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    富硒和非富硒雪櫻子中健康有益成分的對比分析

    2021-12-03 09:25:34韓文娜李喜貴靳登鵬繆回春李中意朱思俞柳春紅
    食品科學(xué) 2021年22期
    關(guān)鍵詞:黃酮

    韓文娜,李喜貴,劉 煥,李 咪,靳登鵬,繆回春,李中意,朱思俞,柳春紅,*

    (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室,廣東 廣州 510642;2.廣東中普微量元素科技有限公司,廣東 廣州 510070;3.一輩子(廣東)健康產(chǎn)業(yè)有限公司,廣東 廣州 510070;4.廣州市中科微量元素科學(xué)研究院,廣東 廣州 510070)

    雪櫻子屬1 a生莧科植物,學(xué)名尾穗莧(Amaranthus caudatusL.),別名仙人谷、老槍谷,源于溫帶、亞熱帶及熱帶地區(qū)[1]。雪櫻子在我國各地均有分布。作為藥食兩用的雪櫻子具有極其重要的營養(yǎng)價值[2],其葉子中富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維等基本營養(yǎng)成分,可以作為蔬菜食用[3],花籽粒中富含傳統(tǒng)谷物中缺乏的賴氨酸,可以當(dāng)作谷類食物食用[4]。除此之外,雪櫻子還含有多種生物活性化學(xué)成分,如多酚類、三萜皂苷類、生物活性肽、植物甾醇類[5-7]等。這些活性成分賦予雪櫻子特殊的功能特性,使其具有清除自由基、抵抗活性氧,發(fā)揮抗氧化的作用;也有刺激免疫系統(tǒng),發(fā)揮抗腫瘤的作用;還有降低血糖血脂水平,改善高血壓、糖尿病等作用[8-10]。

    硒作為生物體必需的微量元素,是谷胱甘肽過氧化物酶的重要組成部分,可以保護機體抵御疾病、延緩衰老,在人體抗氧化機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。硒缺乏會導(dǎo)致克山病、心臟病以及人體免疫機能的紊亂[12],只靠天然食品補硒很難從根本上改善貧硒地區(qū)的硒缺乏狀況,而富硒產(chǎn)品的開發(fā)可作為補充硒元素的一個較好來源[13],而且富含硒的食物也可以作為功能食品[14]。因此,在植物中補充硒元素不僅能夠?qū)崿F(xiàn)無機硒向有機硒的轉(zhuǎn)化[15],增加硒含量,而且有研究表明硒元素還可以促進總多酚、總黃酮、礦物質(zhì)等含量的積累[16-19],可以從根本上提高其健康有益成分[20]。近年來,富硒植物的開發(fā)研究已在世界各地范圍內(nèi)廣泛開展,鮮見文獻報道富硒雪櫻子體內(nèi)的生物活性成分及其功能作用。因此本研究通過對比富硒及非富硒雪櫻子的活性成分如多酚、黃酮、礦物質(zhì)的含量,以期為富硒雪櫻子及其制品的開發(fā)提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    雪櫻子種植于廣州江門地區(qū),富硒雪櫻子通過噴施由一輩子(廣東)健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供的“微營譜”牌植物硒營養(yǎng)液進行富硒處理,非富硒雪櫻子則不做任何處理。成熟后整株采摘,避光低溫保存。將雪櫻子的根、莖、葉、花4 個部位分別處理干凈后,置于真空冷凍機中凍干處理,使用粉碎機研磨至粉末狀,過60 目篩。粉末狀樣品裝入密封袋放入-20 ℃冰箱保存,備用。

    沒食子酸(純度98%)、蘆?。兌?8%) 北京索萊寶科技有限公司;福林-酚試劑 美國Sigma公司;甲醇、乙腈、甲酸(均為色譜純) 梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司;氫氧化鈉、鹽酸(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁(均為分析純) 天津科密歐試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Scientz-100F真空冷凍機 寧波新芝生物科技股份有限公司;300VDE超聲波清洗機 江蘇昆山超聲儀器有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;Nexera X2超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)儀 日本島津有限公司;Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司;1260/7700X電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)儀 安捷倫科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 UPLC-MS/MS定性定量分析

