基于MMR缺陷的高頻突變食源性沙門氏菌環(huán)丙沙星耐藥機(jī)制

王 銀，楊保偉，盛煥精，李怡瀾，施春雷，史賢明，肖英平，楊 華

（1.西北大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710069；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，中美食品安全聯(lián)合研究中心，上海 200240；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江省植物有害生物防治省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021）

沙門氏菌（Salmonella）是一類典型的人畜共患病的食源性致病菌，約有94%的沙門氏菌感染通過食品傳播[1-2]。畜牧養(yǎng)殖及臨床治療中抗生素的濫用會(huì)加速多重耐藥沙門氏菌的出現(xiàn)，這些多重耐藥沙門氏菌同時(shí)也會(huì)通過食物鏈及動(dòng)物性產(chǎn)品的消費(fèi)進(jìn)一步在人群中傳播。有研究推測，若按現(xiàn)今發(fā)展趨勢，預(yù)計(jì)到2050年全球范圍內(nèi)因多重耐藥細(xì)菌感染會(huì)引起1 000萬 人死亡，經(jīng)濟(jì)損失將高達(dá)100萬億 美元[1]。因此，多重耐藥沙門氏菌的廣泛傳播將給全球范圍內(nèi)公眾健康及食品安全帶來嚴(yán)重危害[3]。

細(xì)菌中抗生素作用位點(diǎn)的編碼基因突變以及抗性基因水平轉(zhuǎn)移是引起多重耐藥的最主要原因[4]。在自然狀態(tài)下，細(xì)菌的自發(fā)突變頻率約在1×10-9～1×10-8之間，凡是突變頻率超過自然狀態(tài)下自發(fā)突變頻率1 000 倍的菌株就被認(rèn)為是高頻突變子[5-6]。相較于野生型菌株，高頻突變子明顯具有更高的突變頻率、基因水平轉(zhuǎn)移能力與多重耐藥及高水平耐藥能力[4,6]。研究表明，引起細(xì)菌發(fā)生高頻突變的原因有很多，例如環(huán)境壓力、抗生素脅迫、SOS應(yīng)答系統(tǒng)等，但細(xì)菌高頻突變子的形成主要與其甲基導(dǎo)向錯(cuò)配修復(fù)（methyl-directed mismatch repair，MMR）系統(tǒng)中的任一主要功能基因（mutS、mutH、mutL和uvrD）突變有關(guān)[7-9]。MMR系統(tǒng)是一種常見的DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)，其主要功能是通過識(shí)別錯(cuò)配DNA，并對(duì)在DNA合成過程中錯(cuò)配的位點(diǎn)進(jìn)行剪切與替換，修復(fù)兩個(gè)堿基以上的缺失或插入，保障細(xì)菌在DNA合成過程中的忠實(shí)性[10]。MutS、MutL、MutH和UvrD是MMR系統(tǒng)中最主要的4 種功能蛋白，任一蛋白突變則會(huì)增加細(xì)菌突變及重組頻率。針對(duì)MMR突變/缺失與細(xì)菌高突變頻率與耐藥能力間關(guān)系的報(bào)道表明，MMR缺陷型高頻突變子細(xì)菌完整性和穩(wěn)定性被破壞，其突變頻率及同源基因間片段相互交換、轉(zhuǎn)移的幾率大幅升高，易出現(xiàn)新的耐藥表型及強(qiáng)耐藥能力[11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌（Escherichia coli）、結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）以及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）中高頻突變子的突變頻率均與MMR系統(tǒng)功能的缺失呈正相關(guān)[12-16]。除此之外，MMR缺陷也會(huì)對(duì)細(xì)菌耐藥相關(guān)基因（例如抗生素結(jié)合靶點(diǎn)、外排泵系統(tǒng)和膜蛋白編碼基因）的表達(dá)產(chǎn)生影響[7,16-21]。

