外周血或骨髓腫瘤性NK細(xì)胞形態(tài)特征觀察及其與反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的鑒別

王紅梅，張慧慧，李興武（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450052）

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK 細(xì)胞）白血病／淋巴瘤在2016版WHO淋巴瘤分類里屬于成熟NK／T淋巴瘤，其診斷整合了MICM——組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)（morphology）、免疫學(xué)（immunity）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics）以及分子生物學(xué)（molecular Biology）的多種輔助檢測技術(shù)。檢驗(yàn)工作者對外周血或骨髓中發(fā)現(xiàn)腫瘤性NK細(xì)胞普遍缺乏經(jīng)驗(yàn)，相關(guān)專業(yè)書籍里也少有描述。筆者將近期工作中發(fā)現(xiàn)的6 例確診NK 細(xì)胞白血?。馨土龅哪[瘤性NK細(xì)胞形態(tài)特征進(jìn)行整理分析，并與骨髓或外周血涂片中反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)行比對分析，試圖從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度發(fā)現(xiàn)一些規(guī)律性的線索，以期為NK 細(xì)胞白血?。馨土龅脑\斷治療提供有價值的證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病例來源 6例外周血或骨髓檢出腫瘤性NK細(xì)胞的患者以及3例反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多的患者，前者分別來自本院血液科、腫瘤科、耳鼻喉科等，后者分別來自本院呼吸內(nèi)科和急診內(nèi)科。9 例患者年齡為18～60歲，男6 例，女3 例。本項(xiàng)目已通過本院科研和臨床試驗(yàn)倫理委員會倫理審查（文號：2019-KY-201）。

1.2 儀器與試劑 FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞分析儀及其配套試劑、質(zhì)控品（BD 公司）；Olympus CX-41顯微鏡；瑞氏－吉姆薩染料購于鄭州派尼化學(xué)試劑廠；甲醇購于北京化工廠，二者按1 g／500 mL 研磨溶解；磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀購于天津市科密歐化學(xué)試劑公司，按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》配制pH 6.8緩沖液。

1.3 方法 采集患者外周血或骨髓2 mL，按照實(shí)驗(yàn)室SOP 文件進(jìn)行流式分析；將外周血或骨髓涂片自然晾干后用瑞吉氏染液常規(guī)染色，形態(tài)學(xué)觀察成員均為經(jīng)過培訓(xùn)的技師；將檢測到的腫瘤性NK 淋巴細(xì)胞的異常表型和細(xì)胞形態(tài)列表進(jìn)行分析總結(jié)，且與反應(yīng)性淋巴細(xì)胞進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

6 個病例的臨床特征及FCM 免疫學(xué)表型特征總結(jié)見表1，其腫瘤性NK細(xì)胞的形態(tài)分別見圖1～6。其異常NK 細(xì)胞特征相似，相對一致：胞體較大，且大小不一，形態(tài)不規(guī)則，有向兩端拉長趨勢。細(xì)胞核形態(tài)多樣，大部分不規(guī)則，隨胞體拉長或不規(guī)則，染色質(zhì)聚集呈塊狀、條索狀，核仁不見或模糊不清。胞漿量較豐富，呈灰藍(lán)色（嗜堿性），周圍可見多個偽足樣突起，向一端或兩端延申拖尾，有些細(xì)胞靠近核處可見灰白色淡染區(qū)，漿內(nèi)可見多少不等的粗大或細(xì)小紫紅色顆粒。

圖1 病例1侵襲性NK細(xì)胞白血病細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

圖2 病例2結(jié)外NK／T 細(xì)胞淋巴瘤鼻型淋巴瘤細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

圖3 病例3侵襲性NK細(xì)胞白血病細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

圖4 病例4結(jié)外NK／T 淋巴瘤鼻型淋巴瘤細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

圖5 病例5侵襲性NK細(xì)胞白血病細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

圖6 病例6侵襲性NK細(xì)胞白血病細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

3例反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多患者臨床診斷分別為腎癌術(shù)后感染、感染性發(fā)熱、EBV感染，其異型淋巴細(xì)胞形態(tài)歸類整理見圖7～9，大致分為Ⅰ型，泡沫型或漿細(xì)胞型；Ⅱ型，不規(guī)則型或單核細(xì)胞樣型；Ⅲ型，幼稚型或幼淋巴細(xì)胞樣型。

