黃芪甲苷對阿霉素腎病小鼠的保護作用及機制研究

于曉霞，鄭明楠，樸明姬，朱 虹，邊 艷，韓 帥，吳 華，高弼虎

0 引言

腎病綜合征是臨床上常見的腎臟疾病，常表現(xiàn)為低蛋白血癥、高脂血癥、大量蛋白尿等[1]，若未及時治療或治療不當，病情可進展為重度水腫、感染、血栓形成、急性腎損傷等嚴重并發(fā)癥，對患者正常生活及自身健康構成嚴重威脅，嚴重者會逐漸進展至終末期腎病[2]。因此，尋求有效的治療措施已成為臨床醫(yī)師關注的熱點。

腎病綜合征的共同特點是足細胞損傷，目前體內及體外多項實驗證實，中藥黃芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)具有減輕足細胞損傷的作用[3-4]。因此，本研究通過球后靜脈注射阿霉素(Adriamycin，ADR)的方法，建立經(jīng)典的腎病綜合征動物模型-阿霉素腎病(Adriamycin nephropathy，AN)小鼠模型[5]，并將中藥黃芪甲苷作用于阿霉素腎病小鼠，觀察其對小鼠尿蛋白、腎功能等生化指標的影響，并通過免疫組化技術檢測腎組織足細胞Nephrin、Desmin蛋白的表達，初步觀察黃芪甲苷對阿霉素腎病小鼠的保護作用，并探討可能的機制，為臨床治療腎病綜合征提供新的理論基礎和治療策略。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康無特定病原體(SPF)雄性BALB/c小鼠24只，體重(22.73±1.49)g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001。在大連大學附屬中山醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號：SYXK(遼)2018-0005。小鼠采用抽簽法隨機分為3組：對照組(8只)、模型組(8只)和黃芪甲苷組(8只)。實驗過程中動物自由攝食和飲水，動物實驗均依據(jù)《醫(yī)學實驗動物管理實施細則》的要求，按照動物福利與倫理原則處理。

1.2 藥物及試劑 阿霉素注射粉劑購自北京索萊寶科技有限公司，批號：D8740。異氟烷購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：B2028066。戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司，批號：P3761。尿白蛋白/肌酐(Albumin to creatinine，ACR)檢測試劑盒購自南京建成有限公司，批號：20190722。牛血清白蛋白購自北京索萊寶科技有限公司，批號：SA8130。兔抗小鼠Nephrin抗體(1∶1 000)購自Servicebio，批號：GB11081。兔抗小鼠Desmin抗體(1∶1 000)購自Servicebio，批號：GB11343。HRP山羊抗兔二抗(1∶200)購自Servicebio，批號：GB23302。DAB顯色液購自Servicebio，批號：G1211。

1.3 儀器 全自動生化分析儀：日本Olympus公司 AUA640；光學顯微鏡：日本Olympus公司 CX41；低溫離心機：德國Sigma公司(8K)；脫水機：武漢俊杰電子有限公司(JJ-12J)；包埋機：武漢俊杰電子有限公司(JB-P5)；病理切片機：上海徠卡儀器有限公司(RM2016)。

1.4 模型制備及給藥 模型組：小鼠異氟烷吸入麻醉后，經(jīng)眼球后靜脈注射阿霉素(10 mg/kg)建立實驗阿霉素腎病小鼠模型。造模后第1周測量小鼠ACR，如模型組與對照組相比，ACR差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)為造模成功。對照組：眼球后靜脈注射與阿霉素同等劑量的生理鹽水(10 ml/kg)。黃芪甲苷組：造模同模型組，造模后第2周開始，每日給予黃芪甲苷40 mg/(kg>·d)[3](用1%羧甲基纖維素鈉溶解)灌胃，共治療8周，對照組及模型組均給予含1%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水灌胃。

1.5 小鼠尿白蛋白/肌酐檢測 分別于小鼠造模前1 d(0周)及實驗第1周、第10周末收集尿液，低速低溫離心機中離心，去除沉渣，按試劑盒檢測說明，采用ELISA法測定小鼠尿白蛋白和肌酐，計算ACR。

