長鏈非編碼RNA LOC653786誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞抵抗吉西他濱的信號(hào)機(jī)制研究

徐俊燕，劉 峰，項(xiàng) 艷

0 引言

肺癌是常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著患者的身心健康[1]。由于肺癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)是中晚期[2]。隨著醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，當(dāng)前肺癌的治療方法已經(jīng)不局限于手術(shù)、化學(xué)治療和放射治療，還增加了靶向治療、免疫治療、消融治療等[3]。其中化學(xué)治療仍然是肺癌治療的主要方法之一，但獲得性耐藥的出現(xiàn)最終往往導(dǎo)致化學(xué)藥物治療失敗[4]。因此，如何攻克獲得性耐藥是臨床面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

吉西他濱為嘧啶類抗腫瘤藥物，主要通過抑制DNA合成，抑制細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，最終抑制腫瘤細(xì)胞生長[5]。目前，吉西他濱在臨床上可應(yīng)用于治療中晚期非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤[6]。由于吉西他濱具有廣譜抗腫瘤活性，在卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌及腎細(xì)胞癌的臨床治療中也具有一定療效[7]。但應(yīng)用一段時(shí)間后，腫瘤患者最終會(huì)對吉西他濱耐藥。而目前還沒有較好的方案解決吉西他濱耐藥，因此，需要更多的基礎(chǔ)理論依據(jù)為其提供支持。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是一類非編碼RNA，長度一般為200～100 000 nt[8]。近年來研究顯示，lncRNA在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如冠心病、糖尿病及惡性腫瘤等[9]。LncRNA LOC653786是lncRNA大家族的一員，研究顯示，LOC653786能調(diào)節(jié)腎細(xì)胞癌的增殖和周期進(jìn)展[10]。本研究通過構(gòu)建吉西他濱耐藥肺癌細(xì)胞，觀察LncRNA LOC653786 在其中的作用，并對其信號(hào)機(jī)制進(jìn)行研究，為臨床解決肺癌耐藥提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌A549細(xì)胞(南京科佰生物科技有限公司)；吉西他濱和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(美國Sigma Aldrich公司)；總蛋白提取試劑盒和蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)；MTT粉末(上海碧云天公司)；磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer solution，PBS)(美國Hyclone公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；LncRNA LOC653786和FOXM1小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染試劑盒(上海吉瑪公司)；叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(Forkhead frame transcription factor M1，F(xiàn)OXM1)抗體、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(Multidrug resistance associated protein1，MRP1)抗體和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)抗體(美國Santa Cruz公司)；GAPDH抗體和抗鼠IgG，HRP二抗(上海愛必信公司)。ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Multiskan FC 酶標(biāo)儀和EVOS M5000倒置顯微鏡(美國ThermoFisher公司)；OptimaTMXPN超速離心機(jī)(美國貝克曼公司產(chǎn)品)；AI600凝膠成像儀(美國GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配制 A549細(xì)胞培養(yǎng)體系為10% FBS、1%青霉素-鏈霉素和89% DMEM高糖培養(yǎng)基(即下文全培養(yǎng)基)。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為恒溫37 ℃、5% CO2及95%空氣的培養(yǎng)箱。吉西他濱以DMSO溶解，配制成200 μmol/L母液，分裝凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 A549/GR細(xì)胞的構(gòu)建 A549細(xì)胞生長至對數(shù)期后，以含有10 μmol/L吉西他濱全培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代2次，而后更換為正常全培養(yǎng)基并傳代2次。通過逐步增加吉西他濱濃度(每次增加10～30 μmol/L)重復(fù)進(jìn)行上述操作，最終獲得一株耐藥細(xì)胞A549/GR。通過MTT法計(jì)算A549/GR細(xì)胞耐藥指數(shù)。

1.2.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖能力 將所需細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期，以9×103個(gè)/孔傳代至96孔板中。次日，加入含梯度濃度(10、20、40、80、160和320 μmol/L)吉西他濱的全培養(yǎng)基150 μl處理48 h，同時(shí)以等量DMSO處理細(xì)胞作為對照組。處理結(jié)束后，每孔加入15 μl MTT，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，敲打培養(yǎng)板側(cè)壁30 s。在A490nm處測量各孔的吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 RT-qPCR法檢測細(xì)胞中LOC653786相對表達(dá)水平 所需細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，以Trizol法提取總RNA。于酶標(biāo)儀上檢測總RNA濃度，將總RNA稀釋至500 ng/μl。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于酶標(biāo)儀上檢測cDNA濃度。稀釋LOC653786和內(nèi)參GAPDH引物，按RT-qPCR試劑盒說明書依次加入引物、cDNA和反應(yīng)試劑，進(jìn)行RT-qPCR檢測。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min 1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 2s、60 ℃ 30s、70 ℃ 5s 40個(gè)循環(huán)。LOC653786正向引物：GGAAAAGGCAACAGATGTCCA，LOC653786 反向引物：GGAAGCTGCTTGCAGAAGGAT；GAPDH正向引物：TGTGGGCATCAATGGATTTGG，GAPDH反向引物：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。

