慢性束縛應(yīng)激對小鼠小腸屏障的損傷研究

孫忠鑫，柴露露，劉秋宏，張塵龍，劉舜星，李慧，林如濤

貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025

應(yīng)激是機體在不良條件下做出的生理反應(yīng),根據(jù)應(yīng)激持續(xù)時間長短可分為慢性應(yīng)激和急性應(yīng)激.慢性應(yīng)激是機體長時間受到不良因素刺激,打破機體原有穩(wěn)態(tài)平衡后出現(xiàn)的一系列異常反應(yīng).在畜禽養(yǎng)殖中慢性應(yīng)激誘發(fā)機體功能紊亂,導(dǎo)致機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化能力下降、飼料轉(zhuǎn)化率降低和生長緩慢,從而造成動物經(jīng)濟效益降低,給養(yǎng)殖業(yè)帶來不利影響．

機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收主要由小腸負責(zé),食物在小腸的加工處理下大部分營養(yǎng)物質(zhì)被吸收進入血液,運輸至身體各部位,而大腸負責(zé)吸收剩余的水分和無機鹽等微量物質(zhì)[1].在生理條件下,腸屏障選擇性參與保護身體免受外部環(huán)境病原體和有害成分滲透之間的正確平衡.營養(yǎng)物質(zhì)的選擇性吸收是通過細胞間或跨細胞運輸實現(xiàn)的,而有害物質(zhì)和廢物則通過糞便從胃腸道排出[2].腸道健康包括完整的絨毛結(jié)構(gòu)和腸上皮屏障,發(fā)育良好的腸絨毛組織結(jié)構(gòu)促進營養(yǎng)吸收[3].腸屏障的完整性部分是由一組完整的細胞蛋白、緊密連接復(fù)合物、細胞骨架微管和細絲賦予的,它們維持上皮細胞之間牢固的細胞連接,提供機械屏障保護機體,選擇性通過對機體有利的物質(zhì)[4-5].前人研究發(fā)現(xiàn),慢性應(yīng)激會破壞機體腸黏膜屏障,使腸黏膜屏障上皮細胞間緊密連接蛋白表達水平下降、黏膜上皮間杯狀細胞數(shù)量減少、基底層細胞增殖變慢等[6].Siddiqui等[7]研究發(fā)現(xiàn)在慢性應(yīng)激下禽類腸道會發(fā)生損傷,小腸絨毛受損脫落、通透性增加.與此同時,相關(guān)研究表明慢性應(yīng)激也會致使機體炎癥水平上升[8].在雞慢性熱應(yīng)激和盲腸菌群結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的高密度、熱應(yīng)激、外傷、傳染病及菌群結(jié)構(gòu)變化等不可預(yù)知慢性條件長期刺激下,對畜禽健康及經(jīng)濟效益都有嚴重影響[9-11].已有研究表明,慢性不可預(yù)測應(yīng)激導(dǎo)致肉雞屏障功能破壞,表現(xiàn)為通透性增加、促炎細胞因子mRNA水平升高、緊密連接蛋白豐度降低和黏膜分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA)減少[12]．

屏障受損會導(dǎo)致腸道滲漏,使管腔內(nèi)的微生物產(chǎn)物和毒素侵入固有層甚至體循環(huán),并激活炎癥免疫反應(yīng),引起炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)[13].腸黏膜是免疫的第一道屏障,防御病原菌在腸道黏附和定植[14].因此,保持腸道屏障完整性和維護腸屏障功能正常,對畜禽健康意義重大.由于慢性應(yīng)激致腸道屏障損傷機理仍不清楚,因此研究慢性應(yīng)力損傷機理,尋找有效緩解措施尤為重要．

本研究以小鼠為研究對象,參考廖莎等[15]的實驗構(gòu)建慢性應(yīng)激模型,通過組織化學(xué)染色、免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)等技術(shù),研究慢性應(yīng)激對小鼠生長發(fā)育、激素水平、屏障損傷和自我更新等過程的影響,揭示畜禽養(yǎng)殖過程中慢性應(yīng)激對機體產(chǎn)生的有害作用,闡明慢性應(yīng)激對小腸屏障完整性破壞的機制,為養(yǎng)殖人員在養(yǎng)殖業(yè)中減少慢性應(yīng)激,提高經(jīng)濟效益,實現(xiàn)健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