1.6 生化指標檢測及方法 10周末，用3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后心臟穿刺采血，血液標本置于含抗凝劑EDTA的離心管中，離心取上清置于-20 ℃冰箱保存，使用全自動生化分析儀進行血清總蛋白(Total protein，TP)、白蛋白(Albumin，ALB)、肌酐(Serum creatinine，Scr)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、三酰甘油(Triglyceride，TG)的測定。

1.7 足細胞Nephrin、Desmin蛋白的檢測 免疫組化法檢測足細胞Nephrin、Desmin蛋白的表達：首先對所有切片進行脫蠟處理，切片經(jīng)過抗原修復后，PBS 清洗 3 min，共3次；在切片的組織上滴加 3% H2O2，以滅活內源性過氧化物酶，室溫避光放置 10 min；結束后 PBS 清洗3 min，共3次；按照抗體說明書稀釋一抗，滴加適量一抗稀釋液后，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，PBS清洗3 min，共3次，按抗體說明書滴加二抗，室溫孵育30 min；PBS 清洗3 min，共2次，DAB 顯色30 s后，蒸餾水終止反應。然后進行蘇木素襯染、鹽酸酒精分化、氨水返藍，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。結果判讀：蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。每張片子隨機選取10個腎小球，進行陽性細胞計數(shù)，計算平均值。

2 結果

2.1 小鼠的生存情況 小鼠于注射阿霉素1 d后，出現(xiàn)畏光、精神不振、毛質粗糙及脫毛、活動量減少、進食及飲水量下降，有不同程度的腹瀉，1周后上述情況逐漸恢復。模型組小鼠于造模后第2天死亡1只；黃芪甲苷組小鼠于造模后第3周死亡1只。其余小鼠均健康存活。

2.2 各組小鼠體重比較 模型組及黃芪甲苷組小鼠注射阿霉素后，平均體重迅速下降，至第1周末降至最低，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第2周開始兩組小鼠體重均逐漸增長，但模型組小鼠于第2、4、6周末測量體重仍明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，黃芪甲苷組小鼠體重增長速度略快，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 黃芪甲苷對阿霉素腎病小鼠ACR的影響 各組小鼠造模前ACR差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，造模后第1周末，模型組及黃芪甲苷組小鼠ACR較對照組明顯升高(P<0.001)，提示造模成功。實驗第10周末，與對照組相比，模型組小鼠ACR顯著增加(P<0.01)；黃芪甲苷治療后，小鼠ACR水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖2。

圖2 各組小鼠ACR比較注：*與對照組比較，P<0.001；#與模型組比較，P<0.001

2.4 黃芪甲苷對阿霉素腎病小鼠生化指標的影響 實驗第10周末，與對照組比較，模型組小鼠TP、ALB明顯降低，TC、TG、BUN及Scr均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪甲苷治療組ALB水平顯著升高(P<0.01)，TC、TG、BUN及Scr均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組小鼠生化指標比較結果注：*與對照組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.05；##與模型組比較，P<0.01

2.5 黃芪甲苷對小鼠足細胞Nephrin、Desmin蛋白的影響 與對照組比較，模型組小鼠腎臟組織足細胞Nephrin的表達明顯減少，Desmin蛋白的表達增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；經(jīng)黃芪甲苷治療后，Nephrin的表達較模型組顯著上調，Desmin蛋白的表達下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、圖5。

圖4 各組小鼠足細胞Nephrin、Desmin蛋白的表達情況(400×)注：紅色箭頭為陽性表達細胞

圖5 各組小鼠足細胞Nephrin、Desmin蛋白的表達情況注：*與對照組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.05

3 討論

腎病綜合征發(fā)病機制復雜，是一種常見的難以根治的腎臟疾病，其主要發(fā)病機制是腎小球基底膜通透性增加，導致腎小球濾過率降低，表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高脂血癥和水腫[6]。本研究采用眼球后靜脈叢注射阿霉素的方法復制阿霉素腎病模型以模擬人類腎病綜合征，結果顯示，小鼠尿蛋白、血肌酐及血脂水平顯著升高，血清白蛋白降低，證實成功建立了小鼠腎病綜合征模型。文獻報道，嚙齒類動物注射阿霉素后，藥物能迅速分布于腎臟組織引起腎損害[7]，主要機制：①阿霉素對足細胞有直接毒性作用，可導致足細胞相關蛋白分布以及細胞骨架發(fā)生紊亂，造成足細胞的形態(tài)學改變；②阿霉素含有醌式結構，可產生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細胞脂質過氧化反應，破壞腎小球濾過膜的完整性，導致膜濾過屏障病變而形成持續(xù)蛋白尿；③阿霉素能激活多種細胞因子及炎性介質，破壞腎臟固有細胞，促進系膜細胞增殖和系膜基質增多，誘導炎癥反應，緩慢發(fā)展形成腎小球硬化[8-11]。

