羧甲基魔芋葡甘露聚糖對豌豆蛋白水分散液的穩(wěn)定性作用

陶 冉，李瑞琪，郭亞龍，韋 越，張洪斌

（上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 200240）

除傳統(tǒng)意義上的中性蛋白飲料（如牛奶）外，酸性蛋白飲料由于營養(yǎng)豐富、口感獨(dú)特，逐漸在蛋白飲料消費(fèi)市場占據(jù)重要地位。相比于市場上長期大量存在的動物蛋白（主要為酪蛋白）飲料，近年來，消費(fèi)者對中性與酸性植物蛋白飲料的需求不斷增加[1-2]。豌豆蛋白作為一種植物來源的天然可持續(xù)性蛋白質(zhì)，不僅價格低、營養(yǎng)價值高、致敏性低，還具有降低膽固醇、血壓等獨(dú)特生理活性[3-4]，是代替動物蛋白用于食品配方的可靠原料之一，無疑在蛋白飲料行業(yè)具有更強(qiáng)的應(yīng)用前景[5-7]。然而，豌豆蛋白因表面疏水性強(qiáng)且電荷量低，導(dǎo)致其在水中的溶解度低、物理穩(wěn)定性差[8-9]。尤其在酸性條件下，當(dāng)體系pH值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，豌豆蛋白易發(fā)生聚集，使體系穩(wěn)定性進(jìn)一步大幅降低[9]，因此豌豆蛋白在酸性蛋白飲料中的應(yīng)用受到很大限制。如何控制豌豆蛋白在中性特別是酸性條件下的穩(wěn)定分散，是豌豆蛋白飲料發(fā)展的主要瓶頸問題。

一些天然生物大分子多糖作為增稠劑、乳化劑、膠凝劑和穩(wěn)定劑等，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[10-12]。通過多糖與蛋白質(zhì)相互作用，可以阻止或減緩蛋白質(zhì)的聚集和沉降，提高蛋白分散液的物理穩(wěn)定性[11,13-14]。多糖對蛋白分散液體系的穩(wěn)定主要有2 種作用機(jī)制：一是在酸性條件下，聚陰離子多糖，如果膠[10,15-16]、羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）[17-19]或大豆可溶性多糖[20]，可與帶正電荷的蛋白顆粒形成靜電復(fù)合物，通過靜電排斥和空間位阻保持蛋白質(zhì)分散液的穩(wěn)定性[9]。這些多糖與酪蛋白膠束發(fā)生靜電吸附，在蛋白膠束表面形成了刷狀或環(huán)狀吸附結(jié)構(gòu)，從而阻止了蛋白膠束的酸誘導(dǎo)聚集使體系穩(wěn)定。二是，添加的多糖在體系中形成高分子物理纏結(jié)網(wǎng)絡(luò)，增加了連續(xù)相的黏度，從而阻礙和遲滯了蛋白顆粒的聚集和沉降[21]。而對于添加了聚陰離子多糖的酸性乳體系，上述2 種穩(wěn)定作用均會存在。作為多相多組分復(fù)雜體系的多糖-蛋白分散液，其穩(wěn)定性與諸多因素有關(guān)，除加工工藝的影響外[19]，多糖穩(wěn)定劑本身的結(jié)構(gòu)和性能是穩(wěn)定體系的主導(dǎo)因素，特別是多糖分子參數(shù)（如分子質(zhì)量及取代度和取代分布）對體系物理穩(wěn)定性起著決定性作用[17-18,22]。

在乳液制品研究領(lǐng)域，對高性能穩(wěn)定劑的需求和對穩(wěn)定劑不同穩(wěn)定機(jī)理的闡明一直處于不斷發(fā)展中。近期對魔芋葡甘露聚糖（konjac glucomannan，KGM）、CMC和玉米纖維膠以及羧甲基改性的玉米纖維膠（carboxymethylated corn fiber gum，CMCFG）提高豌豆蛋白分散液（pea protein dispersion，PPD）穩(wěn)定性的能力進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，KGM的添加可通過增黏作用實(shí)現(xiàn)PPD在中性和酸性（pH 3.5）條件下的物理穩(wěn)定，羧甲基化的CMC和CMCFG則通過與豌豆蛋白的靜電吸附促成了體系的穩(wěn)定[21]。目前，對高濃度、高分子質(zhì)量和高取代度的多糖有利于乳狀液穩(wěn)定逐漸形成了共識，但穩(wěn)定劑分子的分子質(zhì)量和取代度同時變化時如何影響乳狀液的行為尚不清晰。