1.2.5 siRNA轉(zhuǎn)染沉默LOC653786或FOXM1表達(dá) 將A549/GR 細(xì)胞分別設(shè)為未轉(zhuǎn)染組(Control)、轉(zhuǎn)染對照組(NC)和LOC653786沉默組(LOC653786 si)。將對數(shù)期A549/GR 細(xì)胞以5×105接種于6孔板中。次日按試劑盒說明書制備Lipofectamine 2000和siRNA混合液(LOC653786 siRNA和對照siRNA)靜置10 min。LOC653786 si組以Lipofectamine 2000和LOC653786 siRNA(60 pmol/ml)處理，NC組以Lipofectamine 2000和對照siRNA處理(60 pmol/ml)處理，Control組以等體積培養(yǎng)基處理。轉(zhuǎn)染24 h后更換全培養(yǎng)基。以熒光顯微鏡觀察siRNA進(jìn)入細(xì)胞情況，RT-qPCR驗(yàn)證LOC653786沉默效果。

將A549/GR 細(xì)胞分別設(shè)為未轉(zhuǎn)染組(Control)、轉(zhuǎn)染對照組(NC)和FOXM1沉默組(FOXM1 si)。按上文轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。以熒光顯微鏡觀察siRNA進(jìn)入細(xì)胞情況，蛋白印記實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證FOXM1沉默效果。

1.2.6 蛋白印跡檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞按要求處理后,采用RIPA裂解液(含1 mM蛋白酶抑制劑)提取總蛋白?？偟鞍淄ㄟ^BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，并以蛋白上樣緩沖液制備含3 μg/μl總蛋白的蛋白樣品。通過SDS-PAGE電泳將蛋白樣品中不同分子量的蛋白分離，而后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將載有蛋白質(zhì)的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉4 h。裁剪PVDF膜，將對應(yīng)膜以FOXM1抗體(1∶500)、MRP1抗體(1∶1 000)或P-gp抗體(1∶1 000)在4 ℃ 孵育過夜。次日TBST洗膜后加入抗鼠IgG，HRP二抗(1∶4 000)孵育1 h，TBST洗膜后，以ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在AI600凝膠成像儀下成像，對蛋白條帶進(jìn)行處理和分析。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將處理好的細(xì)胞收集于5 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。3 ml PBS吹打細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞。各加入5 μl Annexin V-FITC混勻，再加入5 μl PI混勻。室溫避光孵育10 min,于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

2 結(jié)果

2.1 A549/GR細(xì)胞對吉西他濱的耐藥檢測 MTT結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，10、20、40、80、160和320 μmol/L吉西他濱對A549/GR細(xì)胞的抑制率均顯著下降(P<0.05或P<0.01)，見表1。吉西他濱對A549和A549/GR細(xì)胞的IC50分別為32.3 μmol/L和192.3 μmol/L，A549/GR的耐藥指數(shù)為6.0。

表1 吉西他濱對A549和A549/GR細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 LncRNA LOC653786在A549/GR細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于A549細(xì)胞，A549/GR細(xì)胞LncRNA LOC653786表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖1。

圖1 A549和A549/GR細(xì)胞LncRNA LOC653786表達(dá)水平注：**與A549細(xì)胞比較，P<0.01

2.3 FOXM1、MRP1和P-gp蛋白在A549/GR細(xì)胞中表達(dá)上調(diào) 蛋白印記結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/GR細(xì)胞FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.01)。見圖2。

圖2 A549和A549/GR細(xì)胞中FOXM1、MRP1和

2.4 沉默LOC653786表達(dá)抑制A549/GR細(xì)胞FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表達(dá)上調(diào) NC組和LOC653786 si組A549/GR細(xì)胞轉(zhuǎn)染后均顯示綠色熒光，見圖3A。與NC組相比，LOC653786 si組LOC653786表達(dá)顯著降低(P<0.01)，見圖3B。蛋白印記結(jié)果顯示，相較于NC組，LOC653786 si組FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖3C-3D。

