蘭茂牛肝菌菌柄和菌蓋中鮮味成分的分析及菌蓋中鮮味肽的鑒定

梁佳明，王肖肖，張藍(lán)云，胡旭佳

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650093）

鮮味是食品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，因?yàn)樗绊懼M(fèi)者對(duì)食品的偏好[1]。鮮味是5 種基本味覺(jué)之一，同時(shí)也是被理論界最后確認(rèn)的一種味道[2-3]。鮮味的概念提出于1908年[4]，鮮味是包括鮮味氨基酸、5’-呈味核苷酸、鮮味多肽在內(nèi)的多種鮮味物質(zhì)[5-7]與鮮味受體結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的信號(hào)傳遞過(guò)程，再經(jīng)由味覺(jué)神經(jīng)傳入到大腦的味覺(jué)中樞，經(jīng)分析整合產(chǎn)生的化學(xué)風(fēng)味[8]。鮮味受體是一種能響應(yīng)L-谷氨酸、一定程度上響應(yīng)L-天冬氨酸的C型G蛋白偶聯(lián)受體，這種受體是屬于T1R家族，包括T1R1和T1R3[9-11]。相關(guān)研究報(bào)道了味覺(jué)感受細(xì)胞中的通道蛋白CALHM1[12]，進(jìn)一步闡述了這一路徑的分子機(jī)制。

鮮味物質(zhì)廣泛存在于各種天然產(chǎn)品中，包括奶酪、肉類、海鮮產(chǎn)品[13-15]，尤其是在蘑菇中。蘑菇令人愉悅的鮮味主要來(lái)源于多肽、呈味氨基酸及5’-核苷酸和有機(jī)酸[16-17]。不同類型的鮮味物質(zhì)與鮮味受體的作用方式不同，分子動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明鮮味肽與鮮味受體T1R1/T1R3的結(jié)合域不同于其他鮮味物質(zhì)與鮮味受體結(jié)合的結(jié)合域，這也導(dǎo)致了鮮味肽具有獨(dú)特的味道[18-20]。鮮味肽是一種分子質(zhì)量小于5 000 u的寡肽。其風(fēng)味特征主要取決于氨基酸組成、肽鏈長(zhǎng)度、末端氨基酸殘基、側(cè)鏈、帶電離子和空間結(jié)構(gòu)等[21-23]。鮮味肽最初從用木瓜蛋白酶處理過(guò)的牛肉中純化出來(lái)，一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定為L(zhǎng)ys-Gly-Asp-Glu-Ser-Leu-Ala，具有明顯的鮮味。隨后，在各種食物中，陸續(xù)已經(jīng)有100多種鮮味肽被發(fā)現(xiàn)，如從帕爾馬火腿和金華火腿中分離并確認(rèn)的水溶性多肽Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val和Ala-His-Ser-Val-Arg-Phe-Tyr[24]；還有一些酸性多肽Asp-Glu-Ser、Glu-Asp-Glu、Thr-Glu和Ser-Glu-Glu[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，鮮味肽不僅不會(huì)掩蓋食物中的其他風(fēng)味，如酸、甜、苦和咸，它們還增強(qiáng)了這些風(fēng)味特征[27-28]。因此，它在蔬菜、肉類、乳制品甚至葡萄酒的風(fēng)味改良中有許多應(yīng)用[29-30]。但是關(guān)于鮮味肽的味覺(jué)特性仍存在爭(zhēng)議，需要發(fā)現(xiàn)更多的鮮味多肽闡述其鮮味機(jī)制和作用特性。