KGM具有天然的生物相容性、生物可降解性、增稠性、膠凝性和成膜性等，同時作為優(yōu)良的膳食纖維和食品原料，還具有降低血液膽固醇和血糖含量以及促進(jìn)腸道消化和特異免疫功能的特性，已被廣泛用于食品、化工和生物醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域[12,23-25]。盡管KGM具有諸多功能特性和健康益處，但水溶性低以及低濃度下的高黏性也造成制得的乳飲料口感不佳。羧甲基化是一種常用的多糖安全改性方法，改性不僅能改善多糖水溶性而且還能在很大程度上保留其生物活性[26]。研究表明，羧甲基魔芋葡甘露聚糖（carboxymethylated konjac glucomannan，CMKGM）可在保持KGM原有生物相容性和增稠性的基礎(chǔ)上，大大提高其水溶性和水溶液穩(wěn)定性[27-29]。本研究基于合成的一系列具有不同取代度和不同分子質(zhì)量的CMKGM，通過對體系粒徑、Zeta電位、表觀黏度和不穩(wěn)定性指數(shù)的測定，著重研究CMKGM在分子質(zhì)量和取代度同時變化的情況下對PPD穩(wěn)定行為的影響，評估其在中性和酸性條件下對PPD的穩(wěn)定效果，并分析其不同穩(wěn)定機(jī)理，以期發(fā)展新型乳飲料穩(wěn)定劑，為植物蛋白基飲料配方的開發(fā)提供有價值的技術(shù)信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KGM 湖北一致魔芋生物科技股份有限公司；NUTRALYS?S85F豌豆分離蛋白（純度85%） 法國羅蓋特公司；鹽酸和檸檬酸等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水為實(shí)驗室自制；CMKGM為基于文獻(xiàn)[27]方法，制備7 種不同分子質(zhì)量和不同取代度的樣品，見表1。

表1 不同取代度的CMKGM樣品信息Table 1 Information about CMKGM with different degrees of substitution

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MZ3004磁力攪拌器 上海志威電器有限公司；Milli-Q Plus超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；HAAKE MARSIII旋轉(zhuǎn)流變儀 美國Thermo Fisher公司；高壓均質(zhì)機(jī) 美國NanoDeBEE公司；LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀 德國LUM GmbH公司；Zetasizer Nano-ZS90粒徑分析儀 英國馬爾文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 PPD的制備

稱取一定量的豌豆分離蛋白分散于超純水中，在室溫下攪拌1 h，并用高壓均質(zhì)機(jī)在50 MPa下循環(huán)均質(zhì)7 次，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的PPD。將CMKGM樣品溶于超純水中，配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的多糖溶液，然后將1% PPD與多糖溶液以1∶1的質(zhì)量比混合后攪拌1 h，采用500 g/kg的檸檬酸調(diào)節(jié)pH值至3.5，繼續(xù)攪拌1 h，獲得多糖穩(wěn)定的蛋白分散液。

1.3.2 不穩(wěn)定指數(shù)測試

采用穩(wěn)定性分析儀對新鮮制備的PPD-多糖復(fù)合物（中性和pH 3.5）進(jìn)行穩(wěn)定性測試。測試條件：轉(zhuǎn)速3 000 r/min，光源865 nm，測試時長1.0 h，溫度25 ℃。

1.3.3 Zeta電位和粒徑測試

將PPD-多糖復(fù)合物分別用相應(yīng)pH值的去離子水稀釋100 倍，采用粒徑分析儀分別測定體系在中性和pH 3.5條件下的Zeta電位和平均粒徑，測試溫度25 ℃，每個樣品重復(fù)測定3 次。

1.3.4 表觀黏度測試

在控制應(yīng)力流變儀上進(jìn)行PPD體系的穩(wěn)態(tài)剪切流動行為測試。測試條件：采用60 mm平行板，平行板之間的間隙為0.5 mm，溫度25 ℃，剪切速率范圍0.01～1 000 s-1。實(shí)驗時在夾具邊緣滴加輕質(zhì)硅油（10 mPa·s）進(jìn)行密封，以減少實(shí)驗過程中的水揮發(fā)，樣品在測試溫度下靜置平衡5 min后開始測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定條件下不同CMKGM對PPD體系的穩(wěn)定效果比較

