加熱模式；液氮冷卻；初始溫度為-100 ℃；以10 ℃/min的速率升溫至215 ℃，保持5 min；分流比為20∶1。

GC條件：TG-Wax MS極性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；以高純氦氣作為載氣；采用不分流模式，流速1.0 mL/min，保持2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，升溫程序：柱溫40 ℃保持3 min；然后以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持1 min；再以8 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持3 min。

MS條件：電子電離源，電離能量70 eV，電離源溫度280 ℃；接口溫度260 ℃；傳輸線溫度230 ℃；采用全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍m/z40～600，掃描2 s。

1.3.4 嗅聞檢測(cè)

揮發(fā)性風(fēng)味化合物經(jīng)過(guò) GC 分離后按照1∶1分別進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器和嗅聞檢測(cè)器，嗅聞傳輸線溫度設(shè)為200 ℃。挑選3 位嗅覺(jué)敏銳并通過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的評(píng)價(jià)員在嗅聞口進(jìn)行嗅聞，記錄聞到的氣味、保留時(shí)間、氣味特征及強(qiáng)度。強(qiáng)度分5 個(gè)等級(jí)（1：氣味非常微弱，2：氣味微弱，3：氣味中等，4：氣味強(qiáng)烈，5：氣味非常強(qiáng)烈）。每種化合物的氣味描述和時(shí)間由至少2 名評(píng)價(jià)員確認(rèn)一致時(shí)記為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

定性分析：譜庫(kù)檢索鑒定根據(jù)待測(cè)化合物質(zhì)譜圖與美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院、Wiley數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選取反相似度指數(shù)和正相似度指數(shù)均大于800的化合物，并且計(jì)算每種待測(cè)化合物的保留指數(shù)（retention index，RI）并與http://www.flavornet.org記載的RI值進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合嗅聞判定結(jié)果對(duì)鹵牛肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。RI按式（1）計(jì)算：

式中：N為低碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)；n為高、低碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)差；X為待測(cè)化合物；tX、tN+n、tN分別為待測(cè)化合物、高碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴和低碳原子數(shù)正構(gòu)烷烴在相同條件下的保留時(shí)間/min。

定量分析：根據(jù)已知內(nèi)標(biāo)2-甲基-3-庚酮的含量及峰面積，按式（2）計(jì)算待測(cè)風(fēng)味化合物相對(duì)含量：

式中：C為待測(cè)化合物含量/（μg/kg）；Ax為待測(cè)化合物的峰面積；C0為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度/（μg/μL）；V為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)樣量/μL；A0為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；m為待測(cè)樣品的質(zhì)量/g。

根據(jù)文獻(xiàn)[22]的方法按式（3）計(jì)算OAV：

式中：C為待測(cè)化合物含量/（μg/kg）；T為該物質(zhì)在水中的感官閾值[24]/（μg/kg）。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

針對(duì)樣品特征并參照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評(píng)定規(guī)范》[25]的要求制定感官評(píng)分體系。挑選10 名經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)人員，年齡20～40 歲，5 男5 女。將待測(cè)樣品隔水加熱5 min，打開(kāi)包裝袋，將鹵牛肉樣品切成2～3 mm厚的薄片進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，采用10 分制原則和分段式規(guī)則，評(píng)價(jià)人員在整個(gè)品嘗和打分過(guò)程中互不干擾，結(jié)果取平均值，具體的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 鹵牛肉感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of stewed marinated beef

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，結(jié)果以±s表示，采用SPSS Statistics 21.0進(jìn)行Duncan顯著性差異分析（P＜0.05，差異顯著）和Pearson相關(guān)性分析。利用UnscrambX 10.1軟件進(jìn)行PCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹵牛肉貯藏過(guò)程中感官評(píng)價(jià)結(jié)果

