中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)與血栓性疾病

王鑫，門(mén)劍龍（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心，天津 300052）

中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是一種由顆粒衍生蛋白修飾的DNA支架組成的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包含中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組織蛋白酶G、乳鐵蛋白、五肽釋放酶3、明膠酶、蛋白酶3和肽聚糖結(jié)合蛋白等多種活性物質(zhì)，而細(xì)菌、病毒、真菌、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、癌細(xì)胞、鈣離子等因素可通過(guò)復(fù)雜的活化模式誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs［1］。NETs 的抗炎特性與血栓前狀態(tài)密切相關(guān)，不但可通過(guò)為血小板、紅細(xì)胞、細(xì)胞外囊泡和促凝血因子（如血管性血友病因子）提供支架促進(jìn)血栓形成［2］，循環(huán)中NETs 組分，如無(wú)細(xì)胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）、MPO-DNA復(fù)合物、核小體和瓜氨酸化的組蛋白等，還可激活內(nèi)源性凝血途徑，促進(jìn)敗血癥、小血管炎、靜脈血栓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性中風(fēng)以及腫瘤相關(guān)血栓的發(fā)生和發(fā)展（其中組蛋白具有細(xì)胞毒性，可造成嚴(yán)重組織損傷）［3］。血漿中的NETs相關(guān)生物標(biāo)志物水平在冠心病、缺血性腦卒中［4］和靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）［5］時(shí)發(fā)生顯著改變，并與病情嚴(yán)重程度、臨床結(jié)局顯著相關(guān)。本文結(jié)合近年來(lái)NETs相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究文獻(xiàn)，對(duì)NETs在血栓性疾病領(lǐng)域的研究進(jìn)展做一綜述如下。

1 NETs 的形成機(jī)制和檢測(cè)方法

NETs基本特征是中性粒細(xì)胞發(fā)生劇烈形態(tài)變化的同時(shí)釋放疏松的染色質(zhì)、瓜氨酸化組蛋白和抗菌肽到細(xì)胞外空間并形成網(wǎng)絡(luò)［2］，此過(guò)程稱(chēng)為“NETs 形成”（NETosis）［6-8］。NETosis主要有3種不同模式［6］，（1）自殺性NETosis，中性粒細(xì)胞活化后的NETs形成涉及蛋白激酶C激活、Raf-MEKERK復(fù)合物活性增加、肽?；彼崦搧啺访福╬eptidylarginine deiminase，PAD）4活化以及染色質(zhì)解聚，隨著活性氧促使核膜消失，染色質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)蛋白和顆粒介質(zhì)混合，最后通過(guò)膜孔和細(xì)胞膜裂解釋放到細(xì)胞外，全過(guò)程持續(xù)2～4 h；（2）非活性氧依賴(lài)的NETosis，中性粒細(xì)胞經(jīng)Toll 樣受體（Tolllike receptors，TLRs）和C3 補(bǔ)體受體刺激活化后，在5～60 min內(nèi)釋放NETs而不損失核膜或質(zhì)膜；（3）活性氧依賴(lài)的NETosis，中性粒細(xì)胞受到C5a 或LPS 刺激的15 min 內(nèi)，線(xiàn)粒體DNA（而非核DNA）被釋放形成NETs的過(guò)程。

可視化檢測(cè)NETs的方法主要包括［6-7］：電子顯微鏡（透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡）、熒光顯微鏡、延時(shí)視頻顯微鏡（活細(xì)胞成像）等。其中，電子顯微鏡是用于表征NETs形成特征的常用工具。但NETs的電子顯微鏡染色特異性低，不足以區(qū)分NETs與宿主細(xì)胞碎片或炎癥部位存在的其他蛋白質(zhì)。通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）分析時(shí)，使用熒光顯微鏡等其他方法來(lái)驗(yàn)證結(jié)果是必不可少的。延時(shí)自動(dòng)共聚焦成像可用于發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體DNA釋放形成NETs，活細(xì)胞共聚焦顯微鏡成像技術(shù)可以展示染色質(zhì)擴(kuò)展的詳細(xì)時(shí)間過(guò)程。

