紅細(xì)胞冷凍保存的歷史、機(jī)理與研究進(jìn)展

沈凌霄 趙剛

1 前言 1949年，Pogle、Smith 和Parkes在Nature上報(bào)道他們?cè)谝淮螌?shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)了添加5%的甘油后人類精子的冷凍存活率能明顯提高的現(xiàn)象，在隨后關(guān)于雞的精子凍存實(shí)驗(yàn)中他們使用40%的甘油在-79℃冷凍保存20分鐘后快速?gòu)?fù)溫，再次發(fā)現(xiàn)精子幾乎全部存活并且完整地保留了凍前移動(dòng)能力，從此現(xiàn)代低溫生物學(xué)的大門(mén)正式開(kāi)啟[1]。紅細(xì)胞作為人體內(nèi)數(shù)量最多的生物細(xì)胞，自然也成為生物低溫保存領(lǐng)域中經(jīng)典的研究對(duì)象之一。冷凍紅細(xì)胞最重要的意義就是盡可能地延長(zhǎng)了保存時(shí)間，雖然現(xiàn)有基于抗凝劑和營(yíng)養(yǎng)液的2～6℃紅細(xì)胞體外儲(chǔ)存方案可以將儲(chǔ)存期限延長(zhǎng)至5～7周，比如MAP可以保存紅細(xì)胞35天，SAGM、AS-1、AS-3和AS-5可以保存紅細(xì)胞42天，PAGGS-S/M和Erythro-Sol可以保存紅細(xì)胞49天等[2-4]，但在面臨稀有血型、不規(guī)則抗體、戰(zhàn)爭(zhēng)、自然災(zāi)害等情況時(shí)，僅1個(gè)多月的保存時(shí)間仍然滿足不了實(shí)際需要[5-8]。此外，體外冷藏紅細(xì)胞還會(huì)面臨儲(chǔ)存損傷（Storage lesion）的風(fēng)險(xiǎn)，比如ATP和2，3-DPG的丟失，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物遭受氧化損傷，細(xì)胞形態(tài)改變和膜丟失，粘度增加，變形能力減弱，攜氧能力降低等[9]。因此，為了保證輸注人體內(nèi)的紅細(xì)胞仍能維持較好的狀態(tài)和一定的氧氣輸送功能，儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的紅細(xì)胞不建議用于臨床輸血[10]。紅細(xì)胞在深低溫或超低溫（-80℃或-196℃）下將處于凍結(jié)狀態(tài)，其生理代謝和化學(xué)反應(yīng)幾乎完全停止，因此相比4℃冷藏保存，低溫冷凍儲(chǔ)存的紅細(xì)胞，其血紅蛋白結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜狀態(tài)以及胞內(nèi)能量物質(zhì)都不再受到儲(chǔ)存時(shí)間的影響，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的長(zhǎng)期保存[11]。1987年9月，美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)了-80℃條件下甘油化紅細(xì)胞可以冷凍保存10年，Valeri等人也報(bào)道了經(jīng)過(guò)21年、37年冷凍保存后的甘油化紅細(xì)胞在完成復(fù)溫洗滌處理后仍然符合臨床使用標(biāo)準(zhǔn)[12,13]。從大規(guī)模輸血患者的臨床表現(xiàn)來(lái)看，即使出現(xiàn)一些輸血反應(yīng)，比如凝血功能受損、腎功能衰竭、深靜脈血栓形成或呼吸衰竭等并發(fā)癥，也沒(méi)有證據(jù)表明是由于輸注冷凍紅細(xì)胞造成的[14]。本綜述將回顧紅細(xì)胞冷凍保存歷史，探討紅細(xì)胞低溫?fù)p傷機(jī)理，總結(jié)紅細(xì)胞冷凍最新科研成果，為耕耘在輸血醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的醫(yī)務(wù)人員以及關(guān)注紅細(xì)胞冷凍保存的科研工作者提供一些低溫保存方面的科學(xué)知識(shí)。

2 紅細(xì)胞低溫保存歷史回顧

2.1 紅細(xì)胞低溫保存的前期探索：紅細(xì)胞冷凍保存的歷史要追溯到1949年，一個(gè)理想主義者Luyet曾致力于使用無(wú)任何低溫保護(hù)劑的超快速玻璃化冷凍的方法讓紅細(xì)胞存活，雖然他使用極薄的薄膜在幾毫秒內(nèi)從0℃快速降溫到-50℃后成功回收了75%的公牛紅細(xì)胞，但由于凍存體積僅為0.1 mL，實(shí)際意義尚不明顯，可他卻是世界上公認(rèn)的紅細(xì)胞冷凍先驅(qū)[15,16]。同樣在1949年，在一次血液領(lǐng)域的會(huì)議上，Luyet、Strumia、Griffitts、Walter和Gibson等人相繼報(bào)道了紅細(xì)胞冷凍的早期經(jīng)驗(yàn)[17-21]。1950年，作為成功發(fā)現(xiàn)甘油可以冷凍精子的小組成員之一，Smith在The Lancet首次報(bào)道了使用終濃度15%甘油并在-79℃干冰乙醇浴中冷凍的方案，發(fā)現(xiàn)冷凍8周后復(fù)溫的紅細(xì)胞只有輕微溶血[22]。1951年，Sloviter在The Lancet上首次報(bào)道了用透析的方法來(lái)對(duì)凍后紅細(xì)胞進(jìn)行去甘油操作，從而解決了含甘油的紅細(xì)胞直接加入血漿或者等滲溶液中迅速溶血的問(wèn)題[23]。同樣在1951年，Mollison等人也在The Lancet上報(bào)道了第一例向人輸注經(jīng)甘油冷凍過(guò)的紅細(xì)胞的案例，并和未冷凍組對(duì)比了輸注后紅細(xì)胞人體內(nèi)存活率，發(fā)現(xiàn)無(wú)顯著差異[24]。至此，人類冷凍紅細(xì)胞的時(shí)代正式拉開(kāi)帷幕，使用15%甘油并在-79℃干冰乙醇浴中冷凍成為早期較為通用的紅細(xì)胞冷凍方法[25]，隨后更多的關(guān)于甘油保存紅細(xì)胞優(yōu)化方案以及非甘油保存方案逐漸被提出。

1952年，Lovelock等人在The Lancet上提出了可以先用非滲透性的0.33 M檸檬酸鈉或者1 M葡萄糖再用生理鹽水的梯度洗滌甘油的方法來(lái)解決透析法去甘油費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題，這是梯度洗滌甘油方法的雛形[26]。同樣在1952年，Sloviter在Nature上報(bào)道了在-79℃下15%甘油可以冷凍保存紅細(xì)胞長(zhǎng)達(dá)9個(gè)月[27]。1953年，Chaplin等人在The Lancet上連發(fā)兩文，先報(bào)道了可以將甘油濃度提升到30%終濃度并證明能在-20℃下儲(chǔ)存3個(gè)月以上幾乎無(wú)溶血，后報(bào)道了使用Buckley等人開(kāi)發(fā)的長(zhǎng)程離心機(jī)再加能引入洗滌液的燒瓶，從而完成對(duì)紅細(xì)胞連續(xù)洗滌甘油的工作，將洗滌時(shí)間縮短到2.5 h（如果洗滌500 mL紅細(xì)胞采用Sloviter透析方法需48 h，采用Lovelock手工梯度離心洗滌需5～6 h），這種方法原理上與最終的Haemonetics系統(tǒng)相似[28-30]。1955年，Meryman等人報(bào)道了可以用含6%葡萄糖的全血，在液氮中以液滴形式快速冷凍后能獲得90%以上的冷凍存活率，80%以上的24 h體內(nèi)存活率，這是紅細(xì)胞首次在-196℃液氮冷凍的報(bào)道[31]。1959年，Lovelock等人在Nature上報(bào)道了除甘油之外，15% DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亞砜）同樣可以在-79℃干冰乙醇浴下實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞的冷凍保存，同時(shí)也解決了對(duì)甘油滲透性差的牛紅細(xì)胞冷凍存活率過(guò)低的問(wèn)題[32]。1950s～1960s年期間還出現(xiàn)了一些經(jīng)典的非滲透性保護(hù)劑保存方案，比如Strumia的乳糖&葡萄糖干冰乙醇浴方案，Rinfret的PVP（Polyvinyl pyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮）-白蛋白-液氮冷凍方案。

1958年，Strumia等人在Science上報(bào)道了可以單獨(dú)或組合使用乳糖（Lactose）和葡萄糖（Dextrose）（比如15%乳糖-10%葡萄糖）并使用25～50 mL扁平容器在-93℃干冰乙醇浴中冷凍后獲得95%的冷凍存活率，復(fù)溫去上清后未經(jīng)洗滌直接輸注人體[33]，并在隨后幾年進(jìn)一步研究了乳糖和葡萄糖冷凍保存紅細(xì)胞的機(jī)理[34-36]。不過(guò)1964年，Pert等人應(yīng)美國(guó)紅十字會(huì)的要求在對(duì)比乳糖&葡萄糖、PVP和甘油液氮冷凍紅細(xì)胞效果的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)乳糖對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性，隨后Rinfret等人便建議放棄推廣乳糖&葡萄糖方案[37,38]。1965年，Strumia等人還深入研究了一個(gè)之前偶然發(fā)現(xiàn)的有意思的現(xiàn)象，即如果提前使用5%～15%的乳糖先孵育5 min紅細(xì)胞后離心去上清，再添加24%白蛋白或者20% Dextran（葡聚糖，MW 40 kDa）在-73℃干冰乙醇浴中冷凍，最后可獲得98%以上的冷凍存活率，60%～70%的24 h體內(nèi)存活率?？墒侨绻^(guò)乳糖預(yù)孵育步驟，雖然最后冷凍存活率也很高，但24 h體內(nèi)存活率會(huì)迅速降低到僅剩20%～40%[39,40]。