通過(guò)感官評(píng)價(jià)，可以對(duì)產(chǎn)品貯藏過(guò)程中的感官變化有更直觀更科學(xué)的認(rèn)識(shí)，不同貯藏時(shí)間的鹵牛肉感官評(píng)分結(jié)果如表2所示，貯藏過(guò)程中鹵牛肉感官品質(zhì)有所改變，色澤、組織形態(tài)和可接受度在貯藏前期（貯藏3 個(gè)月以內(nèi)）變化不顯著，之后隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降（P＜0.05）。具體表現(xiàn)為色澤變暗，由紅棕色變?yōu)榘导t色，且光澤度下降；質(zhì)地略松散，彈性變差。風(fēng)味得分在貯藏前期（3 個(gè)月）有所增加，隨后開(kāi)始顯著下降（P＜0.05），其可能原因?yàn)椋?）鹵牛肉在前期貯藏過(guò)程中一方面香辛料的氣味和肉香味會(huì)更加柔和；2）風(fēng)味物質(zhì)通過(guò)氨基酸降解、美拉德反應(yīng)等呈現(xiàn)更好的風(fēng)味，而貯藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)肉香味變淡，且脂肪過(guò)度氧化、氨基酸過(guò)度降解等途徑會(huì)產(chǎn)生異味，導(dǎo)致風(fēng)味劣變。在貯藏12 個(gè)月時(shí)，色澤明顯變暗，出現(xiàn)異味，感官評(píng)價(jià)顯示不可接受，表明已經(jīng)到達(dá)貨架期終點(diǎn)。

表2 不同貯藏時(shí)間樣品感官評(píng)分Table 2 Sensory scores of samples stored for different periods of time

2.2 不同貯藏時(shí)間鹵牛肉中氣味活性化合物變化

使用P&T-TDS-GC-MS法對(duì)貯藏0、3、6、9、12 個(gè)月的鹵牛肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共檢出110 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，每種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)產(chǎn)品整體風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)度由揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃度與感官閾值共同決定，通常認(rèn)為OAV不小于1的揮發(fā)性風(fēng)味化合物對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，OAV不小于0.1、小于1的揮發(fā)性風(fēng)味化合物對(duì)整體風(fēng)味起到重要的修飾作用[26]。因此計(jì)算每種揮發(fā)性風(fēng)味化合物的OAV，在不同貯藏時(shí)間的5 組樣品中分別檢出OAV不小于0.1的揮發(fā)性風(fēng)味化合物37、42、44、42、39 種，結(jié)果如表3所示。其中醛類物質(zhì)最多，為13 種，其次為烯烴類、醇類、酯類、酚類、酮類、酸類和其他，0～12 個(gè)月貯藏時(shí)間的OAV總和分別為1 756.54、2 240.53、1 645.19、1 808.45、2 197.17，圖1、2分別為貯藏過(guò)程中各類化合物OAV和所占比例的變化。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，氣味活性化合物的OAV總和在貯藏初期（3 個(gè)月內(nèi)）顯著增加，隨后有所下降，在貯藏6 個(gè)月時(shí)達(dá)到最低值，之后持續(xù)增加。由圖2可知，醛類物質(zhì)OAV占比最高（34.53%～70.55%），其次為醇類（27.72%～57.91%），其他各類物質(zhì)所占比例較少。醛類物質(zhì)的OAV除第6個(gè)月略有降低外，整體呈持續(xù)增加趨勢(shì)；酮類、酚類和酸類物質(zhì)的OAV隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)增加，而酯類、醇類和其他類物質(zhì)的OAV在貯藏過(guò)程中呈先增加后減少的趨勢(shì)，烯烴類物質(zhì)在貯藏期間較穩(wěn)定。

圖1 各類氣味活性化合物的OAV在貯藏期間的變化Fig.1 OAV changes of odor-active compounds during storage

圖2 各類氣味活性化合物的OAV在不同貯藏時(shí)間樣品中的百分比Fig.2 Proportion of OAV for various odor-active compounds in samples stored for different periods of time

