胰腺癌靶向的碳納米管超聲造影劑的制備及體內(nèi)外評價(jià)

胡楚玲，顧芬芬，臺(tái)宗光，高 申，張敏敏

0 引言

胰腺癌起病隱匿，診斷和治療困難，且預(yù)后極差。早期根治性切除是胰腺癌最有效的治療方法，但切除率僅為10%～20%，五年生存率僅為0.4%～3.4%[1-2]。因此，早期診斷和早期治療是改善胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵[3]。

超聲造影增強(qiáng)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的，與CT、MRI等其他影像學(xué)方法相比，具有價(jià)格低、安全性高、操作簡便、實(shí)時(shí)觀察等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。主要通過靜脈注射微泡造影劑，利用界面回聲阻抗差，將腫瘤從周圍組織凸顯出來，在胰腺癌診斷中的敏感性高達(dá)94%，已成為診斷胰腺疾病的主要方法[6-8]。但是，這種微泡仍然存在許多問題，例如對病變的部位無親和力。微泡的直徑較大(2～6 μm)，無法穿透血管壁到達(dá)靶細(xì)胞[9]。此外，由于半衰期短，有效維持時(shí)間只能持續(xù)數(shù)十秒或幾分鐘[10]。因此，尋找一種新型、理想、高效、體積小、穿透力強(qiáng)的新型理想靶向造影劑是腫瘤靶向成像領(lǐng)域最重要的研究方向。

多壁碳納米管(Multi-wall carbon nanotubes，MWCNT)具有高吸附性及光和高回聲的特征，可以將成像技術(shù)和藥物輸送結(jié)合起來用于疾病的診斷[11]。同時(shí)碳納米管可以穿過許多生物屏障，可用于納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，例如診斷、疾病治療、生物成像和組織工程[12-13]。碳納米管具有許多獨(dú)特的特性，但由于其不溶于水和大多數(shù)有機(jī)溶劑，從而阻礙了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，非常有必要進(jìn)行碳納米管的功能修飾，以改善生物相容性和分散性。

Hedgehog信號(hào)通路是胰腺癌形成中的重要信號(hào)通路。2003年《自然》雜志報(bào)道了Hedgehog蛋白在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)[14-15]。Hedgehog與腫瘤細(xì)胞的生長密切相關(guān)，幾乎所有胰腺癌中都高表達(dá)Hedgehog，并且在早期腫瘤中就出現(xiàn)了高表達(dá)狀態(tài)，而正常成年人的Hedgehog蛋白幾乎不表達(dá)[16-17]。Hedgehog蛋白的表達(dá)隨疾病的進(jìn)展而增加[18]。這些結(jié)果表明，Hedgehog對于胰腺癌的早期診斷非常重要，Hedgehog蛋白可以作為胰腺癌分子成像的理想標(biāo)記[19-20]?；谝陨险J(rèn)識(shí)，本研究構(gòu)建一種Hedgehog單克隆抗體修飾的超聲造影劑，用于CE-EUS以實(shí)現(xiàn)胰腺癌的特異性靶向。

在本研究中，將聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG2000)共價(jià)修飾到活化的碳納米管表面，然后與Hedgehog單克隆抗體(mAb-Hedgehog)結(jié)合。形成的受體特異性靶向的MWCNT-PEG-HH納米遞送系統(tǒng)用于US成像和藥物遞送。制備的MWCNT-PEG-HH納米靶向造影劑，與普通微泡造影劑相比，具有高分辨率、半衰期長、良好的滲透性、安全性和穩(wěn)定性的特性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Zeta sizer ZS90電位粒徑分析儀(英國Malvern公司)；透射電鏡(JEM-2010，日本JEOL公司)；傅里葉紅外儀(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(德國Leica公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；多壁碳納米管(美國Brattleboro 公司)；雙功能聚乙二醇(NH2-PEG-COOH，平均分子量2 000，嘉興博美生物技術(shù)有限公司)；Hedgehog單克隆抗體(英國Abcam公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清FBS(美國Gibco公司)，其他試劑均為分析純。胰腺癌細(xì)胞株SW1990購自美國ATCC公司。BALB/c裸鼠(雄性，4周齡)，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF潔凈室精心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)按照第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定開展。