1955年，Bricka等人首次報(bào)道了PVP和Dextran在紅細(xì)胞冷凍保存中的應(yīng)用，后續(xù)也有一些人跟進(jìn)但還處于摸索階段[41-43]。1960～1962年，Rinfret等人意識(shí)到冷凍和復(fù)溫過(guò)程中傳熱速率的重要性，開(kāi)始有針對(duì)性地設(shè)計(jì)了能夠在液氮中快速傳熱的300 mL波浪紋理鋁盒，并用該鋁盒證明了PVP液氮冷凍方案相比乳糖&葡萄糖-78℃干冰乙醇方案有更好的保存效果[44,45]。1964年，Rinfret等人又從避免使用任何滲透性溶質(zhì)（如甘油、DMSO和葡萄糖等）的角度出發(fā)，專門(mén)針對(duì)PVP設(shè)計(jì)了多種適用于臨床的紅細(xì)胞液氮冷凍保存的程序[46]。1965年，Rinfret等人還在保護(hù)劑中增加了白蛋白并降低了PVP濃度，最終PVP（14%）-白蛋白（3%）-液氮冷凍保存方案可獲得97%的冷凍存活率，復(fù)溫后允許直接輸注，但會(huì)出現(xiàn)10%～20%血管內(nèi)溶血的情況[17,38,47]。1968年，Krijnen等人重新評(píng)估了Rinfret的PVP-白蛋白-液氮冷凍方案[48]，雖然冷凍保存后的紅細(xì)胞胞內(nèi)包括ATP、乳酸、糖酵解酶、細(xì)胞膜脆性等多種指標(biāo)結(jié)果良好，但考慮到PVP在洗滌過(guò)程中偶爾會(huì)造成過(guò)高濃度的游離血紅蛋白，以及已被證明無(wú)法在人體內(nèi)代謝干凈（比如在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)），仍然推薦使用低濃度甘油結(jié)合液氮方法來(lái)冷凍保存紅細(xì)胞[25,49,50]。

其它非滲透性保護(hù)劑例如PEG（Polyethylene glycol，聚乙二醇）、Dextran、HES（Hydroxyethyl starch，羥乙基淀粉）等在早年也有諸多進(jìn)展到臨床實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。1962年，Sloviter等人在Nature報(bào)道了終濃度20%的PEG（MW 635 Da）在-79℃干冰乙醇浴中冷凍并使用10%蔗糖梯度洗滌的方案，不過(guò)冷凍洗滌回收率會(huì)受到紅細(xì)胞儲(chǔ)存天數(shù)的影響，但輸入人體內(nèi)紅細(xì)胞存活率普遍大于70%[51,52]。1965年，Verdier在研究使用終濃度15%的Dextran（MW 20 kDa）裝在12 mL鋁箔袋放入液氮中冷凍時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用肝素抗凝替代ACD抗凝后，相比Pert的PVP[37]、Strumia的乳糖&葡萄糖[34]冷凍存活率會(huì)更高[53]。1967年，Knorpp等人在Science上報(bào)道了使用終濃度15%的HES（MW 450 kDa）液氮冷凍方案，得到97%的冷凍存活率，并認(rèn)為HES相比PVP的優(yōu)點(diǎn)在于更有助患者體內(nèi)代謝，從而免去復(fù)溫后的洗滌處理[54]。

雖然臨床上本身就允許一些非滲透性保護(hù)劑在患者極度失血的情況下作為血容量替代物直接應(yīng)急輸入人體，比如PVP、Dextran、HES等[11]，但它們?cè)诩t細(xì)胞冷凍保存的應(yīng)用中仍存在一些質(zhì)疑。1976年，Allen等人通過(guò)液氮冷凍了400 mL壓積40%終濃度14% HES的紅細(xì)胞懸液，雖然也得到了97%的冷凍存活率以及大于80%的鹽水穩(wěn)定率（有關(guān)體外模擬血管內(nèi)溶血的實(shí)驗(yàn)），但通過(guò)電子顯微鏡觀察后發(fā)現(xiàn)HES本身就會(huì)對(duì)紅細(xì)胞膜造成輕微的損傷（可能會(huì)自愈），然而這種膜損傷會(huì)在冷凍后進(jìn)一步加大并不可逆轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致鉀離子丟失，而且受損的紅細(xì)胞也會(huì)釋放出部分游離血紅蛋白干擾冷凍后存活率的測(cè)量[55]。1978年，Allen等人在進(jìn)一步研究不同洗滌液洗滌經(jīng)14% HES冷凍過(guò)的紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)受損細(xì)胞表面會(huì)有胞內(nèi)物質(zhì)粘附，最終洗滌重懸后產(chǎn)生的血影細(xì)胞（Ghost cell）占總細(xì)胞數(shù)量的12%～14%，證明了之前其實(shí)是誤導(dǎo)性的過(guò)高冷凍存活率[56]。1983年，Williams等人認(rèn)為諸如PVP、Dextran、HES等濃縮聚合物會(huì)使細(xì)胞表面溶液的表面活性高于血紅蛋白，從而改變了細(xì)胞邊界處的界面能，形成血紅蛋白不易穿過(guò)的表界面，并掩蓋了膜缺陷，這種“創(chuàng)可貼效應(yīng)”會(huì)隨著輸血后聚合物被稀釋而消失，因此成功解釋了輸注聚合物冷凍過(guò)的紅細(xì)胞后發(fā)生血管內(nèi)溶血的問(wèn)題[57]。雖然Lionetti等人[58,59]、Thomas等人[60,61]、尤其是Sputtek等人[62-68]都通過(guò)使用HES冷凍紅細(xì)胞得到了很好的結(jié)果，甚至完成了輸注人體的臨床實(shí)驗(yàn)（比如Sputtek成功報(bào)道了經(jīng)11.5%HES液氮冷凍過(guò)的紅細(xì)胞無(wú)需洗滌即可直接輸回人體，冷凍復(fù)溫后的紅細(xì)胞鹽水穩(wěn)定率可達(dá)92%，輸回人體24 h后血漿中85%的HES可在體內(nèi)自行代謝消除），但最后還是發(fā)現(xiàn)了輸血后血漿中血紅蛋白濃度明顯升高的情況并仍面臨腎毒性的風(fēng)險(xiǎn)[68]。因此，直到目前為止如何有效預(yù)防由非滲透性保護(hù)劑帶來(lái)的膜損傷和隨后出現(xiàn)的血管內(nèi)溶血的問(wèn)題仍具有一定的挑戰(zhàn)性（可能添加血漿和血清蛋白會(huì)有用），而且這個(gè)問(wèn)題在紅細(xì)胞凍干過(guò)程中的干燥和補(bǔ)液環(huán)節(jié)中也同樣存在[17]。

2.2 紅細(xì)胞低溫保存的臨床應(yīng)用：通常紅細(xì)胞冷凍的方法可以分為三類：（1）使用中等濃度甘油（2～3 M）的中速冷凍；（2）使用高濃度甘油（4～5 M）的慢速冷凍；（3）使用非滲透性保護(hù)劑的快速冷凍[69]。使用非滲透性保護(hù)劑快速冷凍的設(shè)計(jì)目標(biāo)是能夠獲得保護(hù)劑和游離血紅蛋白濃度都足夠低的細(xì)胞懸浮液，從而可以無(wú)需洗滌直接輸入人體[69]。但從安全性角度出發(fā)，人們已經(jīng)禁止了這種連同保護(hù)劑和過(guò)高的游離血紅蛋白輸入人體的方案，所以臨床推廣冷凍紅細(xì)胞應(yīng)用方案的重點(diǎn)就放在如何去除高濃度甘油的方法研究上[69,70]?；仡欉^(guò)去臨床上曾建立起三種不同的方法用于冷凍保存紅細(xì)胞，也就是眾人熟知的“團(tuán)聚沉降法”、“低甘油快凍法”、“高甘油慢凍法”[8,71]。但在這三種方法之前Cohn ADL離心機(jī)的出現(xiàn)則是冷凍紅細(xì)胞走向臨床應(yīng)用的里程碑[72]。

