藍(lán)莓及其提取物中花青素檢測方法的研究

陳子凡，董 瑩，何思東，劉 康，吳麗娟，黃 浩

1.河源市食品檢驗(yàn)所 (河源 517000) 2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心 (廣州 510700) 3.河源市工業(yè)和信息化局 (河源 517000) 4.河源海關(guān) (河源 517000)

藍(lán)莓含有兒茶素、綠原酸、花青素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，具有抗癌、保護(hù)心血管、保護(hù)肝臟、預(yù)防近視等作用[2-4]。從2003年起至今，以藍(lán)莓為原輔料登記保健食品有98種，配方中的功效物質(zhì)均以花青素為主，隨著藍(lán)莓花青素的保健功效被群眾所日漸認(rèn)可，藍(lán)莓產(chǎn)品的市場會越來越廣闊[5-6]。本文通過查找和收集國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對藍(lán)莓花青素檢測技術(shù)的發(fā)展和現(xiàn)狀進(jìn)行分析，為藍(lán)莓中花青素檢測技術(shù)的開發(fā)和制標(biāo)提供參考。

1 藍(lán)莓花青素成分概述

花青素，屬于水溶性植物色素，基本結(jié)構(gòu)為黃鎓鹽陽離子結(jié)合物。藍(lán)莓主要含有矢車菊素、飛燕草素、錦葵素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥素6種[7]，但由于結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，花青素在藍(lán)莓中以糖苷類物質(zhì)存在[8]，這些糖苷類物質(zhì)通常由花青素和1個或多個葡萄糖、蕓香糖等糖結(jié)合而成[9]。

2 檢測技術(shù)的研究

藍(lán)莓花青素檢測方法主要有pH值示差法、分光法、色譜法、質(zhì)譜法。其中pH值示差法、分光法只能檢測花青素總含量，色譜法可測定花青素類物質(zhì)的種類和含量，而質(zhì)譜法則可以檢測到花青素糖苷的種類和含量。本文也列舉兩種類似藍(lán)莓產(chǎn)品檢測花青素的質(zhì)譜方法作為參考。

2.1 pH值示差法

pH值示差法采用光度計(jì)于510 nm和710 nm處檢測吸光值，計(jì)算可得花青素的總含量，具有操作簡便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

張榮菲等[10]通過正交試驗(yàn)，分析了60%乙醇中鹽酸含量、超聲提取時(shí)間、料液比和超聲提取水浴溫度，發(fā)現(xiàn)60%的乙醇-0.2%鹽酸溶液對藍(lán)莓果實(shí)中花青素提取效果影響最大，在該提取條件下使用pH值示差法檢測藍(lán)莓果實(shí)中的花青素，測得藍(lán)莓果實(shí)的花青素含量為1.91 mg/g。葉紅玲等[11]通過正交試驗(yàn)，確定提取藍(lán)莓果渣中花青素的最佳工藝條件是選用pH值2.5的70%乙醇水溶液、超聲波功率200 W下每提取2 s停4 s的間歇，料液比(g/mL)1∶30、30 ℃超聲20 min，最終測得果渣的花青素含量為9.99 mg/g。張星[12]等采用1 mL藍(lán)莓試供液分別與9 mL pH 1.0的KCl緩沖液和9 mL pH 4.5的NaAc緩沖液混合，靜置15 min后檢測510 nm和700 nm下的吸光度，并以蒸餾水為空白，測得藍(lán)莓提取液中花青素含量為160.30 mg/100 g。

2.2 分光法

分光法是在520～540 nm波長之間進(jìn)行掃描，獲得特征峰，利用標(biāo)準(zhǔn)對照品確定花青素的百分比含量。T/CCCMHPIE 1.25-2016中[13]，稱取15～20 mg越橘提取物樣品用60 mL 2%鹽酸-甲醇溶液在80 ℃水浴中回流水解0.5 h，然后過濾，以2%鹽酸-甲醇作空白，在540 nm吸收波長下對花青素進(jìn)行檢測。該方法測得花青素含量以飛燕草素計(jì)，數(shù)值以百分比含量%表示。