如圖1所示，在透射曲線上，紅線表示樣品初始狀態(tài)的透過率，綠線代表測試進(jìn)行過程中樣品的透過率。在離心過程中，密度大的分散相逐漸遷移到樣品管底部，從而使上清液部分的透過率增加。通過透射曲線的變化可以反映出分散液的穩(wěn)定性。一般而言，在離心過程中，透過率變化越大，樣品越不穩(wěn)定?；谕干淝€還能獲得樣品的不穩(wěn)定指數(shù)，可定量表征不同樣品穩(wěn)定性的大?。▓D2）。不穩(wěn)定指數(shù)的數(shù)值介于0～1之間，其中0表示體系非常穩(wěn)定，而1代表體系非常不穩(wěn)定。在穩(wěn)定性評估中，以不穩(wěn)定指數(shù)達(dá)到0.2或以下為穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 中性和pH 3.5條件下質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的KGM和CMKGM的1% PPD的透過率變化Fig.1 Transmittance evolution of 1% PPD stabilized by 1% KGM or different CMKGM samples at neutral and acidic (pH 3.5) conditions

圖2 中性和pH 3.5條件下質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的KGM和CMKGM的1% PPD的不穩(wěn)定指數(shù)Fig.2 Instability index of 1% PPD stabilized by 1% KGM or different CMKGM samples at neutral and acidic conditions

由圖1、2可知，在不添加穩(wěn)定劑的情況下，PPD在中性和pH 3.5下均不穩(wěn)定，且酸性條件下的不穩(wěn)定程度遠(yuǎn)大于中性條件。這是由于豌豆蛋白在水中的溶解度低，在離心過程中容易發(fā)生聚集[9]，特別是當(dāng)pH值降低，接近豌豆蛋白等電點(diǎn)（～pH 4.5）時，蛋白顆粒之間的靜電斥力減弱，更加劇了蛋白膠束的聚集和沉降。多糖的添加在很大程度上改善了體系的穩(wěn)定性。僅質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的中性KGM，PPD在中性和酸性條件下都能表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。由于不產(chǎn)生有效吸附，這主要是由于KGM的增黏作用[21]。在中性條件下，當(dāng)添加1%的具有不同取代度和不同分子質(zhì)量的CMKGM樣品時，僅有CMKGM-1能夠有效穩(wěn)定PPD，其他樣品（CMKGM-2～CMKGM-7）均不能起到穩(wěn)定作用。由于在中性條件下，豌豆蛋白顆粒和多糖分子均帶負(fù)電荷，多糖的穩(wěn)定作用主要來源于其增黏作用，然而對于CMKGM-2～CMKGM-7樣品，由于分子質(zhì)量逐漸降低，在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下（1%）不能起到有效的增黏作用，故不能穩(wěn)定PPD。在pH 3.5條件下，CMKGM-1、CMKGM-2和CMKGM-3均能在一定程度上保持PPD的穩(wěn)定，這是因為在酸性條件下豌豆蛋白帶正電，帶負(fù)電的CMKGM能夠與豌豆蛋白發(fā)生靜電吸附使PPD-多糖復(fù)合物帶負(fù)電，從而通過靜電排斥作用和空間位阻作用阻礙蛋白顆粒的聚集。再加上未吸附多余多糖分子的增黏作用，兩者共同維持了PPD體系的穩(wěn)定。然而，盡管CMKGM-4～CMKGM-7這4 個樣品的羧甲基的取代度增加有利于發(fā)揮其在酸性條件下穩(wěn)定PPD體系中的靜電排斥作用，但是由于分子質(zhì)量過低導(dǎo)致增黏作用大幅減弱，使這些樣品在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的條件下不能穩(wěn)定酸性PPD體系。

2.2 不同分子參數(shù)CMKGM對穩(wěn)定PPD體系的臨界添加量

如前所述，雖然添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的KGM能夠有效穩(wěn)定中性和酸性PPD體系，但對于不同的CMKGM樣品，由于分子質(zhì)量降低，在相同的添加量下（1%），大多數(shù)CMKGM不能有效穩(wěn)定PPD體系。因此，確定不同取代度和不同分子質(zhì)量CMKGM的臨界穩(wěn)定添加量，對于CMKGM在PPD體系穩(wěn)定中的開發(fā)和利用具有重要指導(dǎo)意義。如圖3A所示，CMKGM的分子質(zhì)量越低，達(dá)到穩(wěn)定所需的臨界多糖添加量也越高。從CMKGM-1的1%，增大到CMKGM-7的20%才能穩(wěn)定PPD。由此可見，盡管取代度高，但分子質(zhì)量的高低是CMKGM穩(wěn)定PPD的主導(dǎo)因素。過低的分子質(zhì)量，不僅對PPD體系連續(xù)相的增黏效果減弱，而且吸附后不能在蛋白顆粒表面形成有效的空間位阻作用。需要指出，對于CMKGM-1、CMKGM-2和CMKGM-3這3 個樣品，達(dá)到體系物理穩(wěn)定（不穩(wěn)定指數(shù)小于0.2）所需的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在2%以下，從實(shí)際應(yīng)用的角度更具有經(jīng)濟(jì)性。而且相比于未改性的KGM，改性后CMKGM的水溶性增加、分子質(zhì)量有所降低，有望改善KGM黏度高帶來的不良口感。