1951年，Cohn等人提出如果想在臨床上大量使用冷凍紅細(xì)胞，就需要一個(gè)封閉自動(dòng)化的設(shè)備來(lái)解決手工去甘油過(guò)程中出現(xiàn)的操作過(guò)于繁瑣、無(wú)法保證無(wú)菌環(huán)境等問(wèn)題[73]。1954年，Tullis等人報(bào)道了使用Arthur D.Little公司開(kāi)發(fā)的基于Cohn血漿分離白蛋白程序的自動(dòng)化離心設(shè)備來(lái)專門(mén)去除甘油，整個(gè)系統(tǒng)被命名為Cohn ADL離心機(jī)（也叫Cohn分餾器）[74-76]。1956年，Tullis等人在Science上詳細(xì)介紹了這種由兩個(gè)離心碗組成的Cohn ADL離心機(jī)的工作原理，并在隨后幾年陸續(xù)開(kāi)展研究，比如在-80℃或-120℃冰箱以終濃度50%甘油保存紅細(xì)胞19個(gè)月后無(wú)異樣，冷凍洗滌回收率達(dá)80%以上，以及能在45～50 min內(nèi)完成添加甘油操作和在90～120 min內(nèi)完成去甘油操作等[77-80]。1960年前后，由于Cohn ADL離心機(jī)甘油冷凍技術(shù)的發(fā)展，迅速推動(dòng)了現(xiàn)代血站的建立，如Haynes等人在美國(guó)海軍醫(yī)院應(yīng)用該技術(shù)完成了向患者輸注超過(guò)1 014個(gè)單位的冷凍紅細(xì)胞，其中最長(zhǎng)的紅細(xì)胞冷凍時(shí)間為44個(gè)月[81-83]。不過(guò)由于其耗材成本高、儀器操作流程復(fù)雜、添加/去除甘油耗時(shí)較長(zhǎng)等問(wèn)題，該方法逐漸被拋棄[84]。1967年，Tullis報(bào)道了他和來(lái)自ADL公司的工程師Allan Latham（也稱為Jack）改進(jìn)后的可以實(shí)現(xiàn)血液成分分離、添加/去除甘油的離心碗，即著名的Latham離心碗[85,86]。1971年，Latham成立了美國(guó)血液技術(shù)公司Haemonetics，直至今天該公司仍以不斷創(chuàng)新的產(chǎn)品推動(dòng)著全球輸血行業(yè)的進(jìn)步。

“團(tuán)聚沉降法”由Huggins于1963年在Science上首次報(bào)道[87-89]。該方法先向濃縮紅細(xì)胞添加等體積含8%葡萄糖的8.6 M ECA溶液（ECA，Endocellular cryophylactic agents，最先使用的是DMSO，后來(lái)也用甘油或丙二醇替代）得到ECA終濃度為5.5 M的紅細(xì)胞懸液[90,91]，放在-85℃～-95℃冰箱冷凍，復(fù)溫后的洗滌是利用當(dāng)pH在5.2～6.1之間同時(shí)電解質(zhì)濃度低于0.02 M，血漿中的γ-球蛋白（也就是免疫球蛋白）會(huì)和紅細(xì)胞膜脂蛋白結(jié)合從而形成可逆可沉降的紅細(xì)胞團(tuán)聚體的原理，具體步驟是用10%葡萄糖溶液以1:8的比例稀釋紅細(xì)胞懸液并觸發(fā)團(tuán)聚沉降條件，去除上清后再用pH大于6.7的等滲電解質(zhì)溶液重懸從而完成洗滌[92,93]。該方法最大優(yōu)勢(shì)是可以免去離心機(jī)的使用，一個(gè)5站式細(xì)胞凝集器每小時(shí)可處理15個(gè)單位的冷凍紅細(xì)胞[91,94]。不過(guò)由于回收率較低（75%～85%）、溶液中需確保γ-球蛋白的存在、胞內(nèi)鉀離子容易流失等問(wèn)題，僅在1960年代廣泛使用[91,95]。1970年代，Sumida在日本引入了這種方法，并一直在評(píng)估該方法下紅細(xì)胞長(zhǎng)期儲(chǔ)存（超過(guò)30年）的穩(wěn)定性[96,97]。

“低甘油快凍法”最先源于1962年P(guān)ert在墨西哥城舉辦的國(guó)際會(huì)議上報(bào)道，可以使用低濃度甘油通過(guò)液氮快速冷凍的方式來(lái)提高紅細(xì)胞的冷凍回收率[37,98-101]。1964年，Krijnen等人綜合了Pert的低甘油快凍法的同時(shí)引入Cohen等人為去除冷凍血小板中的甘油而添加可以減緩滲透?jìng)Φ姆菨B透性山梨糖醇，并使用不銹鋼的扁平容器成功凍存1個(gè)單位的紅細(xì)胞，還提出可以使用特氟龍袋結(jié)合離心機(jī)的方法來(lái)縮短輸血前去甘油的時(shí)間[102,103]，并在隨后幾年陸續(xù)報(bào)道了該方法的一些研究結(jié)果[25,101,104]。1968年，Rowe等人在Krijnen基礎(chǔ)上用甘露醇替代了山梨糖醇，并通過(guò)超過(guò)350例臨床輸注實(shí)驗(yàn)證明了低甘油快凍法的安全性[105]。具體的Rowe方法是通過(guò)ACD采集500 mL全血后離心得到250 mL濃縮紅細(xì)胞，再等體積添加250 mL甘油保護(hù)劑溶液（其中甘油濃度用的是28% v/v，轉(zhuǎn)換成w/v約等于35%），均勻混合后甘油最終濃度為17.5%。隨后灌入容積約600 mL不銹鋼的扁平容器，直接放進(jìn)液氮中冷凍，2～3 min后存入液氮中。復(fù)溫使用42～45℃水浴快速?gòu)?fù)溫，完成后先離心再使用16%甘露醇（1次）-0.9% NaCl（2次）梯度洗滌方案洗滌，共消耗不到1 L洗滌液。最終該方法冷凍存活率達(dá)到97.3%，冷凍洗滌回收率達(dá)到95.7%[105]。

“高甘油慢凍法”最先源于Tullis的50%甘油Cohn ADL離心法[79,83]以及Huggins的5.5 M ECA團(tuán)聚法[90,91]（如果ECA選用甘油，5.5 M剛好也是50%），該兩種方法都使用了大于或者近似45%濃度的甘油或者DMSO，并且直接放在-80℃左右的冰箱里而不是干冰乙醇浴里來(lái)進(jìn)行慢速冷凍（當(dāng)甘油濃度達(dá)到40%～50%后就無(wú)需快速降溫或者控制降溫速度）[81,105,106]。1970年，Tuills等人證實(shí)了高甘油下的紅細(xì)胞在-80℃冷凍可以保存10年[107]。1972年，Meryman和Hornblower正式提出最經(jīng)典的高甘油慢凍法[84]，他們使用6.2 M甘油溶液并分兩步添加得到終濃度約35%的甘油化紅細(xì)胞懸液，放入-85℃冰箱慢速冷凍后再用37℃水浴復(fù)溫。洗滌過(guò)程為了改善高濃度甘油離心沉降特性差的問(wèn)題，同時(shí)減小洗滌前初始滲透壓差，他們使用12%（1次）-1.6% NaCl（1次）高滲鹽溶液代替前人的甘露醇或者乳酸鈉溶液進(jìn)行分步預(yù)稀釋，從而改變細(xì)胞密度促進(jìn)沉降，然后再利用ADL-Latham細(xì)胞洗滌系統(tǒng)按照1.6%（1次）-0.8%NaCl（1次，含2%葡萄糖）梯度洗滌方案洗滌，共消耗3 L多洗滌液，他們還從滲透極限的角度解釋了鹽溶液濃度選擇的理由。最終該方法冷凍存活率99.5%，冷凍洗滌回收率98.0%[69,84,108]。

1975年，來(lái)自美國(guó)海軍血液研究實(shí)驗(yàn)室的Valeri進(jìn)一步優(yōu)化了“低甘油快凍法”和“高甘油慢凍法”，并首次提出了可以將紅細(xì)胞復(fù)興液（也是由Valeri等人發(fā)明，并在1972年NEJM上報(bào)道，主要由丙酮酸、肌苷、葡萄糖、磷酸鹽和腺嘌呤等成分組成[109]）和冷凍保存相耦合的建議，還強(qiáng)調(diào)了甘油化前需要將紅細(xì)胞濃縮至90%的壓積（輸入人體內(nèi)也需濃縮至90%），最終得到人們廣為熟知的40%高甘油和20%低甘油的兩個(gè)濃度[110]。具體來(lái)說(shuō)，Valeri使用一步法將35%的甘油試劑制備成20%的甘油化紅細(xì)胞并使用液氮冷凍，然后在-150℃液氮蒸汽下儲(chǔ)存再用42℃水浴復(fù)溫，或者用兩步法將57%（6.2 M）的甘油保護(hù)劑制備成40%的甘油化紅細(xì)胞，然后在-80℃冰箱下冷凍儲(chǔ)存再用37℃水浴復(fù)溫。洗滌過(guò)程使用三種市售血液洗滌機(jī)，并強(qiáng)調(diào)了洗滌前先加入高滲溶液進(jìn)行平衡的重要性，但會(huì)因儀器不同選擇一步稀釋或者兩步稀釋，最后40%高甘油使用12%（稀釋）-1.6%（稀釋、洗滌）-0.9%（洗滌）NaCl梯度洗滌方案，耗費(fèi)2.2～3.2 L洗滌液，20%低甘油使用3.2%（稀釋、洗滌）-0.9%（洗滌）NaCl梯度洗滌方案，耗費(fèi)1.5～2.5 L洗滌液。上述所有方案紅細(xì)胞冷凍洗滌回收率都在90%以上，各項(xiàng)指標(biāo)諸如離子濃度、乳酸、ATP、2，3-DPG、嘌呤代謝、P50氧分壓等指標(biāo)無(wú)顯著差異，但發(fā)現(xiàn)低甘油方案在洗滌后儲(chǔ)存24 h溶血率方面比高甘油方案要略高[110]，類似的結(jié)論別人也曾報(bào)道過(guò)[111]。不過(guò)也有人發(fā)現(xiàn)在-196℃冷凍的紅細(xì)胞的滲透脆性曲線大多在正常范圍內(nèi)，而在-65℃～-80℃冷凍的紅細(xì)胞則會(huì)偏離正常范圍[112]。1976年，Meryman和Hornblower還針對(duì)鐮狀紅細(xì)胞調(diào)整了標(biāo)準(zhǔn)的去甘油化操作，避免洗滌過(guò)程出現(xiàn)過(guò)高的溶血[113]。