曾榮華等[14]參照T/CCCMHPIE 1.25—2016，稱取樣品50 mg，加入30 mL 2%鹽酸甲醇溶液進(jìn)行超聲提取，冷卻后用2%鹽酸甲醇溶液定容，稀釋后以2%鹽酸甲醇溶液作為空白，在540 nm處測量吸光度，測得藍(lán)莓樣液的花青素含量為25.4%。

2.3 色譜法(LC)

LC法是在加溫下將花青素苷類物質(zhì)轉(zhuǎn)變成花青素，使用紫外檢測器或二極管陣列檢測器檢測可測得花青素的種類和含量。

NY/T 2640—2014標(biāo)準(zhǔn)，取勻漿后的藍(lán)莓樣品1～10 g，用25%鹽酸-乙醇水溶液定容至50 mL，超聲提取30 min后于沸水浴中水解1 h，靜置后取上清液過0.45 μm水相濾膜，使用UV或DAD檢測器檢測，該方法的檢出限在0.15～1.50 mg/kg之間[15]。

T/CCCMHPIE 1.25—2016中[13]，稱取125 mg樣品加入25 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇溶液定容，移取溶液用10%磷酸水溶液定容，過0.45 μm濾膜后在高效液相色譜上用外標(biāo)法定量。

陳海龍等[16]考慮到藍(lán)莓花青素常用的萃取液為有毒的甲醇和乙醇，研究使用食用有機(jī)酸作為提取溶劑。稱取2 g打漿藍(lán)莓，加入30%檸檬酸溶液，超聲30 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.45 μm有機(jī)膜，利用高效液相色譜法檢測，該方法的精密度RSD為1.36%，最低檢出限為0.06 mg/kg，加標(biāo)回收率為98.28%。

王歡等[17]通過對檢測波長、水解溫度、水解時(shí)間的研究，采用了稱取1～5 g樣品，用鹽酸-乙醇-水(1∶2∶1)提取液定容至25 mL，超聲提取30 min，然后在120 ℃烘箱中水解60 min，再統(tǒng)一采用HPLC在525 nm檢測波長處對6種花青素進(jìn)行檢測。該方法的花青素回收率在80.50%～108.80%。

王馨悅[18]將樣品粉碎勻漿后，以1∶10的料液比加入52%乙醇，以469 W微波提取4 min，提取液于3 500 r/min離心5 min后取上清液減壓濃縮，冷凍干燥后制成浸膏備用。檢測時(shí)，用純凈水復(fù)溶稀釋后過0.45 μm水相濾膜上機(jī)測試。該方法的共有峰面積RSD值為1.12%～2.62%，保留時(shí)間RSD值為0.14%～0.31%。

Matthew Hynes[19]等使用30 mL的乙腈-0.3%磷酸水溶液(80∶20)作為萃取液，將0.3 g藍(lán)莓均質(zhì)1.5 min，最后以2 500 r/min離心10 min，取2 mL上清液和200 μL濃鹽酸混合，放入具有自封隔膜的玻璃瓶中，渦旋后放入150 ℃的烘箱中水解30 min。30 min后，取出玻璃瓶放入0℃的冰箱中10 min，以停止水解。從冰箱取出樣品后，恢復(fù)至室溫，立即過0.45 μm濾膜，上機(jī)分析。結(jié)果顯示曲線R2值在0.988～0.992之間，6種花青素能在2分鐘能完全出峰。

Pranathi[20]等稱取0.125 g樣品，采用了1 mL的2%甲酸-甲醇溶液作為提取液，旋渦攪拌溶解，再加入4 mL 10%磷酸溶液，分析前，使用0.2 μm醋酸纖維素濾膜過濾樣品。結(jié)果顯示曲線R2值在0.999 1～0.999 8之間，檢測低限在0.10～1.56 μg/mL之間。