氟喹諾酮類抗生素廣泛應(yīng)用于沙門氏菌感染的臨床治療。細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素耐藥性主要與喹諾酮耐藥決定區(qū)（quinolone resistance determining region，QRDR）中氨基酸突變及acrAB-tolC、oqxAB外排泵基因表達(dá)水平有關(guān)[13,22-23]。MMR系統(tǒng)缺陷與細(xì)菌突變頻率、藥敏性以及基因突變能力密切相關(guān)，但其對(duì)沙門氏菌高頻突變子突變頻率及環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）敏感性的影響及作用機(jī)制仍尚未可知。

因此，本研究通過探究MMR缺陷的沙門氏菌高頻突變子突變頻率、CIP最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與耐藥基因表達(dá)差異間的關(guān)系，揭示MMR缺陷對(duì)食源性沙門氏菌高頻突變子CIP耐藥性的影響及調(diào)控機(jī)制，旨在為降低沙門氏菌高頻突變子的傳播，保障食品及公共衛(wèi)生安全提供新思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

90 株沙門氏菌高頻突變子，為前期研究中Wang Yin等[24]篩選自本實(shí)驗(yàn)室保存的2007—2010年在我國北京、上海、福建、河南、四川、廣東、廣西、陜西等地各類零售食品（雞肉、豬肉、羊肉、牛肉、魚、涼拌菜、速凍水餃）中分離出的1 264 株沙門氏菌[24]。E.coliATCC 25922及E.faecalisATCC 29212為本實(shí)驗(yàn)室保存?；パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)中攜帶野生型mutH、mutL、mutS及uvrD基因的供體質(zhì)粒NR9931、NR9932、NR9933及NR9934由美國馬里蘭大學(xué)（College Park, MD, USA）提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）瓊脂、LB肉湯、MHA（Mueller Hinton）瓊脂 美國BD公司。

1.1.3 抗生素

萘啶酮酸（nalidixic acid，NAL）、CIP、利福平（rifampicin，RIF）、氨芐西林（ampicillin，AMP）（均為分析純） 美國Sigma公司。

1.1.4 引物

MMR關(guān)鍵蛋白編碼基因（mutS、mutH、mutL、uvrD）、喹諾酮及氟喹諾酮耐藥相關(guān)基因（gyrA、gyrB、acrA、acrB、ompF、parC、parE、tolC、marA、marR、acrE、ompR、soxS、hilA、dnaQ）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及實(shí)時(shí)PCR（realtime PCR）擴(kuò)增引物均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成（表1）。

續(xù)表1

1.1.5 試劑

CCMB80 buffer、30%甘油、75%乙醇、rTaq（TaKaRa）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）、5×TBE緩沖液、TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix ExTaqTMII、LATaqTMDNA Polymerase、rTaqTMDNA Polymerase、DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒RNA Purification Bacteria Kit 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mycycler PCR儀、DNA電泳和凝膠成像系統(tǒng)、Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀、電擊杯、iQ5 real-time PCR儀 美國Bio-Rad公司；GF16RX高速低溫冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；核酸蛋白測定儀 杭州奧盛儀器有限公司；Milli-Q純水儀 法國Millpore公司；磁力加熱攪拌器美國Fisher公司；-80 ℃超低溫冰箱 日本Sanyo公司；百分之一天平、萬分之一天平 德國賽多利斯公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；移液器、高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；生物安全柜美國Labgard公司；超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 突變頻率測定

高頻突變子突變頻率測定依據(jù)Wang Yin等[24]方法進(jìn)行。具體如下：將待測菌株活化后挑取單菌落接種于5 mL滅菌LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、100 r/min過夜培養(yǎng)。取100 μL菌懸液按103～106進(jìn)行梯度稀釋，分別取100 μL稀釋液涂布于LBrif（RIF 100 μg/mL）、LBnal（NAL 20 μg /mL）及LB平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。計(jì)數(shù)后根據(jù)濃度梯度換算原液中可生長菌落數(shù)，每株菌3 個(gè)平行。突變頻率（f）計(jì)算公式如下：