2.3 不同貯藏時(shí)間樣品中各類揮發(fā)性氣味活性化合物變化

2.3.1 酯類化合物

酯類物質(zhì)閾值較低，能夠賦予產(chǎn)品特殊的果味和甜味。如表3所示，0～12 個(gè)月的貯藏過(guò)程中分別檢出4、5、5、5、4 種風(fēng)味活性酯類物質(zhì)，其OAV總和呈先增大，貯藏3 個(gè)月時(shí)達(dá)到最大，之后持續(xù)減小的趨勢(shì)。這主要由占比最高的乙酸乙酯所主導(dǎo)，鹵牛肉制作過(guò)程中添加的料酒含有較多的乙醇，在熱加工過(guò)程中發(fā)生的酯化反應(yīng)可能是乙酸乙酯的主要來(lái)源。此外牛肉中含有豐富的游離脂肪酸，貯藏過(guò)程中脂肪水解產(chǎn)生的游離脂肪酸可能和脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，因此貯藏初期鹵牛肉的風(fēng)味更加濃郁。之后的貯藏過(guò)程中酯類風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生降解，而降解產(chǎn)生的化合物進(jìn)一步與美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物或氨基酸等發(fā)生后續(xù)反應(yīng)，生成其他化合物[27]。

表3 不同貯藏時(shí)間樣品中氣味活性化合物的OAVTable 3 OAV of various odor-active compounds in samples stored for different periods of time

2.3.2 醇類化合物

貯藏0～12 個(gè)月的樣品中分別檢出8、9、10、8、7 種風(fēng)味活性醇類化合物，鹵牛肉成品中醇類物質(zhì)的OAV最高，為1 012.75，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率為57.66%。整個(gè)貯藏期間醇類物質(zhì)OAV總和呈先增大，貯藏3 個(gè)月時(shí)達(dá)到最大，之后持續(xù)減小的趨勢(shì)，這主要由占比最高的芳樟醇所主導(dǎo)，可能是由于貯藏后期醛類等化合物大量產(chǎn)生使得芳樟醇占比不斷減少。醇類物質(zhì)的產(chǎn)生與氨基酸代謝、脂肪降解氧化、甲基酮還原及微生物生長(zhǎng)繁

殖密切相關(guān)[28]。宋澤等[19]分析大部分醇類化合物是肉中脂肪酸降解的氧化產(chǎn)物，也可由醛還原成醇，可賦予牛肉甜香味。通常醇類物質(zhì)閾值較高，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味貢獻(xiàn)較小，但貯藏過(guò)程中檢測(cè)到一些不飽和醇，如芳樟醇、α-松油醇，閾值較低，可能對(duì)香氣變化有重要作用。研究[29]表明，樣品中大量檢出的芳樟醇、α-松油醇、4-萜烯醇、香葉醇、桉樹(shù)醇等可能來(lái)源于生姜加熱產(chǎn)生的風(fēng)味，這與鹵牛肉制作過(guò)程中加入的輔料密切相關(guān)。具有蘑菇氣味的1-辛烯-3-醇通常被認(rèn)為是花生四烯酸的氧化產(chǎn)物，其OAV在貯藏過(guò)程中略有波動(dòng)，但整體呈逐漸增加的趨勢(shì)，在貯藏12 個(gè)月時(shí)OAV為38.14，約是成品中OAV（9.32）的4.12 倍，可能是異味的主要來(lái)源，這與周慧敏等[30]的研究結(jié)果相似。

2.3.3 醛類化合物

醛類化合物通常閾值較低，氣味濃郁，對(duì)肉制品香味形成有重要作用，其中多數(shù)直鏈醛由不飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化和氧化脫氨-脫羧作用產(chǎn)生，多數(shù)支鏈醛由氨基酸的Strecker降解產(chǎn)生[31]。不同貯藏時(shí)間樣品中分別檢出12、9、10、11、10 種風(fēng)味活性醛類化合物，鹵牛肉成品中醛類物質(zhì)的OAV為653.65，貯藏12 個(gè)月時(shí)OAV最高，達(dá)1 550.11，是成品中的2.37 倍，對(duì)產(chǎn)品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率達(dá)70.55%。醛類物質(zhì)中OAV占比最大的是反,反-2,4-癸二烯醛，具有油炸氣味，其次為癸醛、壬醛、正辛醛等。