    樣本預(yù)處理:稱取100 mg雪櫻子粉末,溶解于1.2 mL 70%甲醇提取液中;將溶解后的樣品置于4 ℃冰箱過夜,期間渦旋6 次,提高提取率;12 000 r/min離心10 min后,吸取上清液,用微孔濾膜(0.22 μm)過濾樣品,并保存于進樣瓶中,用于UPLC-MS/MS分析。

    UPLC條件:色譜柱:SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:A相為超純水(加入0.1%甲酸),B相為乙腈(加入0.1%甲酸);洗脫梯度:0.00 min,95% A,5% B;0.00~9.00 min,95%~5% A,5%~95% B;5% A,95% B,保持1 min;10.00~11.10 min,5%~95% A,95%~5% B;并以5% B平衡至14 min;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量4 μL。

    質(zhì)譜條件:電噴霧離子源溫度550 ℃,質(zhì)譜電壓5 500 V(正模式)/-4 500 V(負(fù)模式),氣簾氣壓力25 psi,碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在三重四極桿中,每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進行掃描檢測。

    1.3.2 多酚含量測定

    樣品提?。簻?zhǔn)確稱取100 g雪櫻子粉末,用70%乙醇溶液以1∶25(g/mL)的物料比超聲浸提,浸提時間90 min,濾渣重復(fù)超聲提取2 次,合并提取液進行真空抽濾,而后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇,將獲得的濃縮液定容至100 mL,待測備用[21]。

    采用福林-酚法測定雪櫻子粗提液中多酚含量[22]。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用70%乙醇溶液定容10 mL,得到1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液。將母液依次稀釋成0、50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取125 μL的標(biāo)準(zhǔn)液加入125 μL的福林-酚試劑,混合后避光靜置6 min,加入7% Na2CO3溶液(1.25 mL),用水調(diào)至3 mL,避光放置90 min,于波長760 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    樣品測定:將雪櫻子粗提液樣品稀釋100 倍后,取125 μL樣品液按上述步驟測定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算雪櫻子粗提液中多酚含量。

    1.3.3 黃酮含量測定

    樣品提?。和?.3.2節(jié)。

    采用NaNO2-Al(NO3)3法測定雪櫻子粗提液中黃酮含量[23]。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品12 mg,用70%乙醇溶液定容至100 mL,得到0.12 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)母液。將母液依次稀釋成0、24、48、72、96、120 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取5 mL的標(biāo)準(zhǔn)液加入5% NaNO2溶液0.3 mL,混合后靜置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,混合后靜置6 min,在加入4% NaOH溶液4 mL,最后加70%乙醇溶液0.4 mL,搖勻后放置15 min,于波長510 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    樣品測定:將雪櫻子粗提液樣品稀釋100 倍后,取5 mL樣品液按上述步驟測定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算雪櫻子粗提液中黃酮含量。

    1.3.4 礦物質(zhì)含量的測定

    鈣、鐵、鋅、硒、銅、鉬、鈷、鉻等微量元素參考GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》ICP-MS法測定。

    樣本預(yù)處理:準(zhǔn)確稱取300 mg樣品粉末于消解罐中,加入6 mL硝酸,2 mL過氧化氫搖勻,加蓋放置過夜,按照微波消解儀標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進行消解,待消解完成,緩慢打開罐蓋排氣,用少量水沖洗內(nèi)蓋,將消解罐放在控溫電熱板上加熱30 min,用水定容至25 mL,混勻備用,同時做空白實驗。