目前低甘油快凍普遍在歐洲使用，高甘油慢凍普遍在美國(guó)和加拿大使用[8]。我國(guó)以高甘油慢凍為主，因?yàn)楦吒视吐齼霾恍枰厥獾睦鋬龌蛘呓鈨龅脑O(shè)備，也無(wú)需金屬容器或者特制塑料，可以放在干冰中進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸（40%甘油化紅細(xì)胞可以承受-20℃～-85℃溫度波動(dòng)，這一點(diǎn)相對(duì)20%甘油液氮?dú)庀啻鎯?chǔ)優(yōu)勢(shì)尤為明顯[114,115]），但缺點(diǎn)是難以保證在不損失過(guò)量紅細(xì)胞的前提下又能在合理的時(shí)間以合理的成本添加和去除高濃度甘油[84]。低甘油快凍的主要優(yōu)勢(shì)就是操作簡(jiǎn)單、多功能性以及具有一定適應(yīng)變化的能力[116]。不管低甘油快凍還是高甘油慢凍，采血后6天內(nèi)需要完成甘油化冷凍操作（文獻(xiàn)中建議10天以內(nèi)，最好5～6天，在此時(shí)間段可以維持最佳的紅細(xì)胞ATP、2，3-DPG、Na+、K+等代謝水平[117,118]），可以確定的是該兩種方法冷凍洗滌后的紅細(xì)胞質(zhì)量均符合美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)AABB制定的輸血安全標(biāo)準(zhǔn)，即去甘油化后的紅細(xì)胞回收率達(dá)到80%以上，輸血后24 h體內(nèi)存活率75%以上[114]。通常醫(yī)務(wù)人員手工解凍去甘油時(shí)，由于處于開(kāi)放系統(tǒng)，存在細(xì)菌污染的可能，因此美國(guó)FDA規(guī)定去甘油化的紅細(xì)胞需要在24 h內(nèi)輸入人體，但如果用封閉耗材配合機(jī)器自動(dòng)化去除則可以延長(zhǎng)至2周[114]。2001年，美國(guó)血液技術(shù)公司聯(lián)合美國(guó)海軍血液研究實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的專門(mén)用于紅細(xì)胞添加/去除甘油的自動(dòng)化儀器ACP-215上市，該系統(tǒng)配套無(wú)菌連接器和耗材（內(nèi)有外部密封的一次性聚碳酸酯離心碗，內(nèi)聯(lián)0.22 μm過(guò)濾器），并裝有一套光學(xué)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)去甘油化時(shí)廢液中游離血紅蛋白濃度來(lái)確保紅細(xì)胞質(zhì)量[119]。同樣在2001年，Valeri等人對(duì)ACP 215添加和去除甘油后的紅細(xì)胞質(zhì)量做了全面的研究，認(rèn)為經(jīng)過(guò)ACP 215洗滌過(guò)的紅細(xì)胞在4℃下AS-3保存液中可以延長(zhǎng)保存至15天，輸血后24 h體內(nèi)存活率77±9%，1個(gè)單位的紅細(xì)胞冷凍洗滌回收率87±5%（國(guó)外血站采1個(gè)單位全血通常按照450-500 mL計(jì)算[7,14,114]，其中ACP 215的275 mL離心碗最大洗滌純紅細(xì)胞的量為180 mL）[120]。雖然ACP 215是按照高甘油慢凍法研發(fā)的，但它同樣可以處理低甘油快凍法冷凍的紅細(xì)胞[111]，只不過(guò)由于凍存裝置是鋁盒，因此無(wú)法無(wú)菌連接，解凍去甘油后的儲(chǔ)存時(shí)間仍然是24 h。但是考慮到從冰箱取出后再?gòu)?fù)溫洗滌，通常要耗時(shí)2 h（1個(gè)單位的冷凍紅細(xì)胞在42℃水浴融化需要45 min，ACP 215洗滌1個(gè)單位紅細(xì)胞需要55～57 min，以及其它一些表格文書(shū)的準(zhǔn)備[14,94,121,122]），加上血站實(shí)際使用ACP 215操作時(shí)洗滌回收率偶爾只有75%，因此在面對(duì)一些緊急情況下的應(yīng)急輸血挑戰(zhàn)時(shí)，簡(jiǎn)化去甘油流程、縮短洗滌時(shí)間等仍具有重要研究意義。

3 紅細(xì)胞低溫保存機(jī)理 生物細(xì)胞在低溫下代謝會(huì)減緩，甚至停止，尤其在-150℃以下，幾乎所有的生物學(xué)行為或者物理化學(xué)變化都將不再進(jìn)行[123]。令人驚訝的是，細(xì)胞本身是能夠承受住深低溫的環(huán)境并能長(zhǎng)久存活，而真正的低溫?fù)p傷主要來(lái)源于添加和去除保護(hù)劑過(guò)程中的滲透損傷，冷凍過(guò)程中的溶液損傷和胞內(nèi)冰損傷，復(fù)溫過(guò)程中的重結(jié)晶損傷等[124]。而決定細(xì)胞保存成功因素，主要取決于保護(hù)劑的濃度和種類、降溫和復(fù)溫的速率、細(xì)胞的濃度、儲(chǔ)存的溫度、保護(hù)劑的添加以及復(fù)溫后去除的方法等[6,125,126]。

3.1 保護(hù)劑引起的滲透性變化：成熟的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核和細(xì)胞器，形態(tài)呈雙凹盤(pán)狀，直徑6～8 μm，厚度1.5～2.5 μm，體積80～100 fL，生命周期120天，胞內(nèi)有大量的負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣的血紅蛋白，其比例占紅細(xì)胞干重的95%[11,127]。雙凹型的結(jié)構(gòu)使得紅細(xì)胞表面積與體積之比較大，利于氧氣的吸收和運(yùn)輸，也利于紅細(xì)胞形變從而能夠通過(guò)狹窄的毛細(xì)血管（最窄2～3 μm）[128]。但人們?nèi)菀缀雎缘氖?，紅細(xì)胞膜上存在大量的專門(mén)負(fù)責(zé)紅細(xì)胞跨膜水輸運(yùn)的水通道蛋白，因此紅細(xì)胞相比其它細(xì)胞對(duì)水具有更高的滲透性[129]。1992年，Agre等人在Science上報(bào)道了將紅細(xì)胞膜上的水通道蛋白通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的方式注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞后，放入低滲溶液中細(xì)胞體積會(huì)立刻增大的現(xiàn)象，從而證明了紅細(xì)胞膜上存在專門(mén)的通道使得水可以快速進(jìn)入紅細(xì)胞[130]。在低溫生物學(xué)里的跨膜輸運(yùn)模型中有專門(mén)描述細(xì)胞膜對(duì)水滲透性的參數(shù)Lp（Hydraulic conductivity），人成熟紅細(xì)胞的Lp在8.19～23.8 μm/min/atm[131]，人MII期（MetaphaseⅡ，中期Ⅱ）成熟卵母細(xì)胞的Lp在0.24～1.25 μm/min/atm[132]，前者明顯大于后者一個(gè)數(shù)量級(jí)。雖然甘油也能滲透進(jìn)紅細(xì)胞，但是紅細(xì)胞對(duì)水的滲透性是甘油的3 000倍，此外細(xì)胞膜一般對(duì)NaCl是不可滲透的[133-135]。從水和甘油穿過(guò)紅細(xì)胞膜的時(shí)間尺度上看，水穿過(guò)紅細(xì)胞膜是毫秒級(jí)，而甘油則需要幾秒（時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)受到環(huán)境溫度和pH值影響），因此添加或者去除甘油時(shí)，一旦懸浮液中甘油濃度發(fā)生變化，瞬時(shí)的滲透壓對(duì)細(xì)胞體積的影響是可以預(yù)見(jiàn)的[84]。

關(guān)于由保護(hù)劑引起的細(xì)胞滲透性變化過(guò)程，這里以甘油舉例說(shuō)明。在向等滲紅細(xì)胞懸液添加甘油時(shí)，由于胞外滲透壓瞬間增高，為了保持胞內(nèi)外化學(xué)勢(shì)平衡，跨膜輸運(yùn)能力更強(qiáng)的水會(huì)先從胞內(nèi)跑到胞外，細(xì)胞內(nèi)水分減少，細(xì)胞體積變小，電解質(zhì)濃度增加。此時(shí)胞內(nèi)是超高滲電解質(zhì)，胞外是高滲甘油和等滲電解質(zhì)，達(dá)到初步平衡。但由于甘油是滲透性的，對(duì)于甘油來(lái)說(shuō)其胞內(nèi)外化學(xué)勢(shì)并沒(méi)有達(dá)到平衡，因此甘油會(huì)逐漸進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞體積逐漸恢復(fù)，電解質(zhì)濃度逐漸降低。當(dāng)細(xì)胞體積恢復(fù)為原體積時(shí)，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)恢復(fù)等滲，胞內(nèi)甘油濃度和胞外濃度相等，化學(xué)勢(shì)最終達(dá)到平衡。如果胞外存在非滲透性保護(hù)劑，細(xì)胞內(nèi)水將同樣跑到胞外，細(xì)胞體積收縮，但不會(huì)再恢復(fù)到原來(lái)的體積，因?yàn)橹挥羞@樣濃度不斷提高的胞內(nèi)電解質(zhì)的滲透壓才會(huì)達(dá)到和胞外非滲透性保護(hù)劑外加等滲電解質(zhì)的滲透壓相同的程度。換言之，胞外非滲透性溶質(zhì)決定了細(xì)胞的最終體積（其實(shí)嚴(yán)格意義上說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)甘油所占的體積也對(duì)細(xì)胞最終體積有很小的貢獻(xiàn)[134]）。去除保護(hù)劑的過(guò)程本質(zhì)上也是化學(xué)勢(shì)平衡的過(guò)程，體積變化方面和添加過(guò)程相反，先膨脹后收縮，期間伴隨著水先進(jìn)入后離開(kāi)的過(guò)程[136]。