定量檢測(cè)NETs 的方法主要包括［7-8］：流式細(xì)胞術(shù)、ELISA和熒光顯微鏡等。利用高速多光譜成像流式細(xì)胞術(shù)可評(píng)估非線(xiàn)粒體DNA釋放形成NETs。利用ELISA 法可定量檢測(cè)人血漿中瓜氨酸化組蛋白3（citrullinated histones 3，CitH3）水平或NETs特異性MPO-DNA和NE-DNA復(fù)合物的水平。使用不同的技術(shù)、特定和標(biāo)準(zhǔn)化的評(píng)估工具通過(guò)熒光顯微鏡可對(duì)NETs形成進(jìn)行量化，同時(shí)也是將NETosis 與其他細(xì)胞死亡機(jī)制（如凋亡或壞死）區(qū)分開(kāi)的最可靠方法。

免疫組織化學(xué)法可以通過(guò)顯色或熒光檢測(cè)來(lái)評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)。通過(guò)測(cè)量血液中NETs 成分（cfDNA、組蛋白、MPO和NE）的水平或者利用cfDNA、組蛋白和NE共染色的方法可對(duì)血液和組織樣本中的NETs進(jìn)行檢測(cè)［7］。此外，生物阻抗測(cè)量可以跟蹤早期中性粒細(xì)胞激活，從而可用于監(jiān)測(cè)NETosis的早期階段，有助于刺激依賴(lài)性動(dòng)力學(xué)的研究［9］。

2 NETs 與冠心病

NETs的影響貫穿動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的各個(gè)階段，與動(dòng)脈粥樣硬化患者血栓形成存在聯(lián)系，其機(jī)制可能是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和參與斑塊表面侵蝕，NETs相關(guān)生物標(biāo)志物顯示與動(dòng)脈粥樣斑塊負(fù)荷、冠心病嚴(yán)重程度和心血管事件呈正相關(guān)［10］，故NETs 逐漸被視為參與心腦血管疾病的重要角色、生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。血小板、中性粒細(xì)胞與NETs間涉及復(fù)雜的相互激活，同時(shí)NETs 還可持續(xù)活化內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，進(jìn)而激活凝血和補(bǔ)體途徑。NETs形成還可通過(guò)增強(qiáng)血管壁炎性反應(yīng)增加單核細(xì)胞募集，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和動(dòng)脈血栓衍展。NETs和功能受損的內(nèi)皮細(xì)胞間具有雙向作用，與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮損傷［11］，NETs中所含的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）－9可通過(guò)激活MMP-2引發(fā)內(nèi)皮功能障礙并減少主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)性血管舒張，而激活的內(nèi)皮細(xì)胞能依賴(lài)趨化因子8 誘導(dǎo)NETs 形成［12］。Ramos-kichik等［11］發(fā)現(xiàn)，NETs 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害可被脫氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1，DNase1）消除，Josefs等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，清除NETs 可以緩解糖尿病小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的損害，DNase1治療可減輕NETs 誘導(dǎo)的斑塊－巨噬細(xì)胞炎癥，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的消退。

2.1 NETs作為生物標(biāo)志物 在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者冠狀動(dòng)脈中的新鮮血栓栓子和正在溶解的栓子中都可見(jiàn)NETs，但未見(jiàn)于機(jī)化栓子中［14］。一項(xiàng)ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）患者冠狀動(dòng)脈血栓切除研究顯示，血栓NETs負(fù)荷與梗死面積呈正相關(guān)，與ST段回落呈負(fù)相關(guān)；與來(lái)自相同患者的股動(dòng)脈樣本相比，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療過(guò)程中接受冠狀動(dòng)脈血栓切除術(shù)時(shí)從病變部位收集血漿含有更高濃度的NETs 相關(guān)生物標(biāo)志物，并且病變部位的DNase1活性與血栓中NETs負(fù)荷和梗死面積呈負(fù)相關(guān)，重組DNase1能加速體外冠狀動(dòng)脈血栓溶解［15］。有研究顯示，病變部位的中性粒細(xì)胞可通過(guò)NETosis 和隨后遞呈組織因子（tissue factor，TF）釋放血栓形成信號(hào)［16］，NETs形成與TF血漿水平呈正相關(guān)［17］，提示血漿NETs 相關(guān)標(biāo)記物水平，特別是病變部位的測(cè)定值可用于推測(cè)血栓發(fā)生的時(shí)長(zhǎng)和嚴(yán)重程度，有助于臨床選擇治療方案。