1.2 MWCNT-PEG-HH的合成

1.2.1 MWCNTs的氧化 將2 g多壁碳納米管與體積比1∶3的濃硫酸∶濃硝酸混合(80 ml)?；旌弦涸?0 ℃ 40 kHz超聲條件下超聲7 h，繼續(xù)攪拌24 h。將反應(yīng)后的多壁碳納米管離心，凍干，備用。

1.2.2 MWCNTs-PEG-2000合成 將60 mg MWCNT-COOH溶于200 ml甲醇中，分別加入EDC和NHS 0.6 g和0.4 g，以活化羧基，混合物在室溫下攪拌3 h。所得產(chǎn)物氮?dú)獯蹈?，洗滌，凍干。?0 mg PEG-2000與活化的MWCNT-COOH 20 mg共同溶解于甲醇中，繼續(xù)攪拌24 h。所得產(chǎn)物氮?dú)獯蹈?，洗滌，離心，凍干。合成的聚合物用紅外光譜(FT-IR)進(jìn)行檢測。

1.2.3 MWCNT-PEG-HH的合成 將0.3 g EDC 和0.2 g NHS加入到20 mg MWCNT-PEG-COOH磷酸鹽緩沖液中，繼續(xù)攪拌3 h，加入50 μl Hedgehog mAb (HH)，室溫下避光攪拌24 h，洗滌，離心，凍干，得到MWCNT-PEG-HH(圖1)。合成的MWCNT-PEG-HH用紅外光譜(FT-IR)進(jìn)行檢測。將hedgehog mAb用FITC標(biāo)記，其在波長490～495 nm處有紫外吸收，故通過紫外光譜儀對合成的MWCNT-PEG-HH進(jìn)行檢測。

圖1 MWCNT-PEG-HH合成示意圖

1.3 MWCNT-PEG-HH超聲納米造影劑的形態(tài)觀察和電位測定 將適量的MWCNT-PEG-HH溶液滴于覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干剩余溶液，干燥后，利用透射電鏡觀察形態(tài)。另取MWCNT-PEG-HH溶液20 μl，加入PBS溶液中，利用粒徑分析儀測定MWCNT-PEG-HH的電位，測定條件為25 ℃、固定角90°。

1.4 MWCNT-PEG-HH超聲納米造影劑的體外細(xì)胞學(xué)評價(jià)

1.4.1 流式細(xì)胞術(shù)考察細(xì)胞攝取能力 采用流式細(xì)胞術(shù)考察超聲碳納米管(MWCNT-PEG-HH)造影劑在人胰腺癌細(xì)胞SW1990的攝取能力。將處于對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種到12孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后更換為無血清培養(yǎng)基，之后每孔加入Cy5標(biāo)記的MWCNT-PEG-HH(碳納米管濃度：10、100、200 μg/ml)，培養(yǎng)板放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。細(xì)胞利用PBS潤洗3次，胰酶消化，離心后PBS重懸。利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞對納米復(fù)合物的攝取情況。

1.4.2 共聚焦顯微鏡考察細(xì)胞內(nèi)分布情況 采用共聚焦顯微鏡考察超聲碳納米管(MWCNT-PEG-HH)造影劑在人胰腺癌細(xì)胞SW1990的細(xì)胞內(nèi)分布情況。將處于對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種到覆蓋有圓形玻璃片的24孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后更換為無血清培養(yǎng)基，之后每孔加入Cy5標(biāo)記的MWCNT-PEG-HH(碳納米管：10、100、200 μg/ml)，培養(yǎng)板放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸掉培養(yǎng)基，每孔加入500 μl 4%的多聚甲醛溶液，置于4 ℃冰箱中固定1 h，PBS潤洗3次，將每孔中的圓形玻璃片取出，吸取1滴封片液(含DAPI)滴到載玻片上，將圓形玻片細(xì)胞生長面朝下蓋于載玻片上。利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對碳納米管的攝取及胞內(nèi)分布情況，并拍照記錄。

1.4.3 CCK-8法考察超聲碳納米管細(xì)胞毒性 采用CCK-8法對碳納米管超聲造影劑(MWCNT-PEG-HH)的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察。將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞SW1990按8×103個(gè)/孔接種到覆蓋有圓形玻璃片的96孔板，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后更換為無血清培養(yǎng)基，之后每孔加入不同溶度的碳納米管超聲造影劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h，吸掉培養(yǎng)基，PBS潤洗3次，每孔加入含CCK-8的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)1 h，振蕩30 s后，酶標(biāo)儀450 nm測定OD值，以未處理細(xì)胞為對照，未接種細(xì)胞的孔為空白孔，計(jì)算各孔的細(xì)胞活力。

1.5 考察碳納米管超聲造影劑體外顯影情況 采用超聲造影儀(Mylab 90 scanner)考察碳納米管的體外造影能力。將不同濃度MWCNT及MWCNT-PEG-HH加入2 ml EP管中，以PBS為對照。在6.0 MHz超聲頻率下，用耦合劑涂覆于超聲探頭表面，在純化水介質(zhì)中考察碳納米管的體外顯影情況。