不管細(xì)胞收縮還是膨脹都有其耐受極限，超過(guò)該極限細(xì)胞就會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的傷害。對(duì)紅細(xì)胞來(lái)說(shuō)，其可承受的滲透極限是等滲的0.5～0.75倍到4～5倍[84,134,135,137]，也有報(bào)道說(shuō)紅細(xì)胞最大可承受胞外滲透壓范圍在1 800～2 000 mOsm/kg，否則會(huì)發(fā)生陽(yáng)離子泄漏[138-140]。滲透損傷在去除保護(hù)劑過(guò)程中會(huì)比在添加保護(hù)劑時(shí)更嚴(yán)重，因?yàn)樗M(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞膨脹比水流出細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞收縮更敏感[141]。通?？梢允褂枚嗖教荻忍砑?去除保護(hù)劑的方法降低滲透損傷，使得細(xì)胞體積遠(yuǎn)離體積極限[142]。比如1972年，Meryman報(bào)道的“高甘油慢凍法”中第1次稀釋液之所以選擇150 mL的12%的NaCl溶液，一方面是因?yàn)?2%的NaCl溶液滲透壓剛好是甘油化紅細(xì)胞懸液滲透壓（約25倍等滲）的0.5倍，從而確保細(xì)胞體積不過(guò)度膨脹，另一方面選擇150 mL添加到650 mL的甘油化紅細(xì)胞懸液，是因?yàn)榛旌虾笃浞菨B透性溶質(zhì)（NaCl為不可滲透）為等滲的3.5倍，從而確保細(xì)胞體積不過(guò)分收縮，此外還相對(duì)減小了下一次稀釋的初始體積，提高了細(xì)胞對(duì)低滲溶液的耐受性[84]。

3.2 冷凍過(guò)程中的低溫?fù)p傷：最早人們將冷凍紅細(xì)胞導(dǎo)致的溶血?dú)w因于尖銳的冰晶對(duì)紅細(xì)胞膜的機(jī)械破壞，顯然這也是人們最容易聯(lián)想到的[18,143,144]。1953年，Lovelock認(rèn)為冷凍過(guò)程中溶液形成的冰晶本身對(duì)紅細(xì)胞并無(wú)傷害，他觀察到不管甘油濃度或者冷凍溫度如何變化，只要胞內(nèi)外電解質(zhì)濃度超過(guò)0.8 M就會(huì)發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象，這和將細(xì)胞懸浮在大于0.8 M NaCl溶液后再轉(zhuǎn)移到等滲鹽水中發(fā)生的溶血現(xiàn)象一致，因此他認(rèn)為造成冷凍溶血的主要原因是由于水逐漸變成冰導(dǎo)致胞內(nèi)外的電解質(zhì)濃度過(guò)高（也稱為電解質(zhì)鹽損傷），該損傷通常會(huì)在-3 ℃～-40℃之間發(fā)生，所以在冷凍時(shí)需要快速通過(guò)該溫區(qū)[145,146]。1960～1962年，Struma報(bào)道了當(dāng)溫度降低到-3℃以下時(shí)超過(guò)82%的水會(huì)結(jié)冰，此時(shí)殘余溶液中電解質(zhì)鹽濃度將提高至0.85 M[34,125]，根據(jù)他們的經(jīng)驗(yàn)紅細(xì)胞最大可承受氯化鈉濃度為0.75 M，如果濃度上升至0.85 M時(shí)會(huì)發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害，比如表面脂質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)受損或者變性[36,147]。1968年，Meryman曾在Nature上否定了Lovelock的鹽濃度低溫?fù)p傷理論，他認(rèn)為在慢速冷凍過(guò)程中紅細(xì)胞發(fā)生的溶血并非由高濃度電解質(zhì)本身造成，而是因?yàn)闈舛炔粩嗵岣叩碾娊赓|(zhì)（0.8 M以上）引起過(guò)高滲透壓導(dǎo)致紅細(xì)胞無(wú)法通過(guò)無(wú)限制地縮小體積達(dá)到滲透性平衡，從而在紅細(xì)胞膜內(nèi)外形成靜態(tài)滲透壓差造成溶血[137]。隨后1970～1977年，Meryman提出細(xì)胞最小體積假說(shuō)理論，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明膜性質(zhì)的改變是冷凍損傷的主要原因[148-152]。同一時(shí)期1968～1970年，Zade-Oppen在研究高滲溶血機(jī)制時(shí)得到了和Meryman幾乎一致的結(jié)論[153-155]。1976年，Pegg認(rèn)為Meryman靜態(tài)滲透壓差的理論并不合理，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度過(guò)高時(shí)胞內(nèi)溶液將變?yōu)榉抢硐肴芤?，因此僅需要極小的水流即可保持膜兩側(cè)水活度相等，但冷凍過(guò)程中膜損壞導(dǎo)致陽(yáng)離子泄漏已成不爭(zhēng)的事實(shí)[141]。此外，Pegg建議可以補(bǔ)充Lovelock關(guān)于紅細(xì)胞熱休克的機(jī)理來(lái)解釋慢速冷凍下高滲鹽溶液對(duì)紅細(xì)胞的損傷，比如高滲溶液會(huì)洗脫紅細(xì)胞膜上熔點(diǎn)較低的卵磷脂，降低了膜上磷脂和膽固醇的相對(duì)比例，導(dǎo)致細(xì)胞膜柔軟性變差，從而更容易受熱應(yīng)力影響發(fā)生溶血[156,157]。1973年，F(xiàn)arrant等人也同樣強(qiáng)調(diào)了熱休克對(duì)紅細(xì)胞在冷凍過(guò)程中的損傷作用[158,159]。1979年，Araki通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了紅細(xì)胞在濃鹽水和緩慢冷凍中會(huì)釋放富含膽固醇的囊泡，從而強(qiáng)力支持了Pegg的觀點(diǎn)[160]。1980年，Williams等人認(rèn)為紅細(xì)胞的溶血還是取決于是否超過(guò)最小體積，而不是細(xì)胞內(nèi)外的電解質(zhì)濃度，熱休克引發(fā)的溶血也與細(xì)胞體積的減小有關(guān)[161]。1981年，Mazur等人認(rèn)為慢速冷凍下的紅細(xì)胞是否存活更多地取決于未凍結(jié)水的比例，而NaCl濃度的增加僅為次要作用，因?yàn)槔鋬鲞^(guò)程中未凍結(jié)通道的縮窄和減少不僅增加了細(xì)胞與通道邊界冰晶之間相互作用的機(jī)會(huì)，還增加了細(xì)胞間相互作用的機(jī)會(huì)，這些應(yīng)力（比如剪切力、細(xì)胞形變）會(huì)直接損失低溫下已經(jīng)變脆的細(xì)胞膜[134]。1983～1989年，Mazur等人還針對(duì)未凍結(jié)比例假說(shuō)補(bǔ)充討論了慢速?gòu)?fù)溫、細(xì)胞壓積、等滲重平衡等條件改變后的一些影響[135,162,163]。1988～1991年，Pegg和Diaper認(rèn)為將體積減小到單個(gè)臨界極限值并不是慢速冷凍損傷的根本原因，而應(yīng)該考慮到融化（再膨脹）階段發(fā)生的質(zhì)膜暫時(shí)性泄漏。他們還通過(guò)透析實(shí)驗(yàn)針對(duì)Mazur等人的未凍結(jié)比例假說(shuō)進(jìn)行討論，認(rèn)為Mazur等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)際上是初始非等滲溶液下引起細(xì)胞體積的不同而造成的表面現(xiàn)象，尤其是這些細(xì)胞對(duì)隨后冷凍和融化的敏感性不同，比如收縮的細(xì)胞更具抵抗力，而溶脹的細(xì)胞更脆弱，因此慢速冷凍損傷仍可以歸因于冷凍復(fù)溫過(guò)程中的溶液成分變化[164-166]。