    ICP-MS儀器工作條件:射頻功率1 548.6 W;等離子體氣流速13.9 L/min;載氣流速1.1 L/min;輔助氣流速0.8 L/min;霧化室溫度2 ℃;采樣深度5 mm;泵速40.0 r/min;掃描方式為跳峰;重復(fù)次數(shù)3 次。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用Excel 2010軟件進行原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和相關(guān)分析,GraphPad Prism 8.0.1軟件進行繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 UPLC-MS/MS定性定量結(jié)果

    色譜與質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)了從利用色譜進行物質(zhì)分離到利用質(zhì)譜進行物質(zhì)鑒定的整個流程,其中UPLC-MS/MS能夠準(zhǔn)確定性定量[24]。本研究選取富硒雪櫻子樣品,基于廣泛靶向代謝組技術(shù)的代謝分析,共檢測到725 個代謝物。圖1中多反應(yīng)監(jiān)測(multiple response monitoring,MRM)模式代謝物檢測多峰圖展示了樣本中能夠檢測到的物質(zhì),每個不同顏色的質(zhì)譜峰代表檢測到的一個代謝物。

    圖1 MRM代謝物檢測多峰圖(A)和混合樣品質(zhì)譜分析總離子流圖(B)Fig.1 MRM chromatogram of metabolites in Se-enriched ACL (A) and total ion current chromatogram of mixed standards (B)

    將檢測到的725 種代謝物歸類總結(jié)為12大類物質(zhì)(表1)。從雪櫻子中鑒定出酚酸類140 種、脂質(zhì)137 種、有機酸91 種、氨基酸及其衍生物85 種、黃酮類84 種、核苷酸及其衍生物50 種、生物堿35 種、木脂素及香豆素20 種、萜類14 種、糅質(zhì)4 種、醌類4 種、其他類61 種等生物活性成分,雪櫻子作為藥食兩用具有多種生理功能[25]。

    表1 UPLC-MS/MS鑒定出的主要代謝物Table 1 Major metabolites identified by UPLC-MS/MS

    續(xù)表1

    續(xù)表1

    2.2 活性成分含量對比分析

    如表2所示,富硒后雪櫻子根、莖、葉、花部位的多酚含量顯著升高,其中根、葉、花部位多酚含量差異極顯著(P<0.01),莖部差異顯著(P<0.05),并且雪櫻子在富硒后葉片中的含量最高,達到了(13 272.1±106.6) mg/kg。表明富硒處理明顯提升了雪櫻子各部位中多酚的表達。同時經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn),富硒雪櫻子根、莖部位的黃酮含量變化不顯著(P>0.05),葉、花部位的黃酮含量變化極顯著(P<0.01)。其中富硒后雪櫻子葉片中的黃酮含量最高,為(3 551.7±42.6)mg/kg,表明富硒處理明顯促進了雪櫻子葉片中黃酮的表達。

    表2 雪櫻子多酚、黃酮含量檢測結(jié)果Table 2 Contents of polyphenols and flavones in Se-enriched and non-Se-enriched ACL

    2.3 礦物質(zhì)含量對比分析

    通過ICP-MS測定鈣含量,從圖2A可以看出,雪櫻子富硒后可促進鈣元素的吸收,其中葉片含量最高,達到34 481 mg/kg,鈣含量增長39.5%;根部鈣含量次之,為10 125 mg/kg,相比于非富硒雪櫻子,差異變化較大。富硒后花中鈣含量為9 663 mg/kg,莖部含量最少為5 138 mg/kg,相比于非富硒雪櫻子,差異變化較小,表明富硒處理對雪櫻子的根、葉部位影響較大,對花和莖部位影響較小。