去甲腎上腺素(NE)、皮質(zhì)醇ELISA檢測試劑盒購于武漢云克隆生物有限公司(貨號: CEA907Ge、(CEA540Ge); MDA,T-AOC,CAT,SOD,PAS染色液購于北京索萊寶生物有限公司(貨號: BC0025,BC1315,BC0205,BC0175,G1281); GSH-Px購于南京建成生物有限公司(貨號: A001-3-2); 蘇木素-伊紅染色液(HE)購于白鯊生物有限公司(貨號: BL700B); 兔抗PCNA購于沈陽萬類生物有限公司(貨號: WL03213); 兔抗ZO-1購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(貨號: 21773-1-AP); TUNEL免疫熒光試劑盒購于賽維爾生物有限公司(貨號: G1502-50T); UltraSensitiveTM SP(鼠/兔)IHC Kit試劑盒購于福州邁新生物科技有限公司(貨號: KIT-9710); 光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司; 石蠟包埋機、切片機2235、組織攤片機購于德國萊卡公司; 艾本德高速低溫離心機購于德國Eppendorf公司．

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與實驗設(shè)計

8周齡雄性昆明鼠24只,體質(zhì)量(30±2) g,飼養(yǎng)于溫度(20±2) ℃、濕度(50±5) %的實驗動物飼養(yǎng)房中.適應(yīng)1周后將其分為2組,對照組不做任何處理,實驗組每天9: 00-14: 00束縛于小鼠自制固定器中5 h,期間兩組小鼠均禁食禁水,持續(xù)24 d.實驗過程中記錄體質(zhì)量、食物攝入量變化．

1.2.2 曠場實驗

實驗第24 d,將對照組、實驗組小鼠在完成慢性束縛應(yīng)激后進行曠場試驗(Open Field Test,OFT).使用SMART 3.0(SMART 3.0,西班牙)系統(tǒng)記錄小鼠在2 min內(nèi)的探索行為,包括活動總距離、中央?yún)^(qū)域活動距離、邊緣區(qū)域活動距離．

1.2.3 ELISA檢測

試驗結(jié)束后取小鼠血液,經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心10 min收集血漿保存于-80 ℃冰箱中.用于NE,CORT,IL-18,TNF-α,IL-1β,IL-10檢測,在酶標(biāo)儀450 nm波長處測量各孔吸光度值,按照說明書計算最終濃度．

1.2.4 小鼠小腸HE染色

取小腸組織用4%多聚甲醛固定液固定,制作成石蠟切片,烘干、脫蠟、并進行濃度梯度酒精復(fù)水,經(jīng)HE染色后封片于顯微鏡下鏡檢組織學(xué)變化.使用Image-pro plus 6.0軟件統(tǒng)計每張圖片中腸絨毛高度和腸隱窩深度,再計算V/C比值．

1.2.5 小鼠血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取血漿離心后根據(jù)MDA,T-AOC,GSH-Px,CAT,SOD試劑盒說明書進行檢測．

1.2.6 小鼠小腸免疫組化和PAS染色

小腸組織經(jīng)石蠟包埋制作成切片后,用1×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液加熱20 min后自然冷卻至室溫,PBS洗滌3次后封閉非特異性抗原,一抗兔源PCNA∶PBS體積稀釋比(1∶150)、兔源ZO-1∶PBS體積稀釋比(1∶400),4 ℃ 12 h孵育一抗; 二抗山羊抗兔IgG∶PBS體積稀釋比(1∶200),37 ℃孵育1 h,二氨基聯(lián)苯胺(3,3-diaminobenzidine,DAB)顯色后進行蘇木素染液復(fù)染3 min,按濃度梯度酒精脫水后中性樹膠封片觀察,顯微鏡下拍照記錄.采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算組織中PCNA、ZO-1陽性區(qū)域平均吸光度值.PAS染色使用索萊寶試劑盒,切片常規(guī)脫蠟復(fù)水,經(jīng)碘酸氧化后雪夫試劑染色,蘇木素染液復(fù)染,1%鹽酸酒精分色,濃度梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后拍照記錄．

1.2.7 小鼠小腸TUNEL免疫熒光

將切片進行抗原修復(fù)后通透平衡,使用標(biāo)記工作液進行標(biāo)記反應(yīng)1 h,PBS洗滌3次,每次5 min.采用DAPI細胞核染色8 min,抗熒光淬滅封片劑封片,立即在熒光顯微鏡下觀察拍照.采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算組織中紅色熒光陽性區(qū)域平均吸光度值．