野生食用菌味道鮮美，云南是中國(guó)乃至全世界野生食用菌種質(zhì)資源最為豐富的地區(qū)[23]，云南野生食用菌有850多種，占全世界食用菌種的40%以上，占中國(guó)食用菌的90%以上[31]。據(jù)調(diào)查，云南省野生食用菌資源量50萬(wàn) t左右，社會(huì)產(chǎn)量10萬(wàn) t，產(chǎn)值約20億 元。居我國(guó)食用菌種類、自然產(chǎn)量、社會(huì)產(chǎn)量和出口量之首[32]。其中牛肝菌，物種繁多，而且其加工品也遠(yuǎn)銷歐美和日韓，是貿(mào)易量最大的野生食用菌之一，但是野生食用菌具有很強(qiáng)的季節(jié)性，僅產(chǎn)于每年的6—10月，目前仍以原料型或粗加工傳統(tǒng)產(chǎn)品為主，產(chǎn)品附加值低，在很大程度上影響了野生食用菌的消費(fèi)量和市場(chǎng)，已難以滿足現(xiàn)代消費(fèi)需求。如何最大限度地保持原有的風(fēng)味，進(jìn)行科學(xué)的加工和貯藏是野生菌產(chǎn)業(yè)急需解決的問(wèn)題。

本研究根據(jù)野生牛肝菌的鮮美程度和消費(fèi)量，選取蘭茂牛肝菌進(jìn)行鮮味成分分析，通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)對(duì)蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中的鮮味氨基酸及5’-核苷酸進(jìn)行分析，選取具有強(qiáng)烈鮮味的菌蓋進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜（gel filtration chromatography，GFC）和反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）的分離純化，對(duì)獲得的樣品通過(guò)納升級(jí)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，nano UPLCMS/MS）檢測(cè)方法進(jìn)行氨基酸序列檢測(cè)和分子質(zhì)量測(cè)定，每一過(guò)程均由感官評(píng)價(jià)進(jìn)行指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蘭茂牛肝菌購(gòu)買于昆明木水花野生菌市場(chǎng)；Sephadex G15 上海麥克林生化試劑有限公司；5 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala），純度均大于98.0%） 美國(guó)Sigma公司；5 種核苷酸（5’-腺苷酸（5’-adenosine acid，5’-AMP）、5’-鳥(niǎo)苷酸（5’-guanosine acid，5’-GMP）、5’-胞苷酸（5’-cytidine acid，5’-CMP）、5’-尿苷酸（5’-uridine acid，5’-UMP）、5’-肌苷酸（5’-inosine acid，5’-IMP），純度均大于98.0%） 中國(guó)藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)中使用的化學(xué)試劑均為分析純，所有凍干粉末和合成的多肽都貯存在-40 ℃冰箱中。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF-35粉碎機(jī) 溫嶺林大機(jī)械公司；超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；HC-3018R低溫高速離心機(jī) 安徽器械有限公司； 1260高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司；nano UPLC-MS/MS儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 蘭茂牛肝菌水提物的制備

新鮮蘭茂牛肝菌菌柄和菌蓋分開(kāi)清洗，切成片狀，烘干去水，制成干物質(zhì)，備用。按照1∶40（g/mL）的料液比，加入去離子水，置于高壓反應(yīng)釜中反應(yīng)2 h，于4 ℃、4 000 r/min離心20 min。回收上清液，冷凍干燥，制得蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋水提物粉末，于-40 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蘭茂牛肝菌中游離氨基酸含量的檢測(cè)

通過(guò)Waters AccQ·Tag柱前衍生法結(jié)合HPLC技術(shù)，對(duì)蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中的5 種游離氨基酸天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）進(jìn)行定量分析。

樣品溶液的制備：將1.0 g蘭茂牛肝菌水提物干粉，用200 mL的50%乙醇溶液進(jìn)行稀釋，超聲2 次，每次30 min，抽濾去渣，合并濾液，濾液80 ℃旋蒸近干，超純水定容至10 mL，待衍生。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：用0.1 mol/L HCl溶液對(duì)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（1 nmol/μL）進(jìn)行稀釋，配制成濃度分別為0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 nmol/μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

空白液的制備：0.1 mol/L鹽酸溶液。

衍生化處理：分別取上述三液各400 μL于1.5 mL離心管中，加入1 mol/L的衍生試劑A（1 mol/L三乙胺-乙腈溶液）200 μL，衍生試劑B（0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液）200 μL，加入正己烷800 μL，混勻，12 000 r/min離心5 min，取下層溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，超聲5 min，待測(cè)。