NETs相關(guān)蛋白已顯示出誘導(dǎo)內(nèi)皮毒性和增加血栓形成的能力，尤其是循環(huán)中NETs相關(guān)cfDNA和組蛋白在炎性作用下被NETs釋放，在內(nèi)皮細(xì)胞水平上加劇炎性損害，造成惡性循環(huán)。組蛋白已被證明能刺激內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體釋放血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）［18］，同時(shí)NETs形成的纖維蛋白樣基礎(chǔ)可為血小板黏附、活化和聚集提供支撐，進(jìn)而促進(jìn)vWF和纖維蛋白原蓄積以及血栓形成。亦有研究認(rèn)為組蛋白和雙鏈DNA（doublestranded DNA，dsDNA）等標(biāo)志物的特異性偏低［3］。Langseth等［19］觀(guān)察了dsDNA和NETs與STEMI預(yù)后的相關(guān)性（Spearman相關(guān)），結(jié)果顯示，dsDNA與白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、肌鈣蛋白T（TnT）、NT-proBNP 和D－二聚體有相關(guān)性（r值分別為0.22、0.17、0.10 和0.17），MPO-DNA 與WBC 和TnT有相關(guān)性（r值分別為0.18、0.12），CitH3 與WBC 和NT-proBNP有相關(guān)性（r值分別為0.09、0.19）；NETs 相關(guān)成分水平與PCI期間植入的支架類(lèi)型、糖蛋白Ⅱb／Ⅲa抑制劑或院前溶栓治療均無(wú)相關(guān)性；在隨訪(fǎng)期間死亡的76 例患者中，dsDNA水平顯著升高，并與患者的全因死亡率升高相關(guān)（P＜0.001），MPO-DNA 或CitH3 與全因死亡率無(wú)顯著相關(guān)性。Riegger 等［20］多中心研究顯示，NETs 與支架血栓形成的病理生理機(jī)制有關(guān)，所有支架血栓中都存在炎性細(xì)胞，25%的樣本中檢測(cè)到細(xì)胞外DNA 和NE 的共定位。Demyanets等［21］將外周動(dòng)脈疾病患者經(jīng)腹股溝下血管成形術(shù)后的CitH3和cfDNA作為NETs形成的標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)循環(huán)CitH3和cfDNA可預(yù)測(cè)支架置入術(shù)后缺血結(jié)局，并與穩(wěn)定外周動(dòng)脈疾病的血小板活化有關(guān)。Kluge等［22］的研究顯示，末端補(bǔ)體復(fù)合物（terminalcomplementcomplex，TCC）和C5aR1 與MPO-DNA相關(guān)，TCC 水平與穩(wěn)定型冠心病患者的潛在心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。上述研究表明，NETs廣泛參與動(dòng)脈血管炎性損傷、凝血活化和血栓形成，在冠心病和外周動(dòng)脈疾病患者的病情變化中既是生物標(biāo)志物也是參與者。