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)顯著性差異分析參考統(tǒng)計軟件SPSS 27.0的獨立樣本T值檢驗(T-TEST),在所有分析中ns表示p>0.05數(shù)據(jù)間差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義; *表示p<0.05數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,**表示p<0.01數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,***表示p<0.01數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義．

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性束縛應(yīng)激小鼠模型建立驗證分析

與對照組相比,實驗組小鼠體質(zhì)量極顯著下降5.59%(p<0.001),試驗期間兩組采食量差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05,圖1A、1B).實驗結(jié)束后檢測兩組血漿中去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)和皮質(zhì)醇(Cortisol,CORT),驗證機體是否處于應(yīng)激狀態(tài).實驗發(fā)現(xiàn),實驗組較對照組NE含量顯著上升102.95%(p<0.01)、CORT含量顯著上升95.29%(p<0.05),提示慢性束縛應(yīng)激模型構(gòu)建有效(圖1C、1D).曠場實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),實驗組小鼠較對照組活動總距離顯著增加135.25%(p<0.001),而中心區(qū)域活動距離減少63.5%(p<0.05); 實驗組邊緣區(qū)域活動距離增多5.41%(p<0.05),表明實驗組小鼠有明顯焦慮樣行為(圖1E、1F、1G、1H)．

圖1 體質(zhì)量采食變化、血漿激素水平、曠場實驗?zāi)Ｐ徒⒔Y(jié)果

2.2 慢性應(yīng)激對腸道組織結(jié)構(gòu)變化的影響

小腸組織經(jīng)HE染色顯示組織結(jié)構(gòu)無明顯病變(圖2A).對腸絨毛和隱窩進行測量(圖2B、2C、2D),結(jié)果顯示與正常組相比實驗組各腸段腸絨毛高度(Villi,V)分別減少30.96%、31.12%、17.73%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05); 隱窩深度(Crypt,C)分別增加46.90%,27.74%,26.01%(p<0.05); 腸絨毛高度和隱窩深度比值(V/C)降低43.96%(p<0.05).隨后進行上皮單核細胞統(tǒng)計,在圖2E中發(fā)現(xiàn)實驗組上皮單核細胞數(shù)量低于對照組51.95%,41.67%,34.07%(p<0.01),提示慢性束縛應(yīng)激造成小鼠腸道機械屏障損傷．

圖2 小腸組織結(jié)構(gòu)變化情況

2.3 腸道免疫組織化學(xué)和PAS染色結(jié)果

十二指腸、空腸、回腸免疫組化實驗結(jié)果顯示,實驗組小腸組織緊密連接蛋白ZO-1表達顯著低于對照組55.00%,44.89%,56.19%(p<0.001,圖3A、3D); 細胞核增殖抗原(PCNA)陽性表達細胞極顯著低于對照組37.13%,29.74 %,18.45%(p<0.01,圖3B、3E)).通過PAS染色檢測杯狀細胞數(shù)量,結(jié)果顯示與對照組相比,實驗組杯狀細胞數(shù)量顯著減少34.74%,27.78%,39.47%(p<0.05,圖3C、3F).以上結(jié)果表明,慢性束縛應(yīng)激會減少小腸各腸段中ZO-1,PCNA蛋白陽性表達量和杯狀細胞數(shù)量．

2.4 腸道TUNEL染色結(jié)果

通過TUNEL染色方法檢測慢性束縛應(yīng)激對小鼠腸道細胞凋亡的影響,結(jié)果顯示與對照組相比(圖4A、4B),實驗組小腸組織TUNEL陽性表達顯著性升高29.89%,60.81%,37.09%(p<0.01)．