    圖2 雪櫻子礦物含量檢測結(jié)果Fig.2 Mineral contents in Se-enriched and non-Se-enriched ACL

    由圖2B可知,雪櫻子根、莖、花部位的鐵元素在富硒后,含量表達均減少,而只有葉片中的鐵含量由非富硒的137 mg/kg上升到富硒的160 mg/kg,鐵含量增長16.8%表明富硒促進了雪櫻子鐵含量從其他部位向葉片的遷移。由圖2C、D可以看出,鋅元素在富硒雪櫻子的根、莖、葉、花四部位中的表達普遍下降,葉片中鋅含量降低76.4%,表明富硒降低了雪櫻子中的鋅含量。銅元素在富硒雪櫻子的根、莖、葉、花四部位中的表達普遍上升,并且葉片中的銅含量由非富硒的2.39 mg/kg上升到富硒的9.5 mg/kg,銅含量增長297.5%,表明富硒促進了雪櫻子葉片中銅元素的表達。

    從圖2E、F發(fā)現(xiàn),硒元素在富硒雪櫻子中的含量表達均提高,并且葉片中的硒含量由非富硒的0.34 mg/kg上升到富硒的3.91 mg/kg,硒含量增長1 050.0%。鉬元素在富硒雪櫻子的葉、花部位中的表達上升,并且葉片中鉬含量由非富硒的0.28 mg/kg上升到富硒的0.59 mg/kg,鉬含量增長110.7%,表明富硒促進了雪櫻子葉片中鉬元素的表達。由圖2G、H可知,鈷元素在富硒雪櫻子根和葉中的含量表達上升,并且葉片中的鈷含量由非富硒的0.03 mg/kg上升到富硒的0.12 mg/kg,鈷含量增長300.0%,表明富硒促進了雪櫻子葉片中鈷元素的表達。雪櫻子根部鉻含量由非富硒的4.78 mg/kg下降為富硒的0.21 mg/kg,葉片中的鉻含量由非富硒的0.39 mg/kg上升到富硒的1.2 mg/kg,鉻含量增長207.7%,含量差異變化較大。但同時也發(fā)現(xiàn)鉬、鈷、鉻等微量元素在富硒雪櫻子的其他部位中的含量變化較小,還有一些微量元素低于檢出限。但總體結(jié)果表明富硒雪櫻子的微量元素含量在根部表達減少,在葉片中表達升高。

    2.4 富硒雪櫻子與有益成分含量的相關(guān)性分析

    如表3所示,多酚與黃酮、礦物質(zhì)含量表現(xiàn)為正相關(guān),且與黃酮、鉬顯著相關(guān)(P<0.01);黃酮與礦物質(zhì)含量正相關(guān),且黃酮與鉬顯著相關(guān)(P<0.05);鈣與礦物質(zhì)正相關(guān),且與銅顯著相關(guān)(P<0.01),與硒、鉻顯著相關(guān)(P<0.05);鐵、鋅與礦物質(zhì)含量正相關(guān),但鋅與鈷含量呈負(fù)相關(guān);銅與硒顯著相關(guān)(P<0.05);硒與鉬顯著相關(guān)(P<0.05);鉬與鈷正相關(guān)。

    表3 富硒雪櫻子與有益成分含量間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of health-benefiting components in Se-enriched ACL

    3 討 論

    通過UPLC-MS/MS驗證發(fā)現(xiàn),富硒雪櫻子中不僅富含多酚類、三萜皂苷類、植物甾醇類、生物活性肽等多種生物活性成分,還含有豐富的鈣元素及人體必需微量元素[26]。作為一種新型選擇的功能性食品蔬菜,富硒雪櫻子作用于人體的良好健康效果可能與其富含的植物化學(xué)物有關(guān)[27],其中具有代表性的為多酚及黃酮類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),富硒后雪櫻子葉片中的多酚含量為(13 272.1±106.6) mg/kg,同時黃酮含量高達(3 551.7±42.6)mg/kg。Ademoyegun等[28]報道了雪櫻子的總多酚含量為10 670 mg/kg,與本結(jié)果較為一致。其間存在的差異可能與不同的測定方法、植物基因型、土壤類型、土壤礦物組成有關(guān)[29]。本實驗結(jié)果表明雪櫻子富硒后可實現(xiàn)無機硒向有機硒的轉(zhuǎn)變,進而提升活性成分的高效表達。其原因可能是由于富硒處理提高了有益微量元素硒含量,而硒元素主要以硒代半胱氨酸的形式存在于蛋白質(zhì)內(nèi),通過各種硒蛋白在植物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用,以進一步激活多酚、黃酮類化合物的代謝積累[30-32]。