2.2 NETs作為治療靶點(diǎn) NETs在A(yíng)MI患者的冠狀動(dòng)脈血栓中非常豐富，活化血小板可通過(guò)高遷移率族蛋白B1與其附近的NETs共同參與促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血栓形成，NETs 更可作為血小板、紅細(xì)胞和纖維蛋白的支架，以促進(jìn)血栓的延伸和維持栓子穩(wěn)定。NETs經(jīng)常出現(xiàn)在形成僅數(shù)天的血栓中，但在機(jī)化程度更高的冠狀動(dòng)脈血栓標(biāo)本中未被發(fā)現(xiàn)［14］。NETs結(jié)構(gòu)中的核小體能通過(guò)NE降解組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）來(lái)促進(jìn)血栓形成，而抗組蛋白抗體治療可較長(zhǎng)時(shí)間阻斷氯化鐵動(dòng)脈損傷模型中的中性粒細(xì)胞衍生核小體，其效應(yīng)可在NE／組織蛋白酶G 雙敲除小鼠中完全逆轉(zhuǎn)［23］。在小鼠心肌缺血／再灌注損傷模型中，通過(guò)注射DNase1靶向阻滯NETs形成過(guò)程，可降低損傷部位核小體和CitH3的血漿水平并顯示出對(duì)心臟保護(hù)的特性［24］。Ge等［25］的研究顯示，DNase1 聯(lián)合重組的組織型纖溶酶原激活物（rt-PA）治療可減少大鼠心肌缺血性損傷模型的梗死面積和無(wú)血流面積，減輕缺血后左心室重塑，而這些有益效果在單獨(dú)使用DNase1或rt-PA治療的大鼠中尚未觀(guān)察到。此外，DNase1也顯示出促進(jìn)溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生溶解栓子效應(yīng)［26］，上述研究表明抗NETs形成藥物可通過(guò)抗組蛋白、DNase1單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用等多種模式阻斷NETs對(duì)動(dòng)脈血管的炎性損害過(guò)程，對(duì)缺血性心臟病產(chǎn)生治療效果。

3 NETs 與缺血性卒中

NETs在腦卒中患者高凝狀態(tài)中起著關(guān)鍵作用。Kang等［27］的研究顯示，中風(fēng)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在大腦血管募集，進(jìn)而干擾中風(fēng)后血管重塑。腦卒中后清除NETs 可促進(jìn)血管重建，而NETs形成過(guò)量或NETs 清除不力對(duì)卒中后的血管重建和血管修復(fù)產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，NETs 既是反映卒中風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物，也是促進(jìn)腦卒中患者新生血管形成和功能恢復(fù)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