式中：fR為RIF篩選下的突變頻率；fN為NAL篩選下的突變頻率；CR為換算后原液中可在RIF平板上生長菌落數(shù)；CN為換算后原液中可在NAL平板上生長菌落數(shù)；CB為換算后原液中菌落數(shù)。

當(dāng)fR或/和fN大于10-6則為高頻突變子。

1.3.2 CIP的MIC測定

CIP對(duì)高頻突變子的MIC采用美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institution，CLSI）推薦使用的瓊脂稀釋法測定[25]。CIP質(zhì)量濃度為2、4、8、16、32、64 μg/mL和128 μg/mL。E.coliATCC 25922和E.faecalisATCC 29212為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌。

1.3.3 MMR關(guān)鍵蛋白編碼基因及耐藥相關(guān)編碼基因突變檢測

采用普通PCR檢測MMR關(guān)鍵蛋白編碼基因及耐藥相關(guān)編碼基因，引物如表1所示。使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit制備DNA模板，PCR體系為50 μL：上、下游引物各0.6 μmol/L，rTaq或LATaq酶2.5 U，DNA模板500 ng。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，相應(yīng)退火溫度下退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，退火溫度由相應(yīng)基因的引物序列決定。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳后于凝膠成像檢測。將PCR產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技有限公司測序，測序結(jié)果采用在線比對(duì)軟件BLAST進(jìn)行分析比對(duì)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.3.4 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

依據(jù)前期研究（血清型：Salmonellaenteritidis；采樣類型：冰鮮雞翅；采樣地點(diǎn)：陜西西安楊凌；采樣時(shí)間：2010年；耐藥譜：AMP-AMC-TCY-SXT-FIS-TMPNAL）篩選103D2作為受體菌[24]。103D2為UvrD（Val 440 Ala）突變及MutS沉默突變型高頻突變子。采用電轉(zhuǎn)化法將攜帶野生型mutH、mutL、mutS及uvrD基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)103D2中，通過含有100 μg/mL AMP的LB平板篩選轉(zhuǎn)化后陽性克隆[7]，并分別命名為103D2:P-mutH、103D2:P-mutL、103D2:P-mutS和103D2:P-uvrD。

1.3.5 real-time PCR分析

互補(bǔ)菌株耐藥相關(guān)基因表達(dá)水平采用real-time PCR法進(jìn)行測定，引物如表1所示。方法如下：分別取5 μL 103D2、103D2:P-mutL、103D2:P-mutS、103D2:P-mutH和103D2:P-uvrD過夜培養(yǎng)菌懸液，轉(zhuǎn)接至20 mL含有CIP（2 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 h。采用試劑盒對(duì)總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄，通過Nano 200核酸蛋白測定儀測定cDNA含量及質(zhì)量。反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 1×SYBR Premix ExTaqII，上、下游引物各0.4 μmol/L，cDNA 100 ng，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)在Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-time PCR System進(jìn)行，運(yùn)行條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，相應(yīng)退火溫度退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；60 ℃延伸30 s。每個(gè)基因每個(gè)菌株做3 次平行，以gyrB基因?yàn)閮?nèi)參基因[26]，以等量無核酸酶水替代RNA為無模板對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控，采用2-ΔΔCt方法，進(jìn)行不同基因在mRNA水平相對(duì)表達(dá)量差異分析[26-27]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS ver.19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，mut基因缺陷與QRDR突變及CIP MIC間相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，組內(nèi)變化采用單因素方差分析，103D2與4 種互補(bǔ)菌株中耐藥相關(guān)基因表達(dá)差異采用GLM程序進(jìn)行方差分析，P＜0.05，差異顯著?；パa(bǔ)菌株與耐藥相關(guān)基因表達(dá)差異、突變頻率間的關(guān)系則采用R軟件包進(jìn)行分析[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌高頻突變子CIP藥敏性及耐藥相關(guān)基因突變