直鏈醛類主要來(lái)源于脂肪氧化，如己醛具有青草味，庚醛、辛醛、壬醛具有脂肪氣味、癸醛具有牛脂氣味，這些醛類化合物閾值較低，對(duì)肉制品風(fēng)味形成貢獻(xiàn)較大[32]，一般在低濃度時(shí)對(duì)產(chǎn)品香氣的形成起到積極作用，而濃度較大時(shí)則變?yōu)楫愇兜闹饕獊?lái)源。周慧敏等[30]研究表明，這些直鏈醛類主要來(lái)自油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸這些不飽和脂肪酸的氧化降解；反,反-2,4-癸二烯醛主要來(lái)自亞油酸的自動(dòng)氧化，可見(jiàn)脂肪氧化降解對(duì)風(fēng)味的劣變影響較大。

2.3.4 酮類、酚類和酸類化合物

酮類化合物多來(lái)源于不飽和脂肪酸氧化降解，也可能來(lái)源于醇類的氧化或酯類的降解。貯藏0～12 個(gè)月時(shí)間樣品中分別檢出3、3、3、4、4 種風(fēng)味活性酮類化合物，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率相對(duì)較?。?.04%～0.16%），酮類化合物的OAV在貯藏過(guò)程中持續(xù)增加，尤其在貯藏后期顯著增加，貯藏12 個(gè)月時(shí)，OAV為3.52，是成品的5.25 倍，因此貯藏后期脂肪氧化加快。酮類物質(zhì)OAV的變化主要由 2-壬酮所主導(dǎo)，2-壬酮具有肥皂氣味，可能與貯藏后期異味形成有關(guān)。

不同貯藏時(shí)間樣品中分別檢出3、4、5、5、5 種風(fēng)味活性酚類化合物，對(duì)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)率相對(duì)較?。?.02%～0.03%），包括苯酚、愈創(chuàng)木酚等。酚類物質(zhì)多具有煙熏、藥香氣味，來(lái)源于纖維素等的熱解[33]，這可能與鹵制過(guò)程中加入的香辛料有關(guān)。

產(chǎn)品中檢出的風(fēng)味活性酸類物質(zhì)較少，不同貯藏時(shí)間樣品中分別檢出0、1、2、2、2 種風(fēng)味活性酸類化合物，其種類和OAV在貯藏過(guò)程中持續(xù)增加，主要來(lái)源于脂質(zhì)的氧化降解，短鏈脂肪酸對(duì)產(chǎn)品整體風(fēng)味有所影響，辛酸具有汗水和奶酪的味道，癸酸具有酸敗的味道，這些酸類物質(zhì)的增加可能對(duì)產(chǎn)品貯藏后期異味的形成有所影響。

2.3.5 烯烴類和其他類化合物

不同貯藏時(shí)間樣品中分別檢出10、11、11、10、9 種風(fēng)味活性烯烴類化合物。烷烴類化合物主要來(lái)源于脂質(zhì)分解，其中正構(gòu)烷烴可能是由脂肪自動(dòng)氧化產(chǎn)生，支鏈烷烴則可能由原料中支鏈脂肪酸氧化產(chǎn)生。烷烴類化合物大多香氣較弱或無(wú)味，但烴類化合物可能作為雜環(huán)類化合物的重要中間體對(duì)風(fēng)味形成具有基底作用[34]。烯烴類化合物可作為醛、酮類物質(zhì)的前體物質(zhì)對(duì)風(fēng)味形成具有潛在作用。貯藏過(guò)程中檢出的烯烴類物質(zhì)主要有檜烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、3-異丙基-6-亞甲基-1-環(huán)己烯和γ-松油烯，閾值較低，可能對(duì)樣品風(fēng)味變化有所影響。貯藏過(guò)程中還檢出少量雜環(huán)類物質(zhì)和醚類物質(zhì)，如2-乙烷基-3,5-二甲基吡嗪具有土豆風(fēng)味，僅在貯藏前6 個(gè)月的樣品中檢出，且在貯藏3 個(gè)月樣品中OAV最大，為108.67，因此可能對(duì)樣品香氣起積極作用，可能與樣品貯藏后期香氣變淡相關(guān)。

