伊馬替尼通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化改善蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷

韓雨薇，王晨辰，李曉明

0 引言

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種致死率高、預(yù)后差、嚴(yán)重威脅生命的腦血管疾病[1]。SAH占所有卒中亞型的5%，其中動脈瘤破裂是引起蛛網(wǎng)膜下腔出血患者死亡的主要原因。盡管有早期影像診斷和手術(shù)治療，但SAH的高死亡率和不良預(yù)后仍導(dǎo)致很大的社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[2]。神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是SAH后早期腦損傷(Early brain injury,EBI)的主要病理過程之一[3]。腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞/星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和外周免疫細(xì)胞浸潤釋放出大量的促炎細(xì)胞因子，從而放大炎癥反應(yīng)，進一步加重神經(jīng)功能缺損。因此，針對神經(jīng)炎癥的治療策略對于減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷和改善神經(jīng)學(xué)預(yù)后將是切實可行的。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)是一種配體激活型核受體，PPARγ在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)以及保護細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激方面具有重要作用[4]。PPARγ激活劑伊馬替尼是一種被批準(zhǔn)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病和其他惡性腫瘤的抗癌藥物[5]。有研究表明，伊馬替尼能夠抑制Tenascin-C表達(dá)，改善大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣[6]。然而，伊馬替尼在SAH中的炎癥調(diào)節(jié)作用及其可能的機制仍未見報道。因此，本研究將討論伊馬替尼通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)保護SAH后早期腦損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與動物 伊馬替尼(諾華公司,規(guī)格：100 mg，批號：152459-95-5)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，PPARγ(美國Cell signaling technology公司)，iba-1 (美國Abcam公司)，IL-6 (美國Cell signaling technology公司)，TNF-α、IL-1β和β-actin (美國Santa Cruz Biotechnology公司)，BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及5×loading buffer (碧云天生物技術(shù)有限公司)，IL-1β、IL-6、和TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

SD雄性大鼠購自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心(沈陽)，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2014-0002。所有大鼠在固定灌注和手術(shù)前均處于麻醉狀態(tài)。

1.2 分組及給藥 大鼠隨機分為3組，每組32只，分別為：假手術(shù)組、模型組、伊馬替尼組。伊馬替尼在DMSO中溶解，注射前稀釋于生理鹽水中(DMSO終濃度為10%)。SAH模型制作30 min后，腹腔注射伊馬替尼50 mg/kg，給藥劑量參考之前研究[7]。

1.3 SAH大鼠模型建立 用改進的血管內(nèi)穿孔方法誘導(dǎo)大鼠實驗性SAH模型，如前所述[8]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉，仰臥位手術(shù)，頸部正中切開切口。在暴露左側(cè)頸動脈后，將3 cm長的銳化單絲尼龍線(4-0)插入頸外動脈，經(jīng)頸內(nèi)動脈向大腦前動脈和大腦中動脈分叉處推進，在此分叉處，再進一步輕微推進(3 mm)，造成出血。假手術(shù)組動物接受同樣的手術(shù)，但沒有動脈穿孔。手術(shù)后，大鼠被單獨安置在加熱板上。

1.4 SAH嚴(yán)重程度評分 每組8只大鼠，SAH造模24 h后取腦標(biāo)本，根據(jù)Sugawa評分標(biāo)準(zhǔn)[9]，將基底池分為6個節(jié)段，根據(jù)蛛網(wǎng)膜下腔出血量,將每個節(jié)段劃分為0～3級。0級：無蛛網(wǎng)膜下腔出血；1級：蛛網(wǎng)膜下腔微量出血；2級：中度凝塊；3級：血塊和可識別的動脈。將6個節(jié)段的分?jǐn)?shù)相加(總分0～18)，出血量越大分級越高。