以上討論都是在慢速冷凍條件下開(kāi)展的，過(guò)去對(duì)慢速冷凍的定義就是冰晶全部在細(xì)胞之外形成[141,167]。但對(duì)于快速冷凍來(lái)說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)將不可避免的出現(xiàn)胞內(nèi)冰，因此由胞內(nèi)冰給細(xì)胞帶來(lái)的機(jī)械損傷以及如何控制細(xì)胞內(nèi)冰晶尺寸足夠小就成為快速冷凍成功與否的決定性因素[167]。1962年，Strumia就曾指出冰晶尺寸比冰晶數(shù)量在對(duì)紅細(xì)胞傷害方面要嚴(yán)重的多，另外冰晶大小和數(shù)量取決于降溫速率，更快的降溫速率會(huì)產(chǎn)生尺寸更小數(shù)量更多的冰晶，當(dāng)溫度降到-130℃左右時(shí)冰晶便停止生長(zhǎng)[36,168,169]。1972年，Diller通過(guò)低溫顯微鏡給出了紅細(xì)胞冷凍過(guò)程中的胞內(nèi)冰形成與降溫速率直接相關(guān)的證據(jù)，比如當(dāng)降溫速率小于6℃/min時(shí)，胞內(nèi)冰生成的概率為0%，一旦大于17℃/min時(shí)，胞內(nèi)冰概率就上升到100%[170]。1976年，Nei通過(guò)電子顯微鏡研究了不同降溫速率和不同甘油濃度下胞內(nèi)冰的形成以及細(xì)胞膜形態(tài)在冷凍過(guò)程中的變化[171,172]。1981年，F(xiàn)ujikawa在快速冷凍紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，給出了胞內(nèi)冰的出現(xiàn)和生長(zhǎng)會(huì)直接破壞磷脂雙分子層中間疏水層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損的冷凍蝕刻的電子顯微照片[173]。1984年，Pegg等人也通過(guò)冷凍斷裂實(shí)驗(yàn)，在不同降溫速率下同樣也給出了不含或者含2 M甘油下胞內(nèi)冰的電子顯微照片，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)降溫速率大于200℃/min后，原本無(wú)胞內(nèi)冰出現(xiàn)的2 M甘油也會(huì)出現(xiàn)細(xì)小冰晶，對(duì)應(yīng)的冷凍存活率也隨之下降[174]。

3.3 降溫速率與兩因素假說(shuō)：1970年，Mazur在Science上發(fā)表了一篇綜述，整理了前人研究不同細(xì)胞的冷凍存活率和降溫速率之間的關(guān)系，最早向世人呈現(xiàn)了低溫生物學(xué)中最經(jīng)典的“倒U型”存活率曲線[175,176]。1972年，Mazur等人正式提出了低溫生物學(xué)中最負(fù)盛名的兩因素低溫?fù)p傷假說(shuō)，該假說(shuō)指出如果降溫速率過(guò)慢，細(xì)胞內(nèi)的水分全部流出胞外，細(xì)胞體積過(guò)度收縮，胞內(nèi)溶質(zhì)濃度過(guò)高，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液下會(huì)受到傷害，稱為溶液損傷（Solution effect）。如果降溫速率過(guò)快，細(xì)胞內(nèi)的水分來(lái)不及流出胞外，就會(huì)發(fā)生胞內(nèi)冰現(xiàn)象，并且在復(fù)溫過(guò)程中存在重結(jié)晶的隱患，稱為胞內(nèi)冰損傷（Intracellular ice formation effect）[177]。過(guò)快或者過(guò)慢的降溫速率對(duì)細(xì)胞冷凍都是不利的，因此就存在最佳降溫速率。在最佳降溫速率下，細(xì)胞體積收縮適當(dāng)，胞內(nèi)電解質(zhì)濃度雖有提高但還在細(xì)胞可承受范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的水分又不足以產(chǎn)生致命的胞內(nèi)冰，從而確保了細(xì)胞經(jīng)過(guò)冷凍后能夠獲得最高的存活率[124]。

其實(shí)降溫速率本質(zhì)上控制的是胞內(nèi)未凍結(jié)水（也叫過(guò)冷水）的量，而未凍結(jié)水離開(kāi)細(xì)胞的速率則取決于細(xì)胞膜對(duì)水的滲透性。以紅細(xì)胞和酵母為例，前者有很高的水滲透性，后者則較低。因此在不含任何低溫保護(hù)劑情況下，前者最佳降溫速率（2 500～3 000℃/min[176]）遠(yuǎn)大于后者（10℃/min[176,178]）。1963年，Mazur在討論冷凍過(guò)程中水傳輸模型時(shí)就曾預(yù)計(jì)無(wú)保護(hù)劑下的紅細(xì)胞最佳降溫速率在2 500～5 000℃/min，因?yàn)閺哪Ｐ头抡娴慕Y(jié)果可以看出大于5 000℃/min的降溫速率會(huì)導(dǎo)致當(dāng)溫度降到-10℃（過(guò)冷10℃即可結(jié)冰）時(shí)紅細(xì)胞內(nèi)還殘留大量的過(guò)冷水，從而存在胞內(nèi)冰生成的風(fēng)險(xiǎn)[179,180]。1968年，Rapatz等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了紅細(xì)胞的“倒U型”存活率曲線，測(cè)試了僅使用ACD抗凝劑、降溫速率從1～15 000℃/min下全血紅細(xì)胞的存活率，發(fā)現(xiàn)在1 600～3 500℃/min區(qū)間紅細(xì)胞存活率達(dá)到最高60%～67%[180]。類似的1981年，F(xiàn)ujikawa也測(cè)試了僅使用等滲生理鹽水、降溫速率從3～11 500℃/min下紅細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)3 500℃/min下存活率達(dá)到最高50%，再次呈現(xiàn)“倒U型”存活率曲線。此外他還通過(guò)掃描電鏡證明了不同的降溫速率會(huì)影響紅細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)，比如當(dāng)降溫速率越慢，細(xì)胞膜外出現(xiàn)無(wú)膜顆粒的囊泡斑塊將越大，降溫速率越快，膜內(nèi)出現(xiàn)由胞內(nèi)冰導(dǎo)致的類似蟲(chóng)噬的斑點(diǎn)越多，而膜結(jié)構(gòu)的改變與凍后溶血程度密切相關(guān)[173]。需要補(bǔ)充說(shuō)明的是，ACD中由于葡萄糖的存在或者全血中由于血漿蛋白的存在相比僅用生理鹽水將明顯提高無(wú)保護(hù)劑下不同降溫速率下紅細(xì)胞的冷凍存活率[181]。雖然在不含保護(hù)劑的情況下仍有紅細(xì)胞能夠幸存，但有證據(jù)表明冷凍和復(fù)溫過(guò)程中膜的滲透性會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致紅細(xì)胞原本低鈉高鉀的胞內(nèi)環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)楦哜c低鉀，紅細(xì)胞仍遭受了低溫?fù)p傷[151]。

如果降溫速率繼續(xù)往上提升至大于10 000℃/min的水平時(shí)，無(wú)保護(hù)劑紅細(xì)胞的冷凍存活率會(huì)反彈，因?yàn)榇藭r(shí)的降溫速率已不屬于兩因素假說(shuō)范疇，而是接近玻璃化，Luyet薄膜凍存牛紅細(xì)胞以及Meryman液滴液氮冷凍ACD全血應(yīng)屬于此類，后者存活率可達(dá)80%～85%（如果再添加6.5%葡萄糖，存活率可達(dá)97%～98%）[15,167]。同樣的，Huntsman也給出了液滴液氮冷凍ACD紅細(xì)胞80%～90%的冷凍存活率數(shù)據(jù)，他也強(qiáng)調(diào)了ACD里面含有少量的葡萄糖會(huì)比使用無(wú)葡萄糖的EDTA更利于紅細(xì)胞冷凍存活率的提升[182]。

降溫速率的重要性不僅體現(xiàn)在無(wú)保護(hù)劑冷凍上，對(duì)已添加保護(hù)劑的紅細(xì)胞來(lái)說(shuō)，如果保護(hù)劑濃度和降溫速率不匹配，紅細(xì)胞的冷凍存活率也將受到很大影響。以人們最熟知的甘油為例，仍參考1968年Rapatz的報(bào)道，其中10%的甘油在5～150℃/min降溫速率區(qū)間最高存活率可達(dá)97%，如果降溫速率不在這個(gè)區(qū)間，尤其是不斷地提高降溫速率，存活率會(huì)迅速下降，比如添加10%甘油的存活率在1 600～2 000℃/min時(shí)甚至明顯低于沒(méi)有添加甘油的冷凍組，當(dāng)在3 500～15 000℃/min時(shí)存活率僅剩5%～15%[180]。類似的，Chaplin、Krijnen和Meryman等人在臨床上也發(fā)現(xiàn)降溫速率和甘油濃度不匹配（比如過(guò)高）導(dǎo)致存活率下降的現(xiàn)象[25,28,84]，Morris、Miller以及Scheiwe等人也給出了含一定濃度甘油的紅細(xì)胞隨著降溫速率提升冷凍存活率下降的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[181,183,184]，并且他們都將其歸因于胞內(nèi)冰[175,179]，這與Nei以及Pegg等人給出的胞內(nèi)冰顯微照片結(jié)果一致[171,172,174]。回顧臨床冷凍方案，20%低甘油快凍法使用液氮冷凍的降溫速率≈100℃/min，40%高甘油慢凍法使用-80℃冰箱冷凍的降溫速率≈1℃/min[11,94]，也可以看出隨著甘油濃度增加，最佳降溫速率也在逐漸降低。但對(duì)于非滲透性保護(hù)劑來(lái)說(shuō)，最佳降溫速率貌似不會(huì)受到保護(hù)劑濃度的影響。繼續(xù)參考1968年Rapatz中10%的Dextran（原文中寫(xiě)的是Dextrose，這里應(yīng)該理解為Dextran而不是Glucose[11]）冷凍紅細(xì)胞，最佳降溫速率在2 300～3 500℃/min，存活率最高達(dá)90%，和無(wú)保護(hù)劑下的紅細(xì)胞最佳降溫速率溫區(qū)1 600～3 500℃/min基本一致，而且全降溫速率范圍下的存活率都有提升，但仍不及滲透性保護(hù)劑在最佳降溫速率下的最高存活率[180]。雖然非滲透性保護(hù)劑更適合快速冷凍，但也出現(xiàn)過(guò)例外的案例，比如40% PVP，不管降溫速率是慢還是快對(duì)紅細(xì)胞冷凍而言都可以獲得較高水平的冷凍存活率[181]，甚至也有報(bào)道說(shuō)PVP可以在慢速冷凍下達(dá)到95%的冷凍存活率[41,44]。