90 株沙門氏菌高頻突變子中有89 株（98.9%）對(duì)CIP耐藥，其中CIP MIC為4 μg/mL共4 株（4.4%），MutS突變1 株（33.3%）；16 μg/mL共16 株（17.8%），其中MutS突變11 株（68.8%）；32 μg/mL共32 株（35.5%），其中MutS突變11 株（34.4%）；64 μg/mL 29 株（32.2%），其中MutS突變17 株（58.6%）；128 μg/mL 9 株（10.0%），其中MutS突變9 株（100.0%）。通過CIP對(duì)高頻突變子MIC及MutS突變關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，除CIP MIC為16 μg/mL以外，MutS突變檢出率隨著CIP MIC升高而增加（P＜0.05），表明沙門氏菌高頻突變子MutS缺陷與CIP耐藥性具有潛在相關(guān)性（圖1）。

圖1 不同CIP MIC下超級(jí)突變子MutS突變情況Fig.1 Distribution of MutS mutation among different CIP MICs

測序結(jié)果表明，沙門氏菌高頻突變子中GyrA及ParC蛋白發(fā)生突變的菌株分別為53 株（58.9%）及69 株（76.7%），所有GyrA突變均含有87位氨基酸突變（Asp 87 Asn或Asp 87 Gly），ParC突變均含有80位氨基酸突變（Ser 80 Arg），少數(shù)菌株還含有ParC 57位氨基酸突變（Thr 57 Ser）及GyrA 83（Ser 83 Phe）、89位氨基酸突變（IIe 89 Val）（表2）。

表2 90 株沙門氏菌高頻突變子QRDRs氨基酸突變Table 2 Amino acid substitutions in QRDRs of 90 Salmonella hypermutators

2.2 突變頻率與MMR突變及QRDR突變關(guān)聯(lián)分析

90 株高頻突變子中，49 株（54.4%）MMR系統(tǒng)中主要功能蛋白MutS突變（MutS-），且這49 株突變位點(diǎn)均為Val 246 Ala突變。在49 株MutS突變株中，GyrA及ParC突變檢出率分別為67.3%（33 株）及87.6%（43 株）；在MutS未突變菌株中，GyrA及ParC突變檢出率分別為48.8%（20 株）及63.4%（26 株），其中ParC在MutS突變和未突變株中突變檢出率具有顯著性差異（圖2、表3）。

圖2 GyrA、ParC突變檢出率與MutS突變間的關(guān)系Fig.2 Relationship between MutS mutation and GyrA and ParC mutation

使用RIF篩選時(shí)，沙門氏菌高頻突變子突變頻率分布在4.05×10-8～2.37×10-1之間，使用NAL篩選時(shí)突變頻率分布在1.34×10-1～9.71×10-1之間，絕大多數(shù)菌株分布在10-4～10-1之間。MutS突變檢出率隨著突變頻率升高而增加，且具有顯著差異（P=0.018）（圖3、表3）。不同突變頻率下gyrA（P=0.986）與parC（P=0.417）突變檢出率，以及不同CIP MIC下，gyrA（P=0.865）與parC（P=0.164）突變檢出率并未發(fā)現(xiàn)具有顯著差異。

圖3 不同突變頻率下高頻突變子MutS突變情況Fig.3 Distribution of MutS mutation among different mutation frequencies

表390 株沙門氏菌高頻突變子CIP MIC、QRDR突變、RIF篩選突變頻率及MutS突變分布Table 3 CIP MICs against and QRDR mutation, rifampin mutation frequency, and MutS mutation of 90 Salmonella hypermutators

2.3 互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)