ZO-1: 閉鎖小帶蛋白,PCNA: 細胞核增值抗原,PAS: 過碘酸雪夫染色．圖3 腸道免疫組織化學(xué)和PAS染色結(jié)果

TUNEL: dUTP原位切口末端標(biāo)記．圖4 腸道TUNEL染色結(jié)果

2.5 腸道抗氧化能力及炎性細胞因子表達的變化情況

ELISA實驗檢測顯示,實驗組炎癥因子TNF-α,IL-1β,IL-18含量顯著高于對照組39.14%,30.24%,98.21%(p<0.01),而IL-10顯著低于對照組13.85%(p<0.01,圖5A、5B、5C、5D).為了探明應(yīng)激是否造成小鼠氧化應(yīng)激發(fā)生,本研究檢測了小鼠血漿氧化-抗氧化系統(tǒng)變化.實驗結(jié)果顯示與對照組相比,實驗組血漿中MDA含量增加43.44%(p<0.05,圖5E); 而T-AOC,SOD,CAT,GSH-Px含量減少49.65%,15.47%,47.75%,35.08%(p<0.05,圖5F、5G、5H、5I).以上實驗結(jié)果提示機體處于氧化應(yīng)激水平,表明慢性束縛應(yīng)激會導(dǎo)致氧化物質(zhì)和促炎細胞因子含量升高,抗氧化物、抗炎因子含量降低,致使機體氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡,加重機體炎癥反應(yīng)．

TNF-α: 腫瘤壞死因子-α,IL-1β: 白細胞介素-1β,IL-18: 白細胞介素-18,IL-10: 白細胞介素-10,MDA: 丙二醛,T-AOC: 總抗氧化能力,SOD: 超氧歧化酶,CAT: 過氧化氫酶,GSH-Px: 谷胱甘肽過氧化物酶．圖5 腸道抗氧化能力及炎性細胞因子表達結(jié)果

3 討論

本研究對小鼠進行為期24 d慢性束縛應(yīng)激,同時每天記錄各組體質(zhì)量及采食量數(shù)據(jù).結(jié)果發(fā)現(xiàn),應(yīng)激小鼠體質(zhì)量較正常組顯著降低,但兩組采食量差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義.造模結(jié)束后通過ELISA實驗檢測到慢性束縛應(yīng)激小鼠血漿NE和CORT激素水平較對照組顯著上升,同時OFT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠出現(xiàn)焦慮行為.岳云雙[16]研究證實,慢性不可預(yù)知應(yīng)激可顯著提高小鼠血漿NE和CORT水平.徐小英等[17]關(guān)于慢性應(yīng)激對內(nèi)分泌系統(tǒng)及腸道微生物菌群的作用研究發(fā)現(xiàn),血漿CORT水平顯著增多,腸道也不同程度有損傷.據(jù)此,本研究進一步探索慢性應(yīng)激對小鼠小腸屏障結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果顯示應(yīng)激造成小鼠腸絨毛顯著變短,隱窩深度增加,V/C比值顯著降低.小腸發(fā)揮作用得益于腸上皮屏障結(jié)構(gòu)完整,緊密連接蛋白則發(fā)揮著維持機械屏障完整性和屏障功能的作用.大量研究表明,一旦緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)被破壞,會導(dǎo)致腸道上皮屏障完整性缺陷和慢性炎癥[18].本研究還通過免疫組織化學(xué)方法檢測了小腸緊密連接蛋白ZO-1的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激小鼠各腸段緊密連接蛋白ZO-1表達下調(diào),提示腸上皮機械屏障受損.杯狀細胞是腸粘液產(chǎn)生的主要細胞,也是維持上皮結(jié)構(gòu)完整性不可或缺的重要組成.因此,杯狀細胞數(shù)量決定粘液分泌多少.本研究中PAS染色結(jié)果顯示慢性束縛應(yīng)激小鼠杯狀細胞數(shù)量顯著減少,提示腸黏膜屏障功能受到抑制.張淑芳[19]發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激小鼠結(jié)腸組織內(nèi)杯狀細胞數(shù)量顯著減少、炎癥程度增加.相關(guān)研究進一步證明,慢性應(yīng)激降低腸道sIgA水平,并影響小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量[20].這與本研究統(tǒng)計的腸內(nèi)皮單核淋巴細胞數(shù)量結(jié)果一致,提示慢性應(yīng)激通過減少內(nèi)皮細胞單核淋巴細胞數(shù)量來破壞腸道免疫屏障．