HPLC條件：Waters AccQ·Tag分析柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動(dòng)相A：10% AccQ?Tag的水溶液，流動(dòng)相B：60%乙腈溶液；梯度洗脫條件：0～0.3 min，100%～97% A，0%～3% B；0.3～37 min，97%～95% A，3%～5% B；37～38 min，95%～89% A，5%～11% B；38～90 min，89%～67% A，11%～33% B；90～93 min，67% A，33% B；柱溫37 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 蘭茂牛肝菌中核苷酸含量的檢測(cè)

采用HPLC技術(shù)檢測(cè)蘭茂牛肝菌中5’-核苷酸的含量。稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入25 mL溫水進(jìn)行溶解，超聲15 min；用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)樣品的pH值至1.7±0.1，靜置1 min，用1 mol/L NaOH溶液將樣品的pH值調(diào)整至4.5±0.1。將溶液轉(zhuǎn)至50 mL刻度管中，去離子水反復(fù)清洗離心管3 次，轉(zhuǎn)移到刻度管中，去離子水定容至50 mL，混勻后經(jīng)濾紙過(guò)濾，濾液采用SAX固相萃取柱凈化，3 mL甲醇、3 mL水進(jìn)行活化，取1 mL濾液上樣，抽至近干，1 mL磷酸二氫鉀進(jìn)行洗脫，抽干，用磷酸二氫鉀定容至1 mL，混勻后0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

HPLC條件：Waters Atlantis T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為10 mol/L磷酸二氫鉀（pH 5.6）溶液；等度洗脫；柱溫37 ℃；流速0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.4 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋水提物感官分析

感官評(píng)估小組由10 名成員組成，男性5 名，女性5 名，年齡21～30 歲，均為無(wú)嗅覺(jué)和味覺(jué)障礙的專家。根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估員方法（ISO-8586-12012：感官分析-感官評(píng)價(jià)員的挑選、訓(xùn)練和監(jiān)督的一般指南），所有團(tuán)隊(duì)成員都接受了識(shí)別基本口味（包括甜味、苦味、酸味、咸味和鮮味）的培訓(xùn)，并擁有至少1 a的感官評(píng)估經(jīng)驗(yàn)。評(píng)估在感官實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，該實(shí)驗(yàn)室符合ISO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)Zhang Jianan等[33]的報(bào)道，稍作修改。以氯化鈉（3.5 mg/mL）、蔗糖（10 mg/mL）、檸檬酸（0.8 mg/mL）、咖啡因（0.8 mg/mL）和谷氨酸鈉（3.5 mg/mL）-氯化鈉（3.5 mg/mL）分別用作咸、甜、酸、苦和鮮味的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。為了最大限度地減少純化過(guò)程中殘留試劑對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響，待測(cè)樣品在測(cè)試前進(jìn)行2 次凍干。將待測(cè)樣品的凍干粉末用去離子水配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，通過(guò)加入氫氧化鈉（1.0 mol/L）或鹽酸（1.0 mol/L）將樣品pH值調(diào)整至6.5。比較供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液的味道，評(píng)估小組成員對(duì)供試品溶液給出0～12 分的味覺(jué)得分，0 分代表沒(méi)有味道，12 分代表具有強(qiáng)烈味道。為了避免疲勞和遺留影響，在2 個(gè)不同樣本的測(cè)試中，評(píng)估小組成員被要求用50～60 mL的飲用水漱口2 次，并休息2 min。結(jié)果為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3.5 GFC分離

取樣品粉末溶于去離子水中，配制成20 mg/mL的樣品溶液。上樣于Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜柱中，以去離子水為洗脫液，流速為0.75 mL/min。肽鍵在波長(zhǎng)214 nm處有最大的吸收峰，回收波長(zhǎng)214 nm處的餾出液。各餾分分別標(biāo)記為F1、F2、F3和F4，冷凍干燥，-40 ℃條件下貯存，備用。