3.1 NETs作為生物標(biāo)志物 核小體、dsDNA和CitH3的血漿水平與缺血性中風(fēng)患者的卒中嚴(yán)重程度和預(yù)后相關(guān)。Vallés等［4］發(fā)現(xiàn)，急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者的核小體、dsDNA 和CitH3 水平顯著高于健康人群，其中特異性較高的CitH3增幅最大，這些NETs標(biāo)記物的水平與患者入院時(shí)的卒中嚴(yán)重程度相關(guān)（基于NIHSS 量表評(píng)分和修正Rankins量表評(píng)分）；血中CitH3 和dsDNA 水平在心源性卒中患者更高，其原因可能與炎癥高反應(yīng)相關(guān)；在空腹血糖較高的老年患者和既往房顫患者中，CitH3升高且與1年隨訪(fǎng)期內(nèi)的全因死亡率有獨(dú)立相關(guān)性。這些結(jié)果表明CitH3可能是評(píng)估AIS 預(yù)后的潛在標(biāo)志物。在腦缺血過(guò)程中，在毛細(xì)血管內(nèi)部和周?chē)纬蒒ETs 會(huì)促進(jìn)血栓形成，Laridan等［28］的研究顯示，與新鮮血栓相比，陳舊性血栓富含CitH3和NE；Perez-de-puig等［29］發(fā)現(xiàn)，從缺血性中風(fēng)患者腦循環(huán)中提取的血栓存在DNA 和CitH3 的支架結(jié)構(gòu)，推測(cè)NETs可能促進(jìn)繼發(fā)性微血栓，而這種繼發(fā)性血栓形成可導(dǎo)致缺血時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，并使溶栓時(shí)間窗變窄。與非心源性血栓相比，心源性腦卒中血栓中NETs 含量更為豐富，在所有栓子中都存在大量NETs，陳舊性血栓中的NETs 比新鮮血栓的含量更高，表現(xiàn)為dsDNA、MPO和瓜氨酸化組蛋白4的三聯(lián)共染色陽(yáng)性，而且血栓切除術(shù)耗時(shí)和器械通過(guò)次數(shù)與NETs 表達(dá)水平呈正相關(guān)［30］。Lim 等［31］的研究顯示，急性冠狀動(dòng)脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）組和AIS組dsDNA濃度均高于對(duì)照組（P＜0.001），在單變量和多元分析中，ACS組的肌鈣蛋白I（TnI）、dsDNA（P值分別為0.046和0.015）和AIS 組的dsDNA 濃度增高（P＝0.002）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在ROC分析中，ACS組TnI和dsDNA的曲線(xiàn)下面積分別為0.878 和0.968，AIS 組的dsDNA 為0.859；研究認(rèn)為，在A(yíng)CS和AIS患者中，外周循環(huán)中的NETs 水平在最初發(fā)病時(shí)增加，可作為早期診斷的生物標(biāo)志物。目前，基于對(duì)血栓栓子的共定位染色和血漿濃度研究，缺血性卒中時(shí)NETs組分高度表達(dá)，初步認(rèn)為dsDNA和CitH3、CitH3和NE以及dsDNA、MPO和瓜氨酸化組蛋白4 可能是評(píng)估血管損傷嚴(yán)重程度、病情發(fā)展和臨床預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

3.2 NETs 作為治療靶點(diǎn) Zhou 等［32］的研究顯示，在頸動(dòng)脈血栓形成局部有富含磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的NETs、血小板和血小板衍生微粒的蓄積，激活的血小板與NETs和PS起互補(bǔ)作用，含PS的NETs為血小板衍生微粒和凝血因子沉積提供平臺(tái)，從而增加凝血酶和纖維蛋白形成，NETs相關(guān)蛋白酶和組蛋白通過(guò)誘導(dǎo)PS 暴露和TF表達(dá)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞毒性作用并增強(qiáng)受損內(nèi)皮細(xì)胞的促血栓能力；DNase1 和PS 抑制劑明顯拮抗上述作用。Pe?a-Martínez等［33］針對(duì)溶栓治療時(shí)“t-PA 抵抗現(xiàn)象”的研究顯示，注射DNase1 可促進(jìn)NETs 溶解（非t-PA 所致溶解），使閉塞血管再通，改善光凝性卒中的預(yù)后；用氯酰胺預(yù)防性治療可阻止NETs 形成，避免血栓閉塞。由于NETs在頸動(dòng)脈病變部位造成的損傷與多種因素有關(guān)，并可能通過(guò)阻止NETs形成的方法進(jìn)行治療，預(yù)期將有更多相關(guān)研究聚焦于抑制NETs形成的方法以降低NETs形成帶來(lái)的負(fù)面影響。

4 NETs 與靜脈血栓

循環(huán)中的NETs 相關(guān)生物標(biāo)志物水平與靜脈血栓性疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，但NETs并不是這些生物標(biāo)志物的唯一來(lái)源，目前尚不清楚是否能反映這些患者中的NETs形成。