2.4 相關(guān)性分析

將氣味活性化合物與風(fēng)味感官評(píng)分、貯藏時(shí)間進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如表4所示。分別有16、12 種氣味活性化合物與風(fēng)味感官評(píng)分和貯藏時(shí)間顯著相關(guān)。其中，1-辛烯-3-醇、庚醛、正辛醛、壬醛、呋喃甲醛、癸醛、反,反-2,4-癸二烯醛、2-壬酮、左旋香芹酮、辛酸、癸酸共11 種物質(zhì)的OAV與風(fēng)味感官評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與貯藏時(shí)間呈正相關(guān)，表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，風(fēng)味逐漸劣變，這些物質(zhì)含量逐漸增加，可能是鹵牛肉異味的主要來(lái)源。而乙酸乙酯、乙酸丁酯、桉樹(shù)醇、芳樟醇、4-萜烯醇、香葉醇、甲苯、2-乙烷基-3,5-二甲基吡嗪共8 種物質(zhì)的OAV與風(fēng)味感官評(píng)分呈正相關(guān)，與貯藏時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，可能與貯藏過(guò)程中鹵牛肉香氣減弱相關(guān)。

表4 氣味活性化合物與風(fēng)味感官評(píng)分、貯藏時(shí)間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 4 Pearson’s correlation coefficients between odor-active compounds and sensory flavor score or storage time

2.5 嗅聞結(jié)果及異味分析

GC-O技術(shù)是將GC分離的化合物通過(guò)人的嗅覺(jué)進(jìn)行識(shí)別，如表5所示，不同貯藏時(shí)間樣品中共檢測(cè)到19 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，遠(yuǎn)小于質(zhì)譜檢測(cè)出的風(fēng)味化合物種類。結(jié)合OAV分析及嗅聞檢測(cè)結(jié)果，共同確定的氣味活性化合物有16 種，因此這2 種鑒定方法具有一致性。同時(shí)，OAV小于0.1的乙醇、乙酸、反-肉桂醛可在GC-OMS中檢測(cè)到，可見(jiàn)兩種鑒定方法存在差異。

表5 GC-O法鑒定不同貯藏時(shí)間鹵牛肉中氣味活性化合物的氣味強(qiáng)度Table 5 Odor-active compounds of stewed marinated beef stored for different periods of time identified by GC-O

食品風(fēng)味劣變的可能原因有2 個(gè)：1）香味化合物的損失；2）產(chǎn)生異味的風(fēng)味化合物含量的增加。在本研究中，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸乙酯、乙醇、桉樹(shù)醇、芳樟醇、反-肉桂醛的氣味強(qiáng)度整體呈降低趨勢(shì)或保持恒定，異戊醛、D-檸檬烯和2-乙烷基-3,5-二甲基吡嗪僅在成品或貯藏前期樣品中被檢出，因此這些可能對(duì)樣品風(fēng)味起到積極的作用。1-辛烯-3-醇、庚醛、正辛醛、壬醛、癸醛、反,反-2,4-癸二烯醛共6 種物質(zhì)在貯藏期間嗅聞到的氣味強(qiáng)度呈增加趨勢(shì)，尤其在貯藏末期氣味愈加強(qiáng)烈，且這6 種化合物的OAV均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而增加，與風(fēng)味感官評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，因此這些化合物氣味強(qiáng)度的增加是鹵牛肉貯藏后期異味產(chǎn)生的主要原因。4-異丙基苯甲醛、2-壬酮、乙酸、辛酸僅在貯藏后期樣品中被檢出，推測(cè)可能與后期風(fēng)味劣變有關(guān)。