1.3.6 RP-HPLC純化

選取GFC分離獲得的鮮味最強(qiáng)的組分，溶解于去離子水。進(jìn)樣于Shim-Pack VP-ODS C18色譜柱（10 mm×250 mm）進(jìn)一步純化，收集各組分，冷凍干燥，于-40 ℃貯存，備用。

RP-HPLC純化條件：HPLC系統(tǒng)；檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm；流動(dòng)相A：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流動(dòng)相B：0.1%三氟乙酸-水溶液；等比例洗脫；流速2 mL/min，進(jìn)樣體積100 μL，樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL。

1.3.7 nano UPLC-MS/MS分析多肽的氨基酸序列和測(cè)定分子質(zhì)量

樣品制備：RP-HPLC純化出的鮮味較佳的組分，溶解于去離子水，加入二硫蘇糖醇，配制成終濃度為10 mmol/L的溶液，置于56 ℃水浴中還原1 h。加入吲哚-3-乙酸使其終濃度為50 mmol/L，避光反應(yīng)40 min，萃取物進(jìn)行凍干。在nano UPLC-MS/MS分析前，用20 μL 0.1%甲酸溶液對(duì)凍干粉末進(jìn)行重懸。

UPLC條件：Ultimate 3000系統(tǒng)；色譜柱：填料為C18-AQ樹(shù)脂（1.9 μm，100 ?）的反相納米柱（150 μm×15 cm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸-水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；線性洗脫梯度：0～5 min，6%～9% A，94%～91% B；5～20 min，9%～14% A，91%～86% B；20～50 min，14%～30% A，86%～70% B；50～58 min，30%～40% A，70%～60% B；58～60 min，40%～95% A，60%～5% B；流速600 nL/min；進(jìn)樣體積5 μL。

MS條件：使用Q型混合型四極桿軌道阱質(zhì)譜儀進(jìn)行肽段分析，噴霧電壓為2.2 kV，用于離子輸運(yùn)的毛細(xì)管溫度為270 ℃。質(zhì)譜第一階段全掃描范圍設(shè)置為m/z300.0～1 600.0，分辨率60 000，分離寬度3.00 Da。串聯(lián)質(zhì)譜分析中采用一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜的掃描模式。依次選擇一級(jí)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最高的10 個(gè)離子進(jìn)行二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)解離，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣一次。

1.3.8 GFC和RP-HPLC分離純化獲得的亞組分的感官評(píng)價(jià)

采用1.3.4節(jié)方法，對(duì)GFC和RP-HPLC分離純化獲得的亞組分進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，選取具有最強(qiáng)鮮味的組分進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 合成肽的感官描述和鮮味閾值的評(píng)估

nano UPLC-MS/MS檢測(cè)出的多肽序列委托無(wú)錫亞肽生物科技有限公司進(jìn)行合成，合成肽的純度在98%以上。將合成肽溶解于去離子水中，配成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，按1.3.4節(jié)方法進(jìn)行感官描述。

滋味稀釋分析實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)食品中的風(fēng)味成分并確定其閾值。本實(shí)驗(yàn)采用滋味稀釋實(shí)驗(yàn)，分析待測(cè)溶液中風(fēng)味成分的閾值。實(shí)驗(yàn)前，以味精為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)團(tuán)隊(duì)成員進(jìn)行訓(xùn)練，培訓(xùn)評(píng)價(jià)小組成員對(duì)味精味道的熟悉，以確保樣本評(píng)估的準(zhǔn)確性。用去離子水對(duì)合成多肽的凍干粉末進(jìn)行溶解，并按1∶1的體積比逐漸稀釋。這一系列稀釋液按濃度上升的順序分配給感官評(píng)估小組成員，每個(gè)稀釋液取2 mL，品嘗5 s。在對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行評(píng)估后，用去離子水清潔口腔數(shù)秒后，再品嘗下一個(gè)樣品，以避免疲勞和遺留影響。將供試溶液與2 個(gè)空白對(duì)照品（蒸餾水）進(jìn)行比較。如果在某一濃度上，研究小組的成員能夠識(shí)別出味覺(jué)上的差異，那么稱此時(shí)的樣品濃度為可識(shí)別的閾值。對(duì)小組成員的評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行記錄，評(píng)價(jià)過(guò)程中不允許討論和交流。結(jié)果為3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS 21軟件進(jìn)行單因素方差分析。采用S-N-K檢驗(yàn)，比較各處理間的平均值，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭茂牛肝菌不同部位鮮味氨基酸差異