1.5 神經(jīng)功能評分 SAH造模24 h后，根據(jù)Sugawa評分標(biāo)準(zhǔn)[9]，評估由6個測試組成：自發(fā)活動(0分：不活動；1分：僅可移動；2分：能觸壁，不到3面；3分：自由運動，觸到籠子至少3面)、四肢運動的對稱性(0分：肢體不能運動；1分：肢體極度無力，僅有輕微活動；2分：肢體無力，運動遲緩；3分：四肢對稱，與正常無差異)、前爪伸展(0分：無動作；1分：僅有輕度伸展；2分：較正常差；3分：同SAH前)、攀登(1分：不能攀爬，滾下；2分：攀爬困難；3分：爬行容易，抓籠有力)、身體本體感覺(1分：無反應(yīng)；2分：僅有輕微反應(yīng)；3分：迅速轉(zhuǎn)頭，對側(cè)對稱)、對胡須刺激的反應(yīng)(1分：無反應(yīng)；2分：輕微反應(yīng)；3分：雙側(cè)對稱反應(yīng))。最高分為18分，最低分為3分，分?jǐn)?shù)越高，功能越強。

1.6 方法

1.6.1 腦水腫含量測定 每組8只大鼠，造模24 h后處死取大腦，分為左右大腦半球和小腦，稱濕重。然后將腦標(biāo)本在110 ℃的烤箱中烘干72 h，并再次稱重(干重)。腦含水量按以下公式計算：腦含水量(%) =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6.2 Evans blue滲透率測定 每組8只，將Evans blue染料(2%，5 ml/kg)注入左股靜脈循環(huán)1 h，麻醉后用生理鹽水心內(nèi)灌注處死大鼠并取腦，分為左右大腦半球和小腦，稱重后浸泡在甲酰胺中(10 ml/g)，60 ℃孵育，用分光光度計測量滲出物在620 nm處的吸光度。

1.6.3 Western blot分析 Western blot分析和ELISA檢測共用8只/組。鼠腦蛋白樣品在RIPA緩沖液中提取，在4 ℃轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心15 min。收集上清液，BCA試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后，用下列一抗在4 ℃下封閉膜并孵育過夜：PPARγ (1∶400)、IL-6 (1∶400)、TNF-α (1∶400)、iba-1 (1∶500)，β-actin (1∶800)。將對應(yīng)的二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h，用ECL試劑顯示特異性條帶。用ImageJ軟件分析免疫印跡帶的相對密度。

1.6.4 ELISA檢測 每組8只，根據(jù)南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒說明書檢測蛋白樣品中IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度。

1.6.5 免疫熒光染色 免疫熒光染色和TUNEL染色共用8只/組。造模24 h后快速取出大鼠腦組織，用PBS洗滌2次，固定在4%甲醛溶液中24 h，分別用iba1(1∶50) 4 ℃孵育過夜。熒光二抗1∶100稀釋，室溫孵育1 h。熒光顯微鏡(Nikon)拍照。

1.6.6 TUNEL染色 用TUNEL染色試劑盒檢測凋亡細(xì)胞，方法參考說明書。

2 結(jié)果

2.1 伊馬替尼對SAH評分、神經(jīng)功能評分和血腦屏障的影響 與假手術(shù)組相比，SAH模型組SAH評分增加(圖1A)，神經(jīng)功能評分降低(圖1B)，腦水腫含量增加(圖1C)，Evans blue滲出量增加(圖1D)。然而，伊馬替尼給藥后能夠降低SAH評分，提高神經(jīng)功能評分，減少腦水腫含量，降低Evans blue滲出量。提示伊馬替尼能夠顯著減少SAH后腦出血量，提高神經(jīng)功能，減輕血腦屏障破壞程度。

圖1 伊馬替尼對SAH分級、神經(jīng)功能評分、腦水腫和滲出的影響注：##與假手術(shù)組相比，P<0.01；**與模型組相比，P<0.01

2.2 伊馬替尼對蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥反應(yīng)的影響 與假手術(shù)組相比，SAH模型組PPARγ表達(dá)量無顯著變化，而伊馬替尼能夠顯著增加PPARγ的表達(dá)(圖2A)。與假手術(shù)組相比，SAH模型組IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)量增加，伊馬替尼能夠抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)(圖2B-2E)。ELISA結(jié)果同樣表明，伊馬替尼能夠顯著減少IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平(圖2F-2H)。