攜帶野生型mutH、mutL、mutS及uvrD基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入103D2，互補(bǔ)前后耐藥相關(guān)基因?qū)?yīng)的氨基酸突變情況并未發(fā)現(xiàn)變化（數(shù)據(jù)未顯示）。RIF篩選下103D2突變頻率（（4.05±0.589）×10-8）與4 株互補(bǔ)菌株間突變頻率（（3.87±0.387）×10-8～（4.13±0.150）×10-8）并沒有顯著變化（P＞0.05）。而NAL篩選下103D2:P-mutL突變頻率（（3.99±0.189）×10-1）、103D2:P-uvrD突變頻率（（3.97±0.27）×10-1）及103D2:P-mutS突變頻率（（5.34±0.378）×10-1）均顯著下降（表4）。雖然CIP MIC由5 μg/mL（103D2）降至3.75 μg/mL（103D2:P-mutS、103D2:P-uvrD），但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并無顯著差異（表4）。

表4103 D2和互補(bǔ)菌株突變頻率及CIP MIC變化Table 4 Mutation frequencies of and CIP MICs against 103D2 and its four transformants

2.4 real-time PCR分析

除gyrA、hilA、acrA、dnaQ及soxS以外，互補(bǔ)菌株在其他耐藥相關(guān)基因的表達(dá)與103D2具有顯著差異（P＜0.05）（表5、圖4）。其中tolC（外排泵基因）與marA（多重耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子）在互補(bǔ)前后表達(dá)量具有極顯著差異（P＜0.01）。103D2:P-mutH中acrE、parC、tolC、marR及mutT基因表達(dá)顯著上調(diào)，acrB、marA、ompF及ompR基因顯著下調(diào)，其中parC、tolC及hilA基因表達(dá)主要受mutH互補(bǔ)影響（表5、圖4）。103D2:P-mutL中acrB、ompF、tolC及mutT基因表達(dá)顯著上調(diào)，parC及marA基因表達(dá)顯著下調(diào)，其中parC、hilA及soxS表達(dá)主要受mutL互補(bǔ)影響（表5、圖4）。103D2:P-mutS中acrE、tolC、marR及ompR基因表達(dá)顯著上調(diào)，acrB、parC及marA基因表達(dá)顯著下調(diào)，其中ompF、acrB及acrE表達(dá)主要受mutS互補(bǔ)影響（表5、圖4）。103D2:P-uvrD中parE及marR基因表達(dá)顯著上調(diào)，tolC、marA、ompR及ompF基因表達(dá)顯著下調(diào)，其中marA主要受uvrD互補(bǔ)影響（表5、圖4）?？傮w來看，對(duì)103D2進(jìn)行互補(bǔ)后，marA基因表達(dá)量顯著下調(diào)。除103D2:P-uvrD外，其余互補(bǔ)株在互補(bǔ)后tolC基因表達(dá)顯著上調(diào)。

表5 103D2及互補(bǔ)菌株耐藥相關(guān)基因表達(dá)差異Table 5 Differential expression levels of antibiotic resistant genes in 103D2 and its four transformants

圖4 mut基因轉(zhuǎn)入對(duì)耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of exogenous mut genes on the expression of antibiotic resistance genes

在103D2及其互補(bǔ)株中，tolC及acrA表達(dá)量與CIP MIC顯著正相關(guān)，而tolC表達(dá)與突變頻率（NAL、RIF）間并無明顯相關(guān)性。acrA表達(dá)與NAL篩選下突變頻率正相關(guān)，與RIF篩選下突變頻率負(fù)相關(guān)。ompF、ompR與RIF篩選下突變頻率顯著正相關(guān)。marR表達(dá)與CIP MIC負(fù)相關(guān)，但與突變頻率（NAL、RIF）間并無明顯相關(guān)性。不同基因間，marR與acrA、marA、acrB及parE均負(fù)相關(guān)，與其他基因間未有明顯正相關(guān)（圖5）。