4.1 NETs促進(jìn)VTE的機(jī)制 NETs的關(guān)鍵成分在靜脈血管內(nèi)產(chǎn)生促凝作用。在靜脈血栓形成時(shí)，中性粒細(xì)胞主要通過(guò)vWF、TF和黏附分子介導(dǎo)途徑在活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面募集，構(gòu)成了疾病早期階段血栓結(jié)構(gòu)中炎性細(xì)胞的大部分。Brill等［34］的研究顯示，組蛋白輸注導(dǎo)致vWF 釋放，并在下腔靜脈狹窄模型中發(fā)現(xiàn)可加速深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）；來(lái)自大鼠下腔靜脈狹窄模型顯示，血栓結(jié)構(gòu)主要以vWF 相關(guān)的NETs 存在為特征，尤其是在早期，NETs通過(guò)組蛋白A1結(jié)構(gòu)域與vWF產(chǎn)生相互作用，同時(shí)也結(jié)合其他與血栓形成相關(guān)的蛋白，如纖維連接蛋白（含有能與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域）［35］。此外，TF在靜脈血栓形成中與NETs關(guān)系密切，在NETs生成過(guò)程中，中性粒細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生TF和NE以增加TF活性（NE在TFPI的裂解過(guò)程中至關(guān)重要），當(dāng)血小板和中性粒細(xì)胞被促凝因子激活后，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NETs成為捕捉血栓基本成分（如紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板和激活的凝血因子）的網(wǎng)絡(luò)和框架。

Li等［26］研究顯示，在急性肺動(dòng)脈栓塞患者中，NETs 和LPA顯著升高，LPA通過(guò)PAD4依賴(lài)性途徑誘導(dǎo)NETs的快速釋放，并誘導(dǎo)NETs 產(chǎn)生有抗t-PA 特性的血栓。同時(shí)，LPA誘導(dǎo)的NETs可以激活血小板釋放LPA，從而產(chǎn)生正反饋機(jī)制（LPA信號(hào)誘導(dǎo)NETs釋放），因此LPA-NETs信號(hào)通路可能是VTE防治的新靶點(diǎn)。

Savchenko等［36］研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于手術(shù)或尸檢組織樣本的免疫組化分析顯示，NETs主要存在于VTE正在機(jī)化的區(qū)域，而在完全機(jī)化的血栓局部則很少出現(xiàn)NETs；表明隨著中性粒細(xì)胞進(jìn)入血栓，NETs形成可能是短暫的，并且隨著血栓逐漸機(jī)化，細(xì)胞外NETs開(kāi)始降解并被膠原網(wǎng)絡(luò)所取代。由于NETs可以刺激纖維化重塑并促進(jìn)血栓穩(wěn)定，而這種血栓很難被內(nèi)源性纖溶系統(tǒng)降解，故與VTE 的后遺癥密切相關(guān)（如血栓后綜合征或慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓）。

4.2 NETs作為VTE標(biāo)志物 有研究顯示［34］，與野生型小鼠相比，PAD4 -／-小鼠進(jìn)一步證實(shí)了NETs 形成在靜脈血栓形成中的作用，NETs缺乏導(dǎo)致下腔靜脈狹窄后血栓減少，補(bǔ)充DNase1也顯示出類(lèi)似的效果。van Montfoort 等［37］發(fā)現(xiàn)，DVT患者循環(huán)血液中核小體和彈性蛋白酶－α1－抗胰蛋白酶復(fù)合物的水平高于非DVT 患者；Diaz 等［38］研究顯示，DVT患者血漿高DNA濃度與D－二聚體、Wells評(píng)分和MPO有相關(guān)性。

4.3 活動(dòng)性腫瘤相關(guān)VTE 腫瘤細(xì)胞、腫瘤誘導(dǎo)活化的血小板、腫瘤或宿主分泌的細(xì)胞因子（如粒細(xì)胞集落刺激因子和白細(xì)胞介素－8）［39］均可對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生促NETs 形成的效應(yīng)。