2.4 質(zhì)譜法(MS)

采用MS法無需將花青素糖苷水解和提純等前處理，降低了花青素的損失，可以測得花青素苷類物質(zhì)種類及含量。

韓雪[21]等稱取2 g藍(lán)莓果泥，按1∶15(g/mL)加入50%甲醇水，在80 ℃下回流提取1 h，將提取液于8 000 r/min下離心10 min，上清液用0.25 μm濾膜過濾，使用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOFMS)分析，在6種藍(lán)莓果實(shí)中鑒定出13種的花青素糖苷。

島津企業(yè)管理(中國)有限公司-分析中心[22]采用稱取10 g樣品用20 mL 80%甲醇溶液超聲提取15 min、9 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取2次，合并定容至50 mL，過0.22 μm膜后使用三重四極桿質(zhì)譜儀(QQQ)檢測花青素苷含量，該方法在0.1～2.0 mg/kg范圍內(nèi)建立校準(zhǔn)曲線，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.69%～5.13%之間，花青素苷的最低檢出限量在0.000 3～0.028 9 μg/mL。

張協(xié)光[23]等稱取1 g粉碎后的樣品用5%甲酸-甲醇溶液定容，超聲提取30 min，再次定容后離心，過0.22 μm濾膜后上線性離子阱質(zhì)譜儀(LITMS)檢測，建立了可以同時(shí)6種花青素苷和6種花青素的方法，結(jié)果表明在0.042 4～19.9 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，回收率為61.9%～112.7%，方法的檢出限在1.73～8.10 ng/mL。

2.5 其它方法

本次研究也發(fā)現(xiàn)類似藍(lán)莓的產(chǎn)品采用了一些可供參考的質(zhì)譜方法，這些方法可以快速檢測花青素苷類物質(zhì)的含量，前處理更為簡便快捷。

夏碧琪[24]等采用親水作用色譜(HILIC)串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測葡萄酒中的4種花青素，葡萄酒試供品用甲醇稀釋1 000倍后，無需其他前處理，過0.22 μm濾膜后，上機(jī)分析。該方法的線性范圍在1.0～50.0 ng/mL間，R值高于0.999 2，方法定量限為0.05～1.00 ng/mL。

王海敬[25]等采用甲酸-甲醇(1∶9)溶液為溶劑，加入內(nèi)標(biāo)物后進(jìn)行液液萃取，在4 ℃條件下提取12 h后，4 000 r/min離心取上清液上機(jī)，使用四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(QTOF)對番茄提取物進(jìn)行檢測，同時(shí)檢測12種花青素，在線性范圍在1～1 000 μg/mL，定量限<1 μg/mL。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，pH值示差法和分光法，主要適用于花青素的總量檢測，廣泛應(yīng)用于藍(lán)莓和藍(lán)莓產(chǎn)品的質(zhì)量鑒別、藍(lán)莓花青素含量的快速檢測。液相色譜法可以對藍(lán)莓的花青素種類進(jìn)行定性和定量，有助于分析藍(lán)莓產(chǎn)品在花青素的分離提純時(shí)效果各種花青素在抗氧化效果方面的所起的作用和原理。質(zhì)譜儀法則直接檢測藍(lán)莓中的花青素的糖苷物質(zhì)。為選育藍(lán)莓品種提供參考，揭示花青素苷在藥品中構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制，以及花青素提取制備過程對天然色素結(jié)構(gòu)特征和功能活性的影響。隨著花青素檢測技術(shù)的發(fā)展，建立藍(lán)莓及其提取物中花青素和花青素苷的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，對提高藍(lán)莓產(chǎn)品質(zhì)量、保障消費(fèi)者購買花青素產(chǎn)品質(zhì)量、提高食品監(jiān)管部門的檢測能力都有重要意義。