圖7 Ⅰ型即泡沫型或漿細(xì)胞型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

圖8 Ⅱ型即不規(guī)則型或單核細(xì)胞樣型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

圖9 Ⅲ型即幼稚型或幼淋巴細(xì)胞樣型反應(yīng)性淋巴細(xì)胞形態(tài)（×1 000）

6個病例腫瘤性NK細(xì)胞形態(tài)特征其與反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的鑒別點(diǎn)見表2。

表2 6個病例腫瘤性NK細(xì)胞的形態(tài)特征及其與反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的鑒別

3 討論

NK細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，來源于骨髓，是除T 細(xì)胞、B 細(xì)胞之外的第三大類淋巴細(xì)胞，其形態(tài)上屬于大顆粒淋巴細(xì)胞，約占外周血中所有淋巴細(xì)胞的15%［1］。FCM 分析NK 細(xì)胞主要的免疫表型特征為CD3－CD56＋，根據(jù)細(xì)胞表面CD56 分子表達(dá)強(qiáng)度的差異，將NK 細(xì)胞分為CD56dim和CD56str亞群。其中外周循環(huán)血中90%以上為CD56dim亞群，主要發(fā)揮細(xì)胞毒作用［1-3］。

病理情況下，NK 細(xì)胞惡性增殖導(dǎo)致發(fā)生NK細(xì)胞相關(guān)腫瘤，根據(jù)病程不同分為慢性和侵襲性，包括2016版WHO 分類中的慢性NK 細(xì)胞增殖性疾病（CLPD-NK）、侵襲性NK細(xì)胞白血?。ˋNKL）、結(jié)外NK／T細(xì)胞淋巴瘤鼻型（ENKTCL）。

CLPD-NK較罕見，臨床進(jìn)展緩慢［4］，由于病例數(shù)量有限，本研究中沒有納入該病相關(guān)的骨髓或外周血細(xì)胞形態(tài)特征分析。

ANKL是系統(tǒng)性的腫瘤性NK 細(xì)胞增殖，伴或不伴噬血細(xì)胞。具有侵襲性暴發(fā)性的臨床病程，常與EBV感染高度相關(guān)，極少數(shù)可能與蚊蟲叮咬引起的超敏反應(yīng)有關(guān)。最常見累及的部位依次為骨髓、外周血、脾及淋巴結(jié)等，可合并凝血功能障礙、噬血細(xì)胞綜合癥或多器官功能衰竭。腫瘤性NK細(xì)胞典型的FCM 免疫表型為：cCD3＋／sCD3－／CD2＋／CD5－／CD56 ＋／CD57－／細(xì)胞毒分子（TIA1、顆粒酶、穿孔素）陽性［5-6］。本研究納入4 例NK 細(xì)胞白血病患者的異常NK細(xì)胞均經(jīng)FCM證實(shí)，表型符合ANKL白血病細(xì)胞的表型，且均伴發(fā)噬血細(xì)胞綜合征。骨髓或外周血中腫瘤性NK 細(xì)胞彌散或局灶性分布，胞體及胞核不規(guī)則，著色較深，核仁清楚或不見，胞漿豐富，嗜堿性，內(nèi)含細(xì)小或粗大的紫紅色顆粒，有多個偽足伸出，呈手鏡形或不規(guī)則拖尾形。偽足的伸出可能和細(xì)胞的侵襲性有關(guān)，胞漿中的顆?？赡芘c細(xì)胞毒性物質(zhì)如顆粒酶穿孔素等有關(guān)，輔助腫瘤性細(xì)胞的遷移以及殺傷作用，引起細(xì)胞因子風(fēng)暴從而使患者易伴發(fā)噬血細(xì)胞綜合癥［7］。