3.4 低溫保護(hù)劑保護(hù)機(jī)理：對(duì)紅細(xì)胞來(lái)說(shuō)甘油還是首選的低溫保護(hù)劑，也是公認(rèn)的無(wú)毒滲透性添加劑，而DMSO的主要缺點(diǎn)是其可能的毒性（大于1 M）[17,125]。甘油可以束縛住水，使其無(wú)法結(jié)晶，但仍可以作為溶劑使用，從而降低了電解質(zhì)濃度，減小慢速冷凍過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的傷害[167]。1954年，Lovelock通過(guò)定點(diǎn)降溫至-80℃的冷凍方式研究了十多種醇類、酰胺類、糖等中性低分子量溶質(zhì)對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用，并從溶液的依數(shù)性角度認(rèn)為保護(hù)劑必須滲透進(jìn)細(xì)胞才能給細(xì)胞提供保護(hù)，而且保護(hù)所需溶質(zhì)的摩爾濃度與其分子量成正比，并認(rèn)為最理想的保護(hù)劑就是甘油[185]。1962年，Doebbler等人通過(guò)快速冷凍的方式研究了二十多種糖類、醇類、聚合物等保護(hù)劑，認(rèn)為盡管保護(hù)水平取決于降溫和復(fù)溫條件，但是保護(hù)劑活性與保護(hù)劑提供的潛在氫鍵基團(tuán)濃度相關(guān)。他們認(rèn)為隨著冷凍進(jìn)行，游離水?dāng)?shù)量減少，假設(shè)紅細(xì)胞表面的一部分水和游離水不同，那么保護(hù)劑溶液中的氫鍵可以起到穩(wěn)定細(xì)胞水合表面的作用[186]。很多經(jīng)典的低溫保存類綜述詳細(xì)闡述了滲透性和非滲透性保護(hù)劑保護(hù)原理，現(xiàn)歸納總結(jié)如下[11,124,141,175,187-191]。

滲透性保護(hù)劑之所以能夠保護(hù)細(xì)胞，主要因?yàn)椋海?）能夠高度溶于水，有效降低凝固點(diǎn)并降低溶液化學(xué)勢(shì)，減小冰晶形成量；（2）能夠滲透進(jìn)細(xì)胞，降低冷凍過(guò)程中逐漸增高的電解質(zhì)濃度并防止細(xì)胞過(guò)分收縮；（3）具有粘度的滲透性保護(hù)劑溶液可以有效的保護(hù)細(xì)胞膜，防止細(xì)胞堆積造成機(jī)械損傷；（4）消除過(guò)冷現(xiàn)象以及降低共晶對(duì)細(xì)胞的傷害；（5）4～6 M高濃度下無(wú)毒，從而允許慢速降溫；（6）如果滲透性濃度較低，則需要提高降溫速率來(lái)防止胞內(nèi)冰形成。需要注意的是，滲透性保護(hù)劑的保護(hù)效果主要取決于保護(hù)劑與細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)的摩爾比，也就是依數(shù)性，即取決于物質(zhì)溶解的濃度而不取決于它們的性質(zhì)[124]。

非滲透性保護(hù)劑之所以能夠保護(hù)細(xì)胞，主要因?yàn)椋海?）冷凍前能夠促進(jìn)細(xì)胞脫水，降低冷凍過(guò)程中胞內(nèi)冰損傷的概率；（2）通常生效于快速冷凍過(guò)程中，擁有更強(qiáng)的和水分子形成氫鍵的能力，可以“固化”胞外溶液，抑制冰晶生長(zhǎng)并減小冰晶的尺寸，但對(duì)慢速冷凍保護(hù)能力有限，且依賴于快速?gòu)?fù)溫和深低溫儲(chǔ)存；（3）對(duì)細(xì)胞膜具有更好的保護(hù)作用，穩(wěn)定細(xì)胞膜表面大分子構(gòu)象；（4）具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以及更強(qiáng)的玻璃化能力，能夠穩(wěn)定玻璃體；（5）有利于降低洗滌過(guò)程中由低滲環(huán)境造成的溶血。需要注意的是，非滲透性保護(hù)劑通常分子量較高，因此溶液的總摩爾濃度遠(yuǎn)低于所需甘油基混合物中的摩爾濃度，凝固點(diǎn)降低程度較?。厅c(diǎn)為與溶解的溶質(zhì)的濃度成正比）[192]。

最簡(jiǎn)單的有關(guān)滲透性和非滲透性保護(hù)劑保護(hù)細(xì)胞的機(jī)理可以從防止胞內(nèi)冰形成的角度去理解，例如滲透性保護(hù)劑是通過(guò)滲透進(jìn)入細(xì)胞替代胞內(nèi)水來(lái)防止胞內(nèi)冰形成，而非滲透性保護(hù)劑是通過(guò)在胞外構(gòu)建高滲環(huán)境使得細(xì)胞脫水防止胞內(nèi)冰形成[193]。此外，不可以忽略的是，添加保護(hù)劑的意義除了在于進(jìn)一步提高存活率，更重要的是能將降溫速率控制到人們可方便操作的地步。

3.5 復(fù)溫、壓積及儲(chǔ)存等：關(guān)于凍后復(fù)溫速率方面，紅細(xì)胞復(fù)溫過(guò)程通常使用37～45℃水浴復(fù)溫（復(fù)溫速率300～450℃/min[39,40,189,194]），屬于典型的快速?gòu)?fù)溫，也有報(bào)道說(shuō)紅細(xì)胞最高可以承受的溫度為42～43℃[84,192]，像之前討論的最佳降溫速率都是在快速?gòu)?fù)溫的前提下開(kāi)展的。對(duì)于高甘油慢凍來(lái)說(shuō)，復(fù)溫速率對(duì)存活率的影響并不重要，選擇快速?gòu)?fù)溫的目的只是為了減少融化過(guò)程消耗的時(shí)間，尤其在緊急情況下，哪怕20 min的復(fù)溫解凍時(shí)間都過(guò)長(zhǎng)[84,94]。因?yàn)楹徒禍剡^(guò)程類似，高濃度的甘油同樣可以限制復(fù)溫過(guò)程中冰晶的生長(zhǎng)。不過(guò)對(duì)于低甘油以及非滲透性保護(hù)劑快凍來(lái)說(shuō)，快速?gòu)?fù)溫通常是必備的。因?yàn)榭焖倮鋬鱿掳麅?nèi)冰較小，由于小冰晶熱力學(xué)相對(duì)不穩(wěn)定，很容易在復(fù)溫過(guò)程中發(fā)生重結(jié)晶進(jìn)而生長(zhǎng)成有害的大尺寸冰晶，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞的冷凍存活率下降[126,175,183]。1976年，Miller使用含2 M甘油的紅細(xì)胞并控制復(fù)溫速率從0.47℃/min上升到550℃/min，在600℃/min降溫速率下冷凍存活率從10%上升到70%，在180℃/min降溫速率下冷凍存活率從75%上升到90%，并認(rèn)為冷凍存活率對(duì)緩慢復(fù)溫的敏感性應(yīng)歸結(jié)于復(fù)溫期間的重結(jié)晶[183]。2014年，Deller在使用21.5%HES在-78℃干冰異丙醇浴冷凍紅細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在使用45℃水浴復(fù)溫后冷凍存活率有80%，但是23℃室溫復(fù)溫后冷凍存活率僅25%[195]。此外早在1958年，Meryman液滴液氮冷凍全血紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)水浴復(fù)溫溫度從37℃提升到45～48℃，存活率可以提升4%～5%，并且他在當(dāng)時(shí)就提到可以使用熱輻射或者微波輻射來(lái)提高復(fù)溫速率，但由于當(dāng)時(shí)的一些技術(shù)瓶頸，所以并未取得突破[167]。如今隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)涌現(xiàn)出各種成熟先進(jìn)的超快速?gòu)?fù)溫方法，比如基于納米顆粒的電磁/光熱復(fù)溫技術(shù)等，不過(guò)這些復(fù)溫技術(shù)還未曾在紅細(xì)胞冷凍中應(yīng)用報(bào)道過(guò)[196]。

值得一提的是，紅細(xì)胞復(fù)溫的速率一定要快并不是絕對(duì)的概念。1976年，Miller在研究不同復(fù)溫速率對(duì)紅細(xì)胞冷凍存活率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)有意思的現(xiàn)象：使用2 M甘油以0.27℃/min或者1.7℃/min冷凍紅細(xì)胞后再用1℃/min或者更慢的復(fù)溫速率處理后的冷凍存活率依然能到60%～80%，但如果使用160℃/min速率復(fù)溫，冷凍存活率會(huì)迅速降到只有19%[183]。類似的，1967年Meryman也報(bào)道過(guò)1 M甘油下以0.3℃/min冷凍紅細(xì)胞后再以0.3℃/min復(fù)溫比以30℃/min復(fù)溫能獲得更高的存活率，但是復(fù)溫速率改變對(duì)以10～30℃/min速率冷凍的紅細(xì)胞幾乎沒(méi)有影響[193]。1978年，Souzu等人也在定點(diǎn)慢速降溫下發(fā)現(xiàn)使用1.5 M和2 M甘油冷凍再對(duì)紅細(xì)胞慢速?gòu)?fù)溫，冷凍存活率存在提升現(xiàn)象，但復(fù)溫速率的改變對(duì)更低濃度的甘油幾乎無(wú)任何影響[126]。因此，慢速?gòu)?fù)溫只對(duì)慢速冷凍的紅細(xì)胞才會(huì)起到一定效果，換言之與慢速冷凍相關(guān)的傷害也就不能完全歸因于長(zhǎng)時(shí)間暴露于溶液效應(yīng)之中，可能的解釋是快速?gòu)?fù)溫帶來(lái)的滲透休克或者冷凍過(guò)程中溶質(zhì)加載或許對(duì)紅細(xì)胞的冷凍存活率也有影響[183, 190]。