1.6 考察碳納米管超聲造影劑體內(nèi)顯影情況

1.6.1 人胰腺癌裸鼠移植瘤模型的構(gòu)建 將處于對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞利用胰酶消化，離心后用4%培養(yǎng)基重懸至1×108個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入相等體積的基質(zhì)膠溶液，在冰浴中吹打均勻。選取4周齡的BALB/c裸鼠(16～17 g)，用1 ml注射器將100 μl細(xì)胞接種液接種到裸鼠右上肢背部皮下，繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，選取18只腫瘤直徑10 mm的裸鼠，作為動(dòng)物模型用于下一步研究。

1.6.2 考察碳納米管超聲造影劑的體內(nèi)顯影 將構(gòu)建的移植瘤裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只。按照Wu等[21]多壁碳納米管偶聯(lián)前列腺干細(xì)胞的抗原抗體用于靶向超聲增強(qiáng)與藥物遞送中的給藥劑量，經(jīng)尾靜脈分別注射10 mg/kg (200 μl溶液)的MWCNT-PEG、MWCNT-PEG-HH，并以PBS為對照。注射后1 h、8 h、24 h，用超聲造影儀考察碳納米管在腫瘤、心臟、腎臟的顯影情況。

2 結(jié)果

2.1 合成材料的紅外、紫外光譜圖 通過傅里葉變換紅外光譜對合成產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(圖2A)，MWCNT-COOH在1 704 cm-1出現(xiàn)了吸收峰，這主要?dú)w因于羧基上的羰基。當(dāng)用PEG-2000共價(jià)修飾后，新的吸收帶出現(xiàn)在2 928 cm-1和2 854 cm-1處，這屬于-CH2對稱拉伸振動(dòng)。959 cm-1處的吸收峰歸因于-C-O-C面內(nèi)形變振動(dòng)，而1 410 cm-1處的吸收峰屬于-CH2的彎曲振動(dòng)。此外，從圖中可以看出，1 704 cm-1處的吸收帶強(qiáng)度顯著降低，表明MWCNT-COOH裸露的COOH基團(tuán)通過共價(jià)鍵成功地與PEG2000結(jié)合。紫外光譜顯示(圖2B)，MWCNT-PEG-HH在波長490～495 nm處有紫外吸收，表明Hedgehog抗體連接成功。

圖2 MWCNT-PEG-HH的表征注：A.MWCNT-PEG-HH、MWCNT-PEG紅外光譜圖；B.MWCNT-PEG-HH、MWCNT-PEG紫外可見光譜圖

2.2 多壁碳納米管超聲造影劑的形態(tài)、電位 將制備的碳納米管造影劑于透射電子顯微鏡下觀察，多壁碳納米管具有良好的分散性，長度在400 nm左右(圖3A)。電位粒徑分析儀測得碳納米管造影劑的電位為(-38.9±4.28) mV(圖3B)。

圖3 MWCNT-PEG-HH的表征注：A.MWCNT-PEG-HH的Zeta電位；B.MWCNT-PEG-HH的透射電鏡圖

2.3 多壁碳納米管超聲造影劑的體外攝取能力評價(jià) 通過流式細(xì)胞術(shù)觀察胰腺癌細(xì)胞對靶向納米造影劑的攝取情況。如圖4A和4B所示，MWCNT-PEG-HH的攝取呈濃度依賴性，當(dāng)濃度為100 μg/ml時(shí)，陽性Cy3細(xì)胞接近100%，平均熒光強(qiáng)度為578。說明人胰腺癌細(xì)胞可以高效攝取載Hedgehog抗體的多壁碳納米管超聲造影劑。

利用激光共聚焦顯微鏡觀察多壁碳納米管超聲造影劑在人胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的分布情況。圖4C中藍(lán)色表示DAPI深染的細(xì)胞核，紅色表示的是細(xì)胞內(nèi)分布的Cy5熒光染料。從圖中可以看出，MWCNT-PEG-HH組紅色熒光出現(xiàn)在藍(lán)色的細(xì)胞核周圍，較Cy5組熒光強(qiáng)，說明Cy5被成功遞送到SW1990細(xì)胞內(nèi)。

圖4 MWCNT-PEG-HH的細(xì)胞攝取情況注：A.流式細(xì)胞數(shù)據(jù)(MWCNT-PEG-HH濃度分別為10、100、200 μg/ml)；B.平均熒光強(qiáng)度和百分比；C.激光共聚焦顯微鏡觀察MWCNT-PEG-HH在細(xì)胞內(nèi)的分布情況(a.Cy5；b.MWCNT-PEG-HH-Cy5)