圖3 中性和pH 3.5條件下不同CMKGM的臨界穩(wěn)定添加量（A）和相應(yīng)PPD-多糖體系的不穩(wěn)定指數(shù)（B）Fig.3 Critical stabilization concentrations (A) of KGM and different CMKGM samples for 1% PPDs and instability index (B) of systems at neutral and acidic conditions

2.3 PPD-CMKGM靜電復(fù)合物的Zeta電位分析

PPD-多糖靜電復(fù)合物的穩(wěn)定性在很大程度上取決于分子之間的引力和斥力。Zeta電位可以反映顆粒之間靜電相互作用的強(qiáng)弱。如圖4所示，在中性條件下復(fù)合物的Zeta電位為負(fù)值，在酸性條件下為正值，且絕對值較小。加入KGM后，由于KGM為中性多糖，對Zeta電位影響較小。在中性條件下，加入相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CMKGM后，復(fù)合物Zeta電位絕對值隨取代度增加而增加。這是因為取代度越高，CMKGM所帶負(fù)電荷量越高。在酸性條件下，加入相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CMKGM后，Zeta電位由正變負(fù)，且絕對值隨取代度的增加而增加。這是因為CMKGM吸附到豌豆蛋白表面形成靜電復(fù)合物。此外，從圖4A和圖4B對比分析可以看到，無論在中性還是酸性條件下，對于同一種CMKGM，復(fù)合物Zeta電位的絕對值隨CMKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大?？傊?，CMKGM的取代度越高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，復(fù)合物的Zeta電位絕對值越大。在中性條件下，豌豆蛋白和CMKGM都帶負(fù)電，2 種生物高分子會發(fā)生熱力學(xué)不相容，不利于體系穩(wěn)定；同時豌豆蛋白上的局部正電荷可能與CMKGM發(fā)生靜電吸附形成少量靜電復(fù)合物，促進(jìn)體系穩(wěn)定。在酸性條件下，帶正電的豌豆蛋白與帶負(fù)電的CMKGM發(fā)生靜電吸附形成大量靜電復(fù)合物，復(fù)合物顆粒之間的靜電斥力和空間位阻有利于體系穩(wěn)定。

圖4 中性和pH 3.5條件下當(dāng)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%（A）和臨界穩(wěn)定添加量（B）時添加KGM和不同CMKGM的1% PPD的Zeta電位Fig.4 Zeta potential of 1% PPD stabilized by KGM or different CMKGM samples at a concentration of 1% (A) and at crititical stabilization concentration (B) under neutral and acidic conditions

2.4 PPD-CMKGM靜電復(fù)合物的粒徑分析

根據(jù)斯托克斯定律，較小的粒徑和較高的連續(xù)相黏度有利于減緩顆粒的沉降速度，從而有助于提高分散液的物理穩(wěn)定性[30]。在中性條件下，在PPD中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的CMKGM后，粒徑表現(xiàn)出不同程度的增加（圖5A）。其原因主要從以下兩方面考慮：第一，豌豆蛋白和CMKGM的熱力學(xué)不相容促使蛋白發(fā)生聚集；第二，CMKGM通過與豌豆蛋白上的局部正電荷發(fā)生靜電吸附包覆于表面。在酸性條件下，在PPD中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的CMKGM后，粒徑也有不同程度的增加，而且相比于取代度較低的樣品，取代度較高的樣品導(dǎo)致粒徑增加較少。一方面，這是因為取代度越高的樣品帶電量大，與蛋白之間的吸附更為緊密；另一方面，高取代度樣品的分子質(zhì)量本身也小于低取代度樣品（表1）。此外，在中性和酸性條件下，對于同種CMKGM，加入的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，復(fù)合物的粒徑越大（圖5B），這是因為CMKGM質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加使蛋白表面吸附的多糖數(shù)量增多，甚至可能發(fā)生多層吸附。

圖5 中性和pH 3.5條件下當(dāng)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%（A）和臨界穩(wěn)定添加量（B）時添加KGM和不同CMKGM的1% PPD的粒徑Fig.5 Particle size of 1% PPD stabilized by KGM or different CMKGM samples at a concentration of 1% (A) and at crititical stabilization concentration (B) under neutral and acidic conditions