圖5 103D2及其互補(bǔ)株中耐藥相關(guān)基因表達(dá)、突變頻率及CIP MIC相關(guān)性分析Fig.5 Correlation between antibiotic resistance genes and mutation frequency of and CIP MIC against 103D2 and its four transformants

3 討論與結(jié)論

NAL或RIF篩選下，細(xì)菌的突變頻率在4×10-8～4×10-7之間為弱突變子，突變頻率≥4×10-7為強(qiáng)突變子[29-30]。本研究中90 株食源性沙門氏菌中除1 株在RIF篩選下為弱突變子，其余為強(qiáng)突變子，在NAL篩選下均為強(qiáng)突變子。而國內(nèi)外有關(guān)沙門氏菌[5]、結(jié)核桿菌（M.tuberculosis）[28]、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）[17]、E.coli[16,21,29]、陰溝腸桿菌（E.cloacae）[14]及金黃色葡萄球菌（S.aureus）[28]類似研究中，強(qiáng)突變子檢出率均低于弱突變子。導(dǎo)致結(jié)果差異的主要原因可能是：1）菌株種屬不同；2）菌株來源地不同，菌株來源國家、地點(diǎn)及環(huán)境不同會(huì)導(dǎo)致其生理特性產(chǎn)生差異；3）菌株采樣樣品不同，相似研究中絕大多數(shù)供試菌株分離自人類臨床感染，而本研究供試菌株均分離自食品。因此，盡管突變頻率篩選方法一樣或者類似，突變頻率分布也有差異[19,31-32]。

研究并未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌高頻突變子的突變頻率與CIP MIC間顯著相關(guān)，早前研究也有類似結(jié)論[17]。然而也有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)突變頻率的小幅增加便可顯著提高氟喹諾酮類抗生素對(duì)細(xì)菌的MIC[14,16,28,33]。除MMR系統(tǒng)外，細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)還有很多自修復(fù)系統(tǒng)及應(yīng)答系統(tǒng)（例如SOS系統(tǒng)、直接修復(fù)、切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)等），均可以阻止細(xì)菌細(xì)胞自發(fā)突變頻率及耐藥性增加[31]。雖然有研究表明SOS修復(fù)系統(tǒng)對(duì)降低細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物敏感性及突變頻率影響非常有限，但其他修復(fù)系統(tǒng)仍可以一定程度上降低由MMR系統(tǒng)缺陷引起的突變頻率及氟喹諾酮類抗生素敏感性升高[9]。

前期Salmonella、E.coli及M.tuberculosis高頻突變子相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MMR系統(tǒng)缺陷可顯著提高細(xì)菌突變頻率，增加抗生素作用靶位點(diǎn)基因突變或影響耐藥相關(guān)基因表達(dá)（例如：外排泵激活、外膜蛋白改變），從而使突變子耐藥表型增加耐藥能力增強(qiáng)[12,17,33-34]。細(xì)菌氟喹諾酮類抗生素耐藥性主要與喹諾酮耐藥決定區(qū)中GyrA、GyrB、ParC及ParE蛋白突變有關(guān)[28,35-36]。盡管本研究在突變頻率與CIP MIC間、突變頻率與QRDR突變檢出率間和CIP MIC與QRDR突變檢出率間并沒有發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性，但MutS缺陷型高頻突變子中QRDR突變檢出率顯著高于MutS正常的突變子（表3）。由此可以發(fā)現(xiàn)MMR缺陷的確能提高耐藥相關(guān)蛋白突變頻率，從而影響細(xì)菌耐藥性。