2.4 多壁碳納米管超聲造影劑的細(xì)胞毒性 我們采用CCK-8考察多壁碳納米管超聲造影劑的細(xì)胞毒性。從圖5可以看出，處理24 h、48 h后，多壁碳納米管超聲造影劑對SW1990細(xì)胞未見明顯毒性。只有當(dāng)碳納米管濃度達(dá)到300 μg/ml時(shí)，SW1990細(xì)胞活力在處理后48 h約降至80%，說明多壁碳納米管本身毒性較低。

圖5 CCK-8法考察不同濃度條件下MWCNT-PEG-HH對SW1990細(xì)胞的細(xì)胞毒性(n=3)

2.5 考察碳納米管超聲造影劑體外顯影情況 采用超聲造影儀考察碳納米管的體外造影能力。從圖6可以看出，PBS溶液在體外基本無顯影。而碳納米管溶液在10 μg/ml時(shí)，即出現(xiàn)顯影，當(dāng)濃度達(dá)到200 μg/ml時(shí)，可以看到顯影非常明顯，且MWCNT-PEG-HH和MWCNT-PEG無顯著差別。說明多壁碳納米管超聲造影劑在體外具有較好的顯影效果。

圖6 MWCNT-PEG-HH、MWCNT-PEG-HH在不同濃度條件下體外顯影圖注：A.MWCNT-PEG；B.MWCNT-PEG-HH

2.6 考察碳納米管超聲造影劑的體內(nèi)顯影 給藥前，分別用超聲造影儀記錄各組腫瘤、腎臟和心臟的顯影成像并記錄。如圖7所示，與未治療的小鼠相比，經(jīng)尾靜脈注射MWCNT-PEG-HH 8 h后，可以明顯觀察到超聲造影劑在腫瘤部位的增強(qiáng)作用，表明碳納米管超聲造影劑在體內(nèi)具有較高的超聲增強(qiáng)作用。與MWCNT-PEG-HH高US信號(hào)增強(qiáng)相反，MWCNT-PEG處理組的US成像僅觀察到輕微的增強(qiáng)。此外，腫瘤部位成像顯示峰谷效應(yīng)。隨著注入時(shí)間的增加，增強(qiáng)作用先增加，然后逐漸變?nèi)?，并且增?qiáng)作用可以維持很長時(shí)間，這可以為碳納米管的診斷和治療提供整合條件。

同時(shí)，我們研究了碳納米管在腎臟和心臟中的分布，以評估體內(nèi)的分布和代謝。如圖7所示，腎臟在1 h時(shí)可出現(xiàn)輕微的US信號(hào)增強(qiáng)，而在8 h時(shí)可出現(xiàn)較高的US信號(hào)增強(qiáng)，然后減弱，表明碳納米管具有腎臟代謝的特征。但是，在心臟中，各時(shí)間點(diǎn)，無論是二維模型還是CF模式，都沒有增強(qiáng)信號(hào)，表明碳納米管不會(huì)在心臟中積聚并產(chǎn)生毒性。

圖7 MWCNT-PEG-HH體內(nèi)顯影圖注：A.MWCNT-PEG在腫瘤組織中的顯影；B.MWCNT-PEG-HH在腫瘤組織中的顯影；C.MWCNT-PEG-HH在腎臟中的顯影；D.2D及CF模式下MWCNT-PEG-HH在心臟中的顯影

3 討論

在本研究中，我們通過酰胺化反應(yīng)合成了MWCNT-PEG-HH聚合物。在合成過程中，使用H2SO4和HNO3氧化MWCNT。細(xì)胞攝取結(jié)果表明，MWCNT-PEG-HH的細(xì)胞攝取效率明顯高于MWCNT-PEG，這可能是由于抗體的修飾所致。細(xì)胞毒性研究表明，MWCNT-PEG-HH和MWCNT-PEG具有高度的生物相容性。這可能是由于碳納米管的化學(xué)修飾增加了水溶性和生物相容性。本研究設(shè)計(jì)了用于腫瘤靶向成像的多壁碳納米管。PEG修飾可以增加水溶性和多壁碳納米管的穩(wěn)定性[22]。Hedgehog單克隆抗體被用作胰腺癌的特定靶標(biāo)。制備的MWCNT-PEG-HH具有良好的生物相容性，抗體的結(jié)合增強(qiáng)了細(xì)胞的攝取能力。在體外和體內(nèi)研究中，制備的納米靶標(biāo)造影劑具有巨大的潛力，可以作為靶向CE-EUS造影劑。

綜上所述，本研究選用PEG修飾多壁碳納米管得到納米級超聲造影劑，在表面連接Hedgehog單克隆抗體以實(shí)現(xiàn)胰腺癌的靶向性，體內(nèi)外評價(jià)表明其具有成為胰腺癌靶向的新型造影劑的潛力，后期我們將進(jìn)一步包裹難溶性化療藥物以實(shí)現(xiàn)診斷與治療的雙重目的。