蛋白尿是促進慢性腎臟病向終末期腎臟病進展的獨立危險因素，因此，控制蛋白尿是防治腎臟病進展的基礎。我國的傳統(tǒng)中藥黃芪具有補氣升陽、固表止汗、行水消腫和脫毒生肌等功效，自古廣泛應用于腎臟病的治療。孫成峰[12]對96例原發(fā)性腎病綜合征患者進行觀察，對照組患者口服強的松，觀察組患者在口服同等劑量強的松的基礎上聯(lián)合黃芪注射液，連續(xù)治療1個月后，兩組患者的24 h尿蛋白定量均明顯降低，血漿白蛋白明顯增多，并且觀察組患者上述各項指標改善效果均顯著優(yōu)于對照組。Zhang等[13]通過Meta分析研究了黃芪單體或其提取物對慢性腎臟病患者的治療作用，發(fā)現(xiàn)黃芪能夠有效降低患者肌酐清除率，提高血清白蛋白水平。上述結果提示，黃芪可明顯改善原發(fā)性腎病綜合征及慢性腎臟病患者的尿蛋白、血漿白蛋白等指標水平，具有腎臟保護作用。黃芪甲苷是黃芪最主要的藥理活性成分之一，本研究中，給予阿霉素腎病小鼠黃芪甲苷治療后，與模型組小鼠比較，治療組小鼠的尿蛋白、血肌酐水平均顯著降低，且血白蛋白水平顯著升高，提示黃芪甲苷可有效降低阿霉素腎病小鼠的尿蛋白及血肌酐水平，升高血清白蛋白，發(fā)揮腎臟保護作用。

腎病綜合征患者伴有嚴重的血脂代謝異常，常表現(xiàn)為膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白水平升高等，而高脂血癥也是腎小球硬化發(fā)生發(fā)展的獨立致病因素，對腎病綜合征的進展有重要的影響，降脂治療也具有改善蛋白尿的作用[14]。余伍中等[15]發(fā)現(xiàn)，黃芪能夠通過增強脂蛋白酯酶與卵磷脂膽固醇?；D移酶活性，促進低密度脂蛋白的降解和膽固醇逆轉運，從而降低血三酰甘油和膽固醇水平，上調低密度脂蛋白受體mRNA表達，促進三酰甘油、膽固醇降解而從循環(huán)中清除。本研究觀察到黃芪甲苷可顯著降低阿霉素腎病小鼠的三酰甘油及膽固醇水平，與文獻報道一致。說明黃芪甲苷可通過降低阿霉素腎病小鼠的血脂水平發(fā)揮腎保護作用。

大量研究證實，蛋白尿的產生與腎臟足細胞的損傷密切相關。近年來，研究者先后確定了多個定位于足細胞的結構蛋白分子，如Nephrin、Desmin等，且均與蛋白尿的產生密切相關。在很多腎臟疾病中，足細胞上Nephrin和Desmin的表達失調早于足細胞超微結構病變和蛋白尿的發(fā)生[16]。研究認為，Nephrin表達下調和Desmin表達上調是足細胞損傷的標志[17-18]。在本研究中，模型組小鼠足細胞Nephrin表達明顯下降，Desmin表達量升高，與文獻報道一致；給予黃芪甲苷治療可顯著上調足細胞Nephrin表達，下調Desmin表達。證實黃芪甲苷可調控足細胞Nephrin和Desmin表達,從而減輕足細胞損傷，保護腎臟。

綜上所述，黃芪甲苷可通過調節(jié)足細胞Nephrin和Desmin蛋白的表達，降低阿霉素腎病小鼠尿蛋白、血肌酐及血脂水平，提高血白蛋白水平，從而發(fā)揮腎臟保護作用。