國內(nèi)外大量研究表明，mutS、mutH、mutL及uvrD缺陷是細(xì)菌產(chǎn)生高頻突變表型及高水平耐藥的最主要因素[14,17-18,20,28,37-40]。本研究中野生mut基因轉(zhuǎn)入高頻突變子103D2后，NAL篩選下突變頻率顯著降低（表4）。Sheng Huanjing[13]及Yang Baowei[8]等研究發(fā)現(xiàn)，向MMR缺陷型Salmonella和E.coli高頻突變子中轉(zhuǎn)入野生mut基因后，其突變頻率顯著降低，這與本研究結(jié)果相似。然而RIF篩選條件下103D2互補(bǔ)菌株突變頻率并沒有顯著降低，主要原因可能是：1）前期類似研究中菌株RIF篩選下突變頻率在10-7～10-5之間，遠(yuǎn)高于本研究中103D2 RIF篩選下突變頻率10-8。因此盡管互補(bǔ)野生mut基因后103D2突變頻率有所降低，但由于數(shù)值較小，統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算并沒有顯著差異；2）由于103D2并非工程菌，而是自然條件下從食品樣品中分離的高頻突變子，雖然與類似研究中研究對(duì)象都是Salmonella，但本研究中103D2是否有其他基因突變影響突變頻率尚未可知。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)沙門氏菌高頻突變子CIP MIC與MutS突變呈正相關(guān)。然而在CIP MIC為16 μg/mL時(shí)，MutS突變株高于MIC為32 μg/mL及64 μg/mL（圖1），該差異產(chǎn)生的主要原因可能與其他耐藥因素有關(guān)。雖然細(xì)菌CIP耐藥性與MMR缺陷呈正相關(guān)，但同時(shí)也受其他因素影響，例如，抗生素結(jié)合位點(diǎn)突變（例如GyrA、ParC），外排泵系統(tǒng)非正常表達(dá)（例如AcrAB-TolC），以及染色體基因外編碼的抗生素水解酶等[12-13,23]。

轉(zhuǎn)入野生mut基因后，103D2 CIP MIC從5 μg/mL降至3.75～4.0 μg/mL。為探究差異原因，研究采用realtime PCR對(duì)耐藥相關(guān)基因表達(dá)差異進(jìn)行測定。與103D2相比，103D2:P-mutS及103D2:P-uvrD中marR基因表達(dá)上調(diào)，marA基因表達(dá)下調(diào)。盡管103D2:P-mutS中acrA沒有明顯變化，103D2:P-uvrD中acrA及acrB沒有明顯變化，但是103D2:P-mutS中acrB及103D2:P-uvrD中tolC均顯著下調(diào)（表5、圖4）。有研究表明marR的鈍化可以增加marA的表達(dá)，外排泵編碼基因acrAB及tolC轉(zhuǎn)錄會(huì)增加，從而提高CIP抗藥能力[38-39]。本研究4 株互補(bǔ)株中marR基因表達(dá)與其CIP MI、acrA、marA、acrB表達(dá)變化均呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論（圖5）。因此，推測103D2:P-mutS及103D2:P-uvrD有可能是通過影響外排泵基因表達(dá)降低對(duì)CIP耐藥能力。然而，由于耐藥相關(guān)基因不同系統(tǒng)間相互作用、相互補(bǔ)償、相互影響，因此MutS及UvrD具體是通過哪種路徑，以及103D2 CIP MIC的減少是否直接由外排泵基因表達(dá)異常所引起，仍需要更進(jìn)一步的研究。

盡管本研究中高頻突變子突變頻率與QRDR突變和CIP MIC間并沒有顯著的相關(guān)性，但MutS缺陷型高頻突變子中QRDR突變比例顯著高于MutS正常的突變子。同時(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMR缺陷可影響外排泵和膜編碼基因marA、marR和tolC的表達(dá)，進(jìn)一步影響沙門氏菌高頻突變子的耐藥性及突變頻率?？傊琈MR系統(tǒng)缺陷可通過影響食源性沙門氏菌高頻突變子突變頻率與耐藥相關(guān)基因表達(dá)影響突變子對(duì)抗生素耐藥能力。研究其影響機(jī)制對(duì)控制高水平耐藥沙門氏菌的傳播，保障食品安全具有重要意義。