2.6 氣味活性化合物的PCA

采用PCA對(duì)不同貯藏時(shí)間鹵牛肉的氣味活性化合物（OAV≥1）進(jìn)行分析，得到PCA得分圖（圖3）與相關(guān)性載荷圖（圖4）。由圖3可知，PC1貢獻(xiàn)率為83%，PC2貢獻(xiàn)率為16%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99%。5 組樣品之間差異較為明顯，在整個(gè)象限均無(wú)重疊，表明通過(guò)PCA能夠判別不同貯藏時(shí)間的鹵牛肉樣品。貯藏前期（前6 個(gè)月）的樣品分布在PC1的負(fù)方向，貯藏后期（9、12 個(gè)月）的樣品分布在PC1的正方向，成品和貯藏3 個(gè)月的樣品在PC1上接近，但在PC2上存在明顯差異；除貯藏3 個(gè)月的樣品外，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其他4 組樣品PC1得分從負(fù)方向漸漸移動(dòng)到正方向，結(jié)合感官評(píng)分結(jié)果說(shuō)明隨著不同貯藏時(shí)間樣品風(fēng)味劣變，其在PCA圖中的分布變化趨勢(shì)明顯。

圖3 不同貯藏時(shí)間鹵牛肉氣味活性化合物PCA得分圖Fig.3 PCA score plot of odor active compound of braised beef at different storage time

載荷圖反映了氣味活性化合物對(duì)各PC的影響程度，即化合物載荷系數(shù)的絕對(duì)值越大，對(duì)PC的影響也越大[31]。由圖4可知，載荷系數(shù)為正數(shù)，與PC1高度相關(guān)的化合物主要有正辛醛、壬醛、反,反-2,4-癸二烯醛、2-壬酮、4-異丙基苯甲醛、1-辛烯-3-醇等，其主要來(lái)源于脂肪氧化，且圖4中位于右側(cè)即貯藏后期（9、12 個(gè)月）的樣品這些化合物的濃度更高；載荷系數(shù)為負(fù)數(shù)，與PC1高度相關(guān)的化合物主要包括4-萜烯醇、芳樟醇、乙酸乙酯等，意味著這些化合物在貯藏前期（6 個(gè)月以前）的樣品中含量更高。與PC2高度相關(guān)的化合物相對(duì)較少，主要包括乙酸香葉酯、D-檸檬烯等。

圖4 不同貯藏時(shí)間鹵牛肉氣味活性化合物PCA載荷圖Fig.4 Correlation loadings plot of PCA of odor active compound of braised beef at different storage time

3 結(jié) 論

通過(guò)采用感官評(píng)價(jià)、P&T-TDS-GC-O-MS技術(shù)定性定量分析樣品揮發(fā)性風(fēng)味化合物和OAV計(jì)算分析樣品中氣味活性化合物相結(jié)合的方法綜合分析鹵牛肉樣品在常溫貯藏期間氣味的變化與異味的來(lái)源。感官結(jié)果顯示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，鹵牛肉品質(zhì)下降，表現(xiàn)為色澤逐漸變暗，彈性降低，貯藏后期香氣逐漸減弱，異味明顯加重，可接受度降低。貯藏期間共得到52 種氣味活性化合物（OAV≥0.1），醛類物質(zhì)最多，為13 種，主要源于脂肪氧化，其次為烯烴類、醇類、酯類、酚類、酮類、酸類和其他。各類化合物的OAV所占比例中醛類物質(zhì)占比最高（34.53%～70.55%），其次為醇類（27.72%～57.91%），其他各類物質(zhì)所占比例較少。結(jié)合相關(guān)性分析與GC-O鑒定，1-辛烯-3-醇、庚醛、正辛醛、壬醛、癸醛、反,反-2,4-癸二烯醛共6 種化合物與風(fēng)味感官評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與貯藏時(shí)間呈正相關(guān)，具有酸味和脂肪味，貯藏期間氣味強(qiáng)度增加，可能是產(chǎn)生異味的主要物質(zhì)；2-壬酮、辛酸與風(fēng)味感官評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，與貯藏時(shí)間呈正相關(guān)且僅在貯藏后期樣品中被嗅聞檢出，可能對(duì)鹵牛肉后期風(fēng)味劣變有所影響。PCA作為一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法可較好地區(qū)分和分離不同貯藏時(shí)間的鹵牛肉樣品。