    研究發(fā)現(xiàn)雪櫻子成熟后可達1.5 m高左右,這種顯著區(qū)別于其他莧科植物的生長特性,是進一步挖掘雪櫻子礦物質(zhì)含量的必要條件。通過測定發(fā)現(xiàn),雪櫻子花富硒后鈣含量為9 663 mg/kg,對比國外研究,Gamel等[33]發(fā)現(xiàn)雪櫻子花籽粒中的鈣含量為2 850 mg/kg。Amare等[34]通過分析植物中的化學(xué)成分,發(fā)現(xiàn)雪櫻子的鈣含量高達7 768 mg/kg,本實驗研究結(jié)果與之類似。然而,植物富硒并不一定表明對其體內(nèi)的礦物質(zhì)含量都有促進作用,相反,雪櫻子富硒后鐵(除葉片)、鋅元素含量呈下降趨勢。研究表明,高水平的鈣補充劑可能會導(dǎo)致或加重豆制品中鋅的利用不良,表明某個高水平的礦物質(zhì)攝入會對其他礦物質(zhì)產(chǎn)生相互作用[35]。其原因可能是植物中鈣含量較高時,易與植酸、草酸等結(jié)合,從而影響鐵、鋅的吸收,而且當(dāng)鈣鋅比例超過50∶1時,鈣會嚴(yán)重影響鋅的吸收[36],表明硒元素與其他元素之間可能存在著復(fù)雜的相互作用,包括協(xié)同作用、拮抗作用和調(diào)節(jié)作用[37]。還有研究表明蛋黃中銅含量隨硒的添加而增加[38],這與本研究的微量元素含量變化相類似,即雪櫻子在富硒后銅含量均得到提升,表明硒和銅元素具有協(xié)同作用,同時補充二者微量元素可以提高機體的抗氧化酶活性,以提高其抗氧化能力[39]。不僅如此,在富硒雪櫻子的葉片中也發(fā)現(xiàn)了鐵、硒、鉬、鈷、鉻等微量元素的上升趨勢,表明富硒處理可促進某些微量元素從其他部位向葉片的遷移。即雪櫻子的葉片可能是微量元素的“聚集地”,并且這一作用通過富硒方式更加顯著。

    富硒后,雪櫻子的根、莖、葉、花部位的多酚與黃酮、礦物質(zhì)含量正相關(guān),黃酮與礦物質(zhì)含量正相關(guān),除鋅與鈷呈負(fù)相關(guān)外,礦物質(zhì)含量間均呈正相關(guān),這表明通過對具有相關(guān)性次生代謝物中一個指標(biāo)的檢測,可以初步評估另外一個指標(biāo)含量的高低[40],即雪櫻子富硒與黃酮、多酚及礦物質(zhì)含量存在一定的量效關(guān)系。

    4 結(jié) 論

    富硒比非富硒雪櫻子含有更多的健康有益成分,尤其是富硒雪櫻子的葉片,不僅具有高水平的多酚及黃酮類化合物,還含有高豐度的鈣元素及微量元素。但基于國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),富硒雪櫻子作為一種藥食兩用的物質(zhì)一直未被開發(fā)利用,尤其是高鈣含量更是沒有被開發(fā)挖掘。因此,根據(jù)本實驗富硒雪櫻子的研究結(jié)果,在日常飲食中引入添加富硒雪櫻子的食品或藥材,對改善人體健康、預(yù)防和治療疾病可能會起到良好的促進作用。

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