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程如表1所示，由回歸方程計(jì)算出樣品中氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖1，谷氨酸含量顯著高于另外4 種氨基酸（P＜0.05），在菌蓋中有著更高的含量。由于谷氨酸能夠作用于鮮味受體啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程，產(chǎn)生鮮味味覺(jué)，因此蘭茂牛肝菌菌蓋是一個(gè)很好的鮮味物質(zhì)來(lái)源。

表1 氨基酸線性回歸方程和精密度Table 1 Linear regression equations and precision for umami amino acids

圖1 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中鮮味氨基酸含量變化Fig.1 Comparison of umami amino acid contents in stipe and pileus of L.asiatica

2.2 蘭茂牛肝菌不同部位核苷酸差異

對(duì)蘭茂牛肝菌中5 種5’-核苷酸進(jìn)行分析，核苷酸線性回歸方程如表2所示。由回歸方程計(jì)算得出樣品中核苷酸含量，結(jié)果如圖2所示。樣品中5’-核苷酸含量范圍在（0.11±0.02）（菌柄5’-AMP）～（6.69±0.01）g/kg（菌蓋5’-IMP）之間，菌蓋中5’-核苷酸的含量顯著高于菌柄（P＜0.05）。有研究[34]表明，5’-核苷酸的含量可分為低（＜1 mg/g）、中等（1～5 mg/g）和高（＞5 mg/g）3 個(gè)范圍，其中菌蓋中的5’-CMP（（1.24±0.02）g/kg）和5’-IMP的含量屬于中等水平范圍，其余5’-核苷酸的含量則屬于低水平范圍。蘑菇中的5 種5’-核苷酸，均有報(bào)道顯示具有鮮味，其中5’-GMP、5’-IMP是主要的鮮味活性物質(zhì)，尤其是20世紀(jì)首次從香菇中分離出的5’-GMP更是一種比味精更強(qiáng)的增味劑。菌蓋中含有中等水平的5’-IMP，能夠增強(qiáng)菌蓋整體鮮味。

表2 核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程Table 2 Linear regression equations for nucleotide standard

圖2 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋中5’-核苷酸含量變化Fig.2 Comparison of 5’-nucleotide contents in stipe and pileus of L.asiatica

2.3 蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋的感官分析

由圖3可知，菌柄與菌蓋在5 種味覺(jué)上有顯著差異（P＜0.05），菌蓋的鮮味得分（10.0±0.06）顯著高于菌柄（6.0±0.04），有較高的甜味得分（6.1±0.03），苦味得分最低（2.1±0.02）。菌蓋中鮮味氨基酸及核苷酸的含量較高，可以認(rèn)為菌蓋是一種很好的鮮味物質(zhì)來(lái)源。

圖3 蘭茂牛肝菌中菌柄及菌蓋的感官評(píng)價(jià)Fig.3 Sensory evaluation of stipe and pileus of L.asiatica

2.4 菌蓋水提物的凝膠過(guò)濾色譜純化及其純化組分感官分析

采用Sephadex G-15作為填充物的凝膠過(guò)濾色譜柱對(duì)具有更高鮮味強(qiáng)度菌蓋水提物進(jìn)行分離純化，在波長(zhǎng)214 nm處檢測(cè)餾出物，結(jié)果如圖4所示，共收集到4 個(gè)組分，分別命名為F1、F2、F3和F4。對(duì)F1、F2、F3和F4進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖5，F(xiàn)1組分的鮮味強(qiáng)度為9.01±1.06，與F2（3.20±0.28）、F3（6.61±0.56）和F4（2.00±1.02）有顯著差異（P＜0.05），而酸味和苦味的強(qiáng)度較弱。且通過(guò)與圖3比較發(fā)現(xiàn)，低分子質(zhì)量組分F1與菌蓋水提物的味覺(jué)特性具有很好的相關(guān)性，并且表現(xiàn)出了很強(qiáng)烈的鮮味，是關(guān)鍵的味覺(jué)物質(zhì)。這些結(jié)果與先前的研究高度一致，即低分子質(zhì)量的組分構(gòu)成了食品中的主要味覺(jué)活性化合物[35]，并且具有更強(qiáng)的鮮味。因此，收集組分F1，進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化實(shí)驗(yàn)。