圖3 沉默LOC653786表達(dá)對A549/GR細(xì)胞MRP1和P-gp蛋白表達(dá)的影響注：**與 NC 組比較，P<0.01

2.5 沉默F(xiàn)OXM1抑制A549/GR細(xì)胞MRP1和P-gp蛋白表達(dá)上調(diào) 轉(zhuǎn)染法沉默A549/GR細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)，如圖4所示，NC組和FOXM1 si組成功進(jìn)行轉(zhuǎn)染，均顯示綠色熒光。蛋白印記結(jié)果顯示，與NC組相比，F(xiàn)OXM1 si組FOXM1、MRP1和P-gp蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。RT-qPCR結(jié)果顯示，NC組和FOXM1 si組LOC653786表達(dá)無明顯差異。

圖4 沉默F(xiàn)OXM1對A549/GR細(xì)胞MRP1和P-gp蛋白以及LOC653786表達(dá)的影響注：**與NC組比較，P<0.01

2.6 各組A549/GR細(xì)胞對吉西他濱的敏感性 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，吉西他濱處理能一定程度誘導(dǎo)NC組細(xì)胞凋亡，但作用并不明顯。而沉默LOC653786或FOXM1后，吉西他濱均能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加(P<0.01)見圖5A-C。

3 討論

早期研究認(rèn)為，LncRNA是基因組轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具備生物學(xué)作用[11]。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA廣泛參與染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種生物學(xué)調(diào)控，并且在心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮一定作用[12-13]。越來越多的研究顯示，LncRNA在包括肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。一些LncRNA還參與惡性腫瘤的耐藥形成[15]。本研究構(gòu)建了吉西他濱耐藥肺癌細(xì)胞A549/GR，耐藥指數(shù)為6.0。分子水平上發(fā)現(xiàn)，A549/GR細(xì)胞MRP1和P-gp蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。研究報(bào)道，MRP1和P-gp蛋白能夠介導(dǎo)耐藥，并在多種耐藥腫瘤中表達(dá)升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較A549細(xì)胞，A549/GR細(xì)胞LncRNA LOC653786表達(dá)明顯上調(diào)。提示LOC653786可能與A549/GR細(xì)胞吉西他濱耐藥有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1蛋白表達(dá)在A549/GR細(xì)胞中顯著上調(diào)。FOXM1是調(diào)控有絲分裂進(jìn)程的重要的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用[17]。研究顯示，LncRNA LOC653786可通過FOXM1蛋白介導(dǎo)腎細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[10]。提示FOXM1是LncRNA LOC653786的下游信號(hào)靶點(diǎn)。還有研究顯示，F(xiàn)OXM1參與膠質(zhì)瘤、骨肉瘤等惡性腫瘤的化療耐藥[18-19]。這些提示在本研究中，LncRNA LOC653786可能通過FOXM1蛋白介導(dǎo)MRP1和P-gp蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)A549/GR細(xì)胞吉西他濱耐藥。

為進(jìn)一步驗(yàn)證，本研究采用siRNA干擾技術(shù)干擾LncRNA LOC653786表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾LOC653786表達(dá)能明顯下調(diào)A549/GR細(xì)胞FOXM1蛋白表達(dá)，提示LncRNA LOC653786能介導(dǎo)FOXM1蛋白表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，干擾LncRNA LOC653786或FOXM1表達(dá)均可下調(diào)A549/GR細(xì)胞MRP1和P-gp蛋白表達(dá)，提示在A549/GR細(xì)胞中，高水平的LncRNA LOC653786可通過上調(diào)FOXM1蛋白表達(dá)而介導(dǎo)MRP1和P-gp蛋白表達(dá)升高。通過流式細(xì)胞儀檢測吉西他濱對A549/GR細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，干擾LncRNA LOC653786或FOXM1表達(dá)均可增強(qiáng)吉西他濱誘導(dǎo)的A549/GR細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LncRNA LOC653786與肺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥有關(guān)。LncRNA LOC653786能介導(dǎo)FOXM1蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)MRP1和P-gp蛋白表達(dá)上調(diào)，最終參與吉西他濱耐藥。本研究揭示了LncRNA LOC653786介導(dǎo)肺癌細(xì)胞耐藥的潛在機(jī)制，可為臨床治療肺癌耐藥提供理論依據(jù)。但LOC653786在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。