圖2 伊馬替尼對PPARγ、IL-6、IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響注：Western blot蛋白條帶(A)，PPAR蛋白表達(dá)量統(tǒng)計圖(B)，IL-1β 蛋白表達(dá)量統(tǒng)計圖(C)，IL-6 蛋白表達(dá)量統(tǒng)計圖(D)，TNF-α蛋白表達(dá)量統(tǒng)計圖(E)，IL-1β蛋白水平(F)，IL-6蛋白水平(G)，TNF-α蛋白水平(H)。##與假手術(shù)組相比，P<0.01；**與模型組相比，P<0.01

2.3 伊馬替尼對蛛網(wǎng)膜下腔出血后小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，SAH模型組小膠質(zhì)細(xì)胞(iba-1)表達(dá)量增加，伊馬替尼降低iba-1的蛋白表達(dá)量。免疫熒光結(jié)果顯示，SAH模型組小膠質(zhì)細(xì)胞激活，而伊馬替尼能夠顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化(圖3)。

圖3 伊馬替尼對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響(400×)注：紅色為iba-1，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物；藍(lán)色為DAPI，細(xì)胞核標(biāo)記物。##與假手術(shù)組相比，P<0.01；**與模型組相比，P<0.01

2.4 伊馬替尼對蛛網(wǎng)膜下腔出血后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響 如圖4所示，熒光染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，蛛網(wǎng)膜下腔出血組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，而伊馬替尼能夠減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)，有效抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

圖4 伊馬替尼對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響(400×)注：綠色為TUNEL，凋亡標(biāo)記物；紅色為NeuN，神經(jīng)元標(biāo)記物；藍(lán)色為DAPI，細(xì)胞核標(biāo)記物。##與假手術(shù)組相比，P<0.01；**與模型組相比，P<0.01

3 討論

伊馬替尼是一種被批準(zhǔn)用于治療慢性粒細(xì)胞白血病和其他惡性腫瘤的抗癌藥物[5]。伊馬替尼抑制多種酪氨酸激酶，包括血小板衍生生長因子受體(Platelet-derived growth factor receptors α,PDGFR-α)，并且可以減輕缺血性卒中和開始纖溶酶原激活劑治療后的腦水腫[10]。此外，伊馬替尼抑制PDGFR-α，在腦出血小鼠模型中保存了血腦屏障的完整性[8]。

在本研究中，伊馬替尼對大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷具有保護作用，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減輕炎癥反應(yīng)抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，其潛在的機制可能與PPAR-γ激活相關(guān)。

炎癥在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中起重要作用[11]。小膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥的主要來源，因此，我們檢測了伊馬替尼對小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。結(jié)果顯示，伊馬替尼抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少早期腦損傷激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。有研究表明，在蛛網(wǎng)膜下腔出血早期和晚期中，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)依賴的凋亡[12]。因此，蛛網(wǎng)膜下腔出血中的抗凋亡作用可能是通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活來實現(xiàn)的。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞激活影響細(xì)胞凋亡的確切機制還有待進一步研究。具有吞噬功能的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，一般稱為小膠質(zhì)細(xì)胞，是腦內(nèi)一種特有的免疫細(xì)胞[13]。SAH后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α，誘發(fā)周圍細(xì)胞凋亡[14]。

本研究結(jié)果表明，伊馬替尼可改善SAH后的神經(jīng)行為，減輕腦水腫，抑制SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。伊馬替尼能顯著增加PPARγ的表達(dá)，降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。表明伊馬替尼可能通過PPARγ抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化途徑減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的神經(jīng)炎癥,從而對蛛網(wǎng)膜下腔出血后的EBI有保護作用。