圖4 蘭茂牛肝菌粗提物的凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.4 Gel filtration chromatogram of the crude extract of L.asiatica

圖5 蘭茂牛肝菌粗提物凝膠過(guò)濾色譜組分的感官評(píng)價(jià)Fig.5 Sensory evaluation of GPC components of the crude extract of L.asiatica

2.5 RP-HPLC純化組分的感官評(píng)價(jià)

采用RP-HPLC對(duì)F1組分進(jìn)行分離純化，在波長(zhǎng)214 nm處得到2 個(gè)組分，分別標(biāo)注為F1a和F1b，它們的保留時(shí)間分別為7.059 min和12.100 min，色譜圖如圖6所示。樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖7所示，在5 種基本味覺(jué)中，樣品的鮮味強(qiáng)度顯著高于其他味覺(jué)強(qiáng)度（P＜0.05），在鮮味味覺(jué)中，F(xiàn)1a（11.01±0.36）與F1b（6.08±0.52）具有顯著差異（P＜0.05），F(xiàn)1a組分鮮味和甜味較強(qiáng)，酸味、苦味和咸味較弱，并且，F(xiàn)1a在波長(zhǎng)214 nm的洗脫圖譜中呈單一峰，用于進(jìn)一步的氨基酸序列分析和分子質(zhì)量的測(cè)定。

圖6 RP-HPLC純化鮮味肽的色譜圖Fig.6 Chromatogram of umami peptides purified by using RP-HPLC

圖7 RP-HPLC純化鮮味肽的感官評(píng)價(jià)Fig.7 Sensory evaluation of umami peptides purified by using RP-HPLC

2.6 F1a組分的氨基酸序列和分子質(zhì)量

采用nano UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)F1a組分中的鮮味肽進(jìn)行氨基酸序列和分子質(zhì)量的分析，質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)使用Maxquant（1.6.2.10）檢索目標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，從數(shù)據(jù)庫(kù)中剔除不匹配肽段，共鑒定出3 條多肽，分別為FKDLGEENFK、KMDDFAAFVEK和LVNEVTEFAK，其分子質(zhì)量分別為1 225.598、1 357.622 Da和1 148.608 Da，這些肽的具體信息如圖8所示。

圖8 F1a的nano UPLC-MS/MS質(zhì)譜圖Fig.8 Nano UPLC-MS/MS spectra of F1a

2.7 合成肽的感官評(píng)價(jià)

為了鑒定這3 條肽的口感特征，委托江蘇無(wú)錫亞肽生物科技有限公司合成這3 條肽，純度為98%以上，合成肽的信息如表3所示。將合成肽溶解在去離子水中進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和閾值分析，所有肽均呈現(xiàn)出鮮味，F(xiàn)KDLGEENFK、KMDDFAAFVEK和LVNEVTEFAK的閾值分別為9.78、10.25 mmol/L和13.01 mmol/L（表4）。