NETs可誘導(dǎo)血小板活化，活化的血小板可通過(guò)造血調(diào)控和誘導(dǎo)免疫細(xì)胞向腫瘤部位遷移，形成腫瘤相關(guān)炎性微環(huán)境，進(jìn)而增加DVT風(fēng)險(xiǎn)。血小板TLR4可以觸發(fā)NETs形成，血小板P－選擇素也可通過(guò)其糖蛋白配體－1激活中性粒細(xì)胞形成NETs［40］，而中性粒細(xì)胞在該過(guò)程中釋放的組蛋白3和4 可依次激活循環(huán)中的血小板，NETs 中的cfDNA 不但能直接激活血小板，還可激活凝血因子Ⅻ，放大凝血效應(yīng)，促進(jìn)纖維蛋白沉積，為血栓形成提供了強(qiáng)刺激和支架結(jié)構(gòu)。近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)細(xì)胞外囊泡與中性粒細(xì)胞共孵育可促進(jìn)NETs形成，并可黏附于NETs 復(fù)合物［41］，表明腫瘤相關(guān)細(xì)胞外囊泡與中性粒細(xì)胞之間的相互作用可能是增加腫瘤相關(guān)血栓風(fēng)險(xiǎn)的重要原因。

腫瘤細(xì)胞可直接誘導(dǎo)NETs的形成，在轉(zhuǎn)移過(guò)程中借助NETs保護(hù)其免受循環(huán)血流剪切應(yīng)力和免疫系統(tǒng)的影響，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移［42］。中性粒細(xì)胞在形成NETs的同時(shí)，還促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，提供各種與腫瘤發(fā)展相關(guān)的物質(zhì)，其中NE可刺激腫瘤生長(zhǎng)和傳播［43］，白細(xì)胞介素－8直接刺激血管生成［44］，同時(shí)來(lái)自于細(xì)胞外基質(zhì)的VEGF 可通過(guò)MMP-9對(duì)血管生成產(chǎn)生正反饋效應(yīng)［3］。Hisada 等［45］證實(shí)，注射DNase1 顯著降低腫瘤小鼠的血栓重量，但不影響對(duì)照小鼠的血栓重量；Leal 等［41］發(fā)現(xiàn)，DNase1 應(yīng)用于腫瘤小鼠和對(duì)照小鼠可完全消除動(dòng)脈血栓形成，并降低腫瘤小鼠的VTE負(fù)荷，但不影響對(duì)照小鼠的靜脈血栓形成。大量研究表明，NETs與TF、vWF 和纖維蛋白結(jié)合形成的網(wǎng)絡(luò)為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散提供支架結(jié)構(gòu)，DNase1可阻滯此過(guò)程，從而為腫瘤相關(guān)VTE的防治提供新的靶點(diǎn)和治療思路。

5 展望

在檢測(cè)領(lǐng)域，由于NETs 異質(zhì)性強(qiáng)，其表達(dá)受多種病理生理因素的影響，使得現(xiàn)階段的檢測(cè)方法都存在局限性（尤其是特異性），因此基于免疫組化技術(shù)、流式技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫熒光技術(shù)開(kāi)發(fā)多種類(lèi)型的生物標(biāo)志物，并圍繞疾病發(fā)展、器官損傷以及血栓相關(guān)終點(diǎn)事件進(jìn)行隊(duì)列研究，篩選具有針對(duì)性的NETs檢測(cè)指標(biāo)，將有助于臨床從表觀(guān)遺傳學(xué)視角更為準(zhǔn)確審視血栓發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，為臨床干預(yù)提供依據(jù)。

在治療領(lǐng)域，目前研究顯示，除DNase1、乙酰半胱氨酸、維生素D和氯喹外，靶向B細(xì)胞藥物（利妥昔單抗）、補(bǔ)體系統(tǒng)和潛在IFN-α的單克隆抗體均可能抑制NETs形成過(guò)程，因此靶向預(yù)防NETs 形成可能在未來(lái)成為防治血栓的新方法。但需注意的是，抑制NETs形成有可能會(huì)影響機(jī)體對(duì)細(xì)菌的捕獲、殺滅和清除能力。此外，NETs 被破壞之后，其成分（citH3、MPO）擴(kuò)散到循環(huán)中亦有可能加劇全身炎癥反應(yīng)。因此尚需進(jìn)行更多的觀(guān)察試驗(yàn)，評(píng)估針對(duì)NETs及其下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)采取干預(yù)措施的安全性和有效性。