2.5 PPD-CMKGM體系的表觀黏度分析

當(dāng)多糖添加量為1%和臨界穩(wěn)定添加量時，PPD-多糖體系的表觀黏度如圖6所示。對比分析圖6A1和A2可以看出，無論是中性還是酸性條件下，由于CMKGM分子質(zhì)量隨取代度升高而降低，加入相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的CMKGM，PPD體系的黏度隨CMKGM取代度的增大而減小，其中CMKGM-2和CMKGM-3在50 s-1的剪切速率下的黏度處在0.1～2 Pa·s之間，這對于飲料來說黏稠性較為合適。對于同種多糖樣品，在相同條件下，體系在酸性條件下（pH 3.5）的黏度均低于中性條件。這是因為CMKGM作為聚陰離子多糖，分子鏈上的部分—COO-基團(tuán)在酸性條件下被質(zhì)子化，使分子鏈內(nèi)的靜電斥力減小，分子構(gòu)象更為緊湊，使體系的黏度降低；同時，由于帶負(fù)電的多糖分子可與帶正電的豌豆蛋白發(fā)生靜電吸附，故相比于中性條件，在酸性條件下起增黏效果的CMKGM分子數(shù)量減少，也導(dǎo)致體系黏度的降低。

當(dāng)增大CMKGM的質(zhì)量分?jǐn)?shù)使體系在中性（圖6B1）和酸性（圖6B2）條件下達(dá)到物理穩(wěn)定時，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，即添加相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同種多糖時，在酸性條件下體系的黏度仍小于相應(yīng)的中性條件。這進(jìn)一步表明，在酸性條件下使體系達(dá)到物理穩(wěn)定所需的增黏作用小于中性條件。CMKGM在酸性體系中的穩(wěn)定作用在于吸附的CMKGM與蛋白質(zhì)形成靜電復(fù)合物增加了顆粒之間的靜電斥力和空間位阻，同時未吸附的CMKGM可增加連續(xù)相的黏度，這與CMC在蛋白分散液酸性體系中的穩(wěn)定作用相類似[17-18]。在不同取代度和不同分子質(zhì)量的CMKGM樣品中，CMKGM-2和CMKGM-3在較小的添加量下即可使PPD體系在酸性和中性條件下都能達(dá)到較好的穩(wěn)定效果，而且黏度較KGM有所下降，可以改善KGM作為穩(wěn)定劑的濃稠口感，對于飲料生產(chǎn)具有更好的適用性。

圖6 當(dāng)多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%（A）和臨界穩(wěn)定添加量（B）時添加KGM和不同CMKGM的1%PPD在中性和pH 3.5的表觀黏度Fig.6 Apparent viscosity of 1% PPD stabilized by KGM or different CMKGM samples at a concentration of 1% (A) and critical stabilization concentration (B) under neutral and acidic conditions

3 結(jié) 論

比較具有不同取代度和分子質(zhì)量的CMKGM對中性和酸性PPD體系物理穩(wěn)定性的影響。盡管高分子質(zhì)量和高取代度穩(wěn)定劑通常均有利于PPD體系穩(wěn)定而低分子質(zhì)量和低取代度均不利于體系穩(wěn)定，但在CMKGM的分子質(zhì)量和取代度同時變化的情況下，CMKGM分子質(zhì)量的降低和取代度的增加對PPD的穩(wěn)定有復(fù)雜的影響。隨著取代度的增加，在分子質(zhì)量逐漸降低的情況下，達(dá)到PPD體系穩(wěn)定所需的CMKGM的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，CMKGM分子質(zhì)量對體系穩(wěn)定性的影響大于取代度。在所制備的7 個改性樣品中（CMKGM-1～CMKGM-7，分子質(zhì)量依次降低而取代度依次升高），高分子質(zhì)量低取代度的CMKGM-1、CMKGM-2和CMKGM-3在小于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%條件下即可使中性和酸性PPD體系均能達(dá)到良好的物理穩(wěn)定性，而低分子質(zhì)量高取代度的CMKGM需在較高的質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下才能穩(wěn)定PPD體系。靜電排斥、空間位阻效應(yīng)和連續(xù)相高黏度為CMKGM提高PPD穩(wěn)定性的主要因素。中性條件下，由于CMKGM不發(fā)生吸附，其對連續(xù)相的增黏作用是體系穩(wěn)定的主導(dǎo)因素，而在酸性條件下，CMKGM對連續(xù)相的增黏作用和CMKGM與豌豆蛋白形成靜電復(fù)合物后產(chǎn)生的靜電斥力和空間位阻作用共同促使了體系的穩(wěn)定。