表3 合成肽信息Table 3 Information about synthetic peptides

表4 合成肽的感官評(píng)價(jià)Table 4 Sensory evaluation of synthetic peptides

多肽的味覺(jué)特性與氨基酸組成有關(guān)。采用Li Xuepeng等[36]的氨基酸分類方法，并根據(jù)氨基酸的理化性質(zhì)和口感特征略作修改，將氨基酸分為六大類：鮮味氨基酸、酸性氨基酸、甜味氨基酸、疏水氨基酸、親水性氨基酸和堿性氨基酸，如圖9所示。3 條合成多肽都含有豐富的鮮味氨基酸，含量占比分別為30%、45%和30%，這一類氨基酸是人類鮮味味覺(jué)受體T1R1/T1R3的陽(yáng)性激活劑，有研究表明這類氨基酸是鮮味多肽的一個(gè)標(biāo)志[37]，在感官評(píng)價(jià)中，3 條多肽也表現(xiàn)出了明顯的鮮味與報(bào)道相同；并且，圖1顯示，菌蓋中游離氨基酸也含有豐富的鮮味氨基酸，為其鮮味提供了重要貢獻(xiàn)。第2組酸性氨基酸，分別為L(zhǎng)-Glu和L-Asp。兩者都是重要的鮮味刺激物，通常包含在鮮味肽的氨基酸序列中[21]；第3組氨基酸分別為丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸和蘇氨酸被認(rèn)為是甜味氨基酸，在3 條多肽中含量分別為10%、18%和20%，甜味氨基酸利于鮮味肽的鮮味呈現(xiàn)；第4組氨基酸是疏水氨基酸，已經(jīng)觀察到大多數(shù)含有疏水氨基酸的多肽和疏水氨基酸的游離形式都會(huì)釋放出苦味，但是在感官評(píng)價(jià)中僅KMDDFAAFVEK品嘗到較明顯的苦味，另外2 條多肽并未品嘗到苦味，推測(cè)可能是由于多肽中含有的大量親水氨基酸，在形成高級(jí)空間結(jié)構(gòu)時(shí)，疏水氨基酸并未裸露出來(lái)，以及有較高甜味氨基酸影響了苦味的呈現(xiàn)；最后一組氨基酸是堿性氨基酸，堿性氨基酸、親水氨基酸和疏水氨基酸通常也是構(gòu)成鮮味肽必需的。有報(bào)道指出，多肽的C末端氨基酸殘基的差異對(duì)味覺(jué)效果有影響[38]。氨基酸殘基類型的不同可能影響肽的口感強(qiáng)度。Chaudhari等[20]研究表明，堿性C末端氨基酸殘基對(duì)肽和受體之間相互作用的活性部位有非常重要的影響。本研究鑒定的3 條多肽C末端氨基酸殘基均為K，這可能增強(qiáng)了合成肽的呈鮮強(qiáng)度。因此，酸性氨基酸、鮮味相關(guān)氨基酸和堿性C末端氨基酸，都對(duì)多肽的鮮味有貢獻(xiàn)。合成肽的味覺(jué)特征如表4所示，F(xiàn)KDLGEENFK、KMDDFAAFVEK和LVNEVTEFAK在水溶液中有較強(qiáng)的鮮味，F(xiàn)KDLGEENFK和LVNEVTEFAK有明顯的甜味，KMDDFAAFVEK有著輕微的苦味，另外3 條多肽都有輕微澀味，可能與合成過(guò)程中試劑的殘留有關(guān)。

圖9 3 條合成多肽的氨基酸組成圖Fig.9 Amino acid composition of three synthetic peptides

3 結(jié) 論

牛肝菌是一種很好的鮮味物質(zhì)來(lái)源，但是牛肝菌中鮮味物質(zhì)的研究甚少。本研究在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，選取蘭茂牛肝菌菌柄及菌蓋2 種不同的底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明菌蓋中鮮味物質(zhì)更為豐富。并以菌蓋為材料進(jìn)行牛肝菌中特色鮮味肽的提取分離，經(jīng)由nano UPLCMS/MS鑒定3 條新的鮮味肽，分別為FKDLGEENFK（1 225.598 Da）、KMDDFAAFVEK（1 357.622 Da）和LVNEVTEFAK（1 148.608 Da）。通過(guò)感官實(shí)驗(yàn)對(duì)其風(fēng)味特征進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)合評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)合成肽的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示酸性氨基酸、鮮味相關(guān)氨基酸和堿性C末端氨基酸，都對(duì)多肽的鮮味有顯著影響。該研究結(jié)果為牛肝菌在食品加工中的進(jìn)一步應(yīng)用提供了良好的理論基礎(chǔ)。