在生理情況下,小腸上皮處于自我更新、分化、凋亡和環(huán)境的平衡.有證據(jù)表明外源因素,如益生菌可通過增強腸細胞分化、增加絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度的比率、降低隱窩深度來促進完整絨毛的發(fā)育[21].為此,本研究通過TUNEL染色法檢測了小鼠中腸絨毛頂端凋亡細胞數(shù)量,結(jié)果顯示在慢性應(yīng)激小鼠中腸絨毛頂端TUNEL陽性表達細胞數(shù)量顯著高于正常組,與此相反的是PCNA腸隱窩基底層陽性表達顯著低于正常組.Del Carmen Martínez-Sánchez等[22]研究發(fā)現(xiàn)細胞骨架重排和細胞脫落紊亂會引發(fā)通透性增加,導(dǎo)致腸道組織結(jié)構(gòu)的損傷和炎癥.PCNA反應(yīng)細胞增殖情況,可作為細胞增殖活性的可靠標(biāo)記物,其表達上調(diào)或下調(diào)提示細胞增殖水平上升或下降.因此,本研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激妨礙腸道隱窩基底干細胞的增殖分化,同時增加絨毛頂端凋亡細胞,破壞腸道上皮結(jié)構(gòu),影響腸屏障的完整性．

慢性應(yīng)激造成小腸機械屏障損傷,而機械屏障損傷可導(dǎo)致病原微生物的入侵,從而致使腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生[23].本研究對小鼠血漿進行ELISA檢測發(fā)現(xiàn),束縛應(yīng)激小鼠TNF-α,IL-1β,IL-18水平顯著上調(diào),IL-10含量顯著下調(diào).慢性應(yīng)激誘發(fā)原發(fā)性腸炎,TNF-α是體外和體內(nèi)研究中導(dǎo)致緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)被破壞最重要的炎癥因子,能夠破壞血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu),顯著降低ZO-1表達[24].IL-1β還可以通過影響緊密連接增加腸道通透性[25].在小鼠慢性應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁行為研究中發(fā)現(xiàn),慢性應(yīng)激增加IL-18釋放量[26],它作為一種促炎細胞因子,可通過抑制杯狀細胞成熟來抑制粘蛋白產(chǎn)生[27].IL-10是一種具有抗炎作用的細胞因子,在限制炎癥反應(yīng)和防止組織損傷方面具有關(guān)鍵作用,有研究發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激誘發(fā)和加劇IL-10缺乏小鼠的炎癥[28].因此,本研究結(jié)果表明,慢性束縛應(yīng)激通過損傷腸道屏障,誘導(dǎo)小鼠炎癥反應(yīng)．

氧化應(yīng)激是生命中常見的生理過程,其特征是由于線粒體氧化磷酸化反應(yīng)導(dǎo)致體內(nèi)多種活性氧(ROS)過量產(chǎn)生[29].鑒于小腸對氧化應(yīng)激的敏感性很高,結(jié)合先前研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激增加氧化應(yīng)激,并誘導(dǎo)十二指腸的腸屏障通透性和細胞凋亡[30],本研究推測機體氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡是導(dǎo)致腸屏障損傷的因素之一.因此,本研究利用生化手段檢測了機體氧化-抗氧化相關(guān)指標(biāo),結(jié)果表明在束縛應(yīng)激小鼠血漿中MDA水平顯著上調(diào),相反SOD,CAT,GSH-Px水平和T-AOC顯著下調(diào).有研究發(fā)現(xiàn)在抗氧化劑和氧化系統(tǒng)不平衡的情況下,過量的ROS可以通過減少緊密連接和細胞數(shù)量來擾亂上皮細胞完整性和腸道屏障[31].在關(guān)于自由基清除酶的研究中發(fā)現(xiàn)SOD,CAT,GSH-Px等抗氧化物酶活性下降不利于自由基清除,自由基和ROS導(dǎo)致機體細胞衰老、脂質(zhì)過氧化,影響腸上皮自我更新[32].ROS過量產(chǎn)生會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化MDA增多、刺激細胞產(chǎn)生促炎細胞因子、誘導(dǎo)細胞凋亡、造成緊密連接結(jié)構(gòu)損傷[33].綜上所述,慢性束縛應(yīng)激致使腸道發(fā)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致腸上皮細胞凋亡增加、更新變慢及上皮緊密連接蛋白ZO-1表達下降,加重炎癥反應(yīng)及腸屏障結(jié)構(gòu)完整性破壞．

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激通過誘導(dǎo)小鼠機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),從而破壞腸道細胞增殖凋亡平衡,進而造成腸道屏障結(jié)構(gòu)完整性受損,引起有害物質(zhì)進入腸道固有層,誘導(dǎo)腸道和機體炎性反應(yīng),導(dǎo)致炎癥性腸病發(fā)生．