ENKTCL是非霍奇金淋巴瘤中一種少見類型，主要特征是血管破壞和組織壞死明顯，腫瘤性NK細(xì)胞FCM免疫表型與ANKL 相似，也與EBV 感染高度相關(guān)。臨床病程呈高度侵襲性，絕大多數(shù)患者淋巴結(jié)外發(fā)病，最常累及上呼吸消化道，鼻腔是典型的累及部位，骨髓累及不常見。但當(dāng)累及骨髓和外周血時，表現(xiàn)可與ANKL相似。部分患者可合并噬血細(xì)胞綜合征［8-9］。本研究中納入2 例ENKTCL患者，腫瘤性NK細(xì)胞累及骨髓，細(xì)胞胞體均較大，形態(tài)不規(guī)則，多有不規(guī)則偽足伸出，使細(xì)胞拉長或拖尾，胞漿內(nèi)可見多少不等的粗大紫紅色顆粒，與4例ANKL患者的腫瘤性NK細(xì)胞形態(tài)相似。

外周血或骨髓涂片中的淋巴細(xì)胞形態(tài)多樣，ELN形態(tài)學(xué)工作組將不典型淋巴細(xì)胞分為三類描述：（1）不典型淋巴細(xì)胞，疑為反應(yīng)性；（2）不典型淋巴細(xì)胞，疑為腫瘤性；（3）不典型淋巴細(xì)胞，性質(zhì)不確定［10］。反應(yīng)性不典型淋巴細(xì)胞英文是atypical lymphocyte，目前更趨向reactive lymphocyte，即反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，常以CD3＋CD8＋T細(xì)胞為主，也可為B細(xì)胞，外周血反應(yīng)性淋巴細(xì)胞83%～97%為T 細(xì)胞，4%～17%為B 細(xì)胞。反應(yīng)性淋巴細(xì)胞是在病毒、細(xì)菌、生物、化學(xué)等其他因素作用下被激活成為活化狀態(tài)時的形態(tài)學(xué)改變，其本質(zhì)并沒有改變。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)上根據(jù)其形態(tài)特征分為三型：Ⅰ型，泡沫型或漿細(xì)胞型；Ⅱ型，不規(guī)則型或單核細(xì)胞樣型；Ⅲ型，幼稚型或幼淋巴細(xì)胞樣型（如圖7～9）。本研究收集的6例腫瘤性NK細(xì)胞形態(tài)特征與反應(yīng)性淋巴有明顯的區(qū)別，主要表現(xiàn)在：（1）前者胞體及胞核呈高度不規(guī)則的長條狀或橢圓狀，后者為圓形或近似圓形；（2）前者深染的胞漿內(nèi)含有數(shù)量不等的粗大或細(xì)小紫紅色顆粒，后者很少含顆粒；（3）前者胞漿呈不規(guī)則偽足樣突起或拖尾，而后者中漿細(xì)胞型和幼稚型很少有此現(xiàn)象，單核細(xì)胞型雖然可有胞漿凸起，但其偽足常深入紅細(xì)胞間隙；（4）前者往往單一或均一出現(xiàn)，而后者可幾種形態(tài)同時出現(xiàn)。

對臨床醫(yī)生而言，快速區(qū)分反應(yīng)性淋巴細(xì)胞與腫瘤性淋巴細(xì)胞對疾病的診斷與治療決策相當(dāng)重要，首選檢查是外周血涂片的顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查，但問題是形態(tài)學(xué)上界定反應(yīng)性與腫瘤性淋巴細(xì)胞有一定的難度。有時淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)反應(yīng)性的特點(diǎn)，有時兼有炎癥、反應(yīng)性或腫瘤的特點(diǎn)［11］。NK 細(xì)胞腫瘤變時其分子表型發(fā)生改變，形態(tài)也發(fā)生異常，本文只是總結(jié)了有限的幾例典型的腫瘤性NK 細(xì)胞的形態(tài)特征，有時不易與腫瘤性T細(xì)胞或其他腫瘤性淋巴細(xì)胞區(qū)別，還需要結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，但毫無疑問，正確識別外周血或骨髓里腫瘤性NK細(xì)胞，不論是在流式細(xì)胞術(shù)檢測之前選擇抗體還是對臨床疾病的診斷和治療，都具有重要意義。