紅細(xì)胞壓積或者紅細(xì)胞比容，可以間接反映紅細(xì)胞數(shù)量大小及體積，比如10%的紅細(xì)胞濃度大約為1000 million/mL（1×1012/L或者1 million/mm3）[197]。早在1950s～1960s期間人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞壓積越高，冷凍存活率越低的現(xiàn)象，而且壓積不同還會(huì)影響后續(xù)洗滌溶血水平[36,42,48,53]。1967～1968年，Nei在研究紅細(xì)胞（兔）-2℃～-10℃的冷凍存活率時(shí)就曾發(fā)現(xiàn)壓積較高的紅細(xì)胞（≈40%）比壓積較低的（≈4%）更容易溶血[198-200]。1981年，Pegg等人研究了不同壓積下（從4%到83%）使用2.5 M甘油冷凍紅細(xì)胞至-60℃～-65℃的溶血率變化數(shù)據(jù)（從1%上升到16%），其趨勢(shì)和Nei的結(jié)果一致，并且還將高壓積損害和器官冷凍聯(lián)系到一起[201]。同樣在1981年，Nei將該現(xiàn)象稱為“堆積效應(yīng)（Packing effect）”，并認(rèn)為可以通過(guò)提高甘油濃度來(lái)降低其影響，還用冷凍刻蝕電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有紅細(xì)胞會(huì)被限制在甘油網(wǎng)絡(luò)中并被具有粘性的甘油溶液覆蓋，從而保護(hù)細(xì)胞膜防止因過(guò)量細(xì)胞擠壓而遭受機(jī)械損傷[202]。1982年，Scheiwe等人使用自制毛細(xì)管研究HES冷凍紅細(xì)胞效果時(shí)也廣泛對(duì)比了不同壓積和降溫速率對(duì)紅細(xì)胞冷凍存活率的影響，其中在僅含PBS無(wú)HES添加下當(dāng)紅細(xì)胞壓積從4%提高到80%，在最佳降溫速率4 600～4 900℃/min下，冷凍存活率從76%降低到56%，而在使用18% HES后當(dāng)紅細(xì)胞壓積從15%提高到72%，在全范圍降溫速率下冷凍存活率從75%降低到55%。他們認(rèn)為壓積高的紅細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)向外流出更多的胞內(nèi)過(guò)冷水，稀釋降低了原本應(yīng)該升高的胞外電解質(zhì)濃度，從而縮小了胞內(nèi)外滲透差，導(dǎo)致胞內(nèi)水殘留并遭受胞內(nèi)冰損傷。另外，他們還發(fā)現(xiàn)由壓積升高引起的稀釋效應(yīng)會(huì)降低胞外HES濃度從而導(dǎo)致最佳降溫速率升高[184]。1983年，Pegg等人提出傳統(tǒng)兩因素假說(shuō)不適用于“堆積效應(yīng)”的解釋[203]。次年，Pegg等人在研究2 M甘油冷凍保存紅細(xì)胞時(shí)認(rèn)為“堆積效應(yīng)”應(yīng)歸因于未凍結(jié)液體通道過(guò)窄導(dǎo)致細(xì)胞堆積以及機(jī)械應(yīng)力的影響，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)冷卻速率超過(guò)100℃/min時(shí)，“堆積效應(yīng)”更依賴于降溫速率，因?yàn)榻禍厮俾试礁呶磧鼋Y(jié)液體通道數(shù)量和形態(tài)會(huì)變的更多且更窄，冷凍存活率也就越低；而當(dāng)降溫速率小于100℃/min時(shí)，“堆積效應(yīng)”更依賴于復(fù)溫速率，因?yàn)槁倮鋬鰧?dǎo)致的極窄通道可以通過(guò)提高復(fù)溫速率減小再結(jié)晶來(lái)降低其影響，冷凍存活率也就越高。此外，Pegg等人還發(fā)現(xiàn)在使用2 M甘油冷凍和100℃/min復(fù)溫速率時(shí)，紅細(xì)胞壓積若增高，最佳降溫速率就會(huì)降低的現(xiàn)象[174]。2000年，Wagner等人在研究100 mL大體積紅細(xì)胞慢速冷凍時(shí)認(rèn)為如果對(duì)細(xì)胞膜給予充分保護(hù)，則可以減弱甚至避免“堆積效應(yīng)”帶來(lái)的不利影響，該保護(hù)作用既可以由高濃度甘油也可以由不具冷凍保護(hù)作用的生化穩(wěn)定劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，此外這些由臨床藥物組成的生化穩(wěn)定劑還可以將甘油慢凍所需濃度從40%降低到20%，他們還認(rèn)為由壓積增大帶來(lái)的損傷并非是冷凍損傷而是細(xì)胞生化損傷[204]。

關(guān)于儲(chǔ)存溫度方面，高甘油慢凍法應(yīng)該儲(chǔ)存在-60℃～-80℃的機(jī)械冰箱里，低甘油快凍法應(yīng)該儲(chǔ)存在-140℃～-150℃液氮?dú)庀嘀?，美?guó)和歐盟都規(guī)定了這兩種方法保存時(shí)間為10年，后來(lái)更新過(guò)的歐盟標(biāo)準(zhǔn)甚至允許保存30年[6,114,205,206]。在已發(fā)表文獻(xiàn)中研究最長(zhǎng)的年限，-80℃冷凍為37年[13]，-196℃冷凍為19年[71,207]（其中冷凍儲(chǔ)存溫度在-165℃氣相液氮和-196℃液相液氮之間無(wú)差別），甚至Sumida曾大膽推測(cè)紅細(xì)胞在-80℃可以保存500～1000年，在-196℃可以保存10 000年[112]。不過(guò)需要注意的是，使用低甘油液氮冷凍之后的紅細(xì)胞不能再放回-80℃保存，因?yàn)樵究靸錾傻臒o(wú)害小冰晶會(huì)在-70℃～-80℃下繼續(xù)生長(zhǎng)變大，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞冷凍存活率下降[105,167]。類似的也有研究報(bào)道過(guò)在-150℃液氮?dú)庀嗬鋬霰４娴?0%甘油化紅細(xì)胞，由于運(yùn)輸過(guò)程中氣相溫度沒(méi)有控制好，在高于-120℃后發(fā)現(xiàn)了明顯的溶血現(xiàn)象[115]。1973年，Nei通過(guò)冷凍刻蝕實(shí)驗(yàn)證明了30%甘油冷凍的紅細(xì)胞在使用-150℃氟利昂快速冷凍后再浸入液氮，然后轉(zhuǎn)移至-80℃乙醇浴保存2個(gè)星期后，能夠清晰拍攝到紅細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)出冰晶的電子顯微照片[208]。1972年，Meryman和Hornblower報(bào)道高甘油慢凍法時(shí)也曾指出，在高于-60℃冷凍幾個(gè)星期后，紅細(xì)胞內(nèi)鉀離子水平并不讓人滿意[84]。更早1950s～1960s期間有人做過(guò)-45℃下冷凍儲(chǔ)存甘油化紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)存活率以每年損失5%遞增[209,210]，也有人發(fā)現(xiàn)用15%甘油在-15℃冷凍紅細(xì)胞后雖然冷凍存活率明顯低于在-79℃冷凍保存的紅細(xì)胞，可是存活下來(lái)的紅細(xì)胞仍能實(shí)現(xiàn)正常的體內(nèi)存活率[211]。與存儲(chǔ)溫度相關(guān)的另一個(gè)研究報(bào)道是，2000年Valeri等人先使用40%甘油將紅細(xì)胞冷凍到-80℃后再轉(zhuǎn)移到-40℃或者-20℃保存4周或者2周，然后再轉(zhuǎn)移回-80℃后再進(jìn)行復(fù)溫洗滌，發(fā)現(xiàn)仍能夠得到較理想的臨床輸血結(jié)果[212]。

除了以上提到的低溫保護(hù)劑、降溫速率、復(fù)溫速率、細(xì)胞濃度、儲(chǔ)存溫度等主要因素之外，還有其它一些細(xì)節(jié)因素也需要考慮到紅細(xì)胞冷凍保存之中，比如種冰以及共晶對(duì)紅細(xì)胞冷凍的影響，過(guò)冷度和胞內(nèi)冰之間的關(guān)系，不同形態(tài)細(xì)胞在冷凍過(guò)程中的差異，液體冷藏時(shí)間對(duì)冷凍存活率影響等。

4 紅細(xì)胞低溫保存新方法

4.1 新型低溫保護(hù)劑：海藻糖是自然界動(dòng)植物和微生物中廣泛存在的一種非還原性二糖。相比其它二糖海藻糖具有較高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，尤其在干燥過(guò)程中能形成穩(wěn)定的玻璃體，幫助生物體儲(chǔ)存能量、吸收水分，用來(lái)對(duì)抗冷凍或者缺水的極端環(huán)境[213,214]。通過(guò)與磷脂的極性頭基相互作用，海藻糖相比更容易結(jié)晶的蔗糖在減少膜融合、穩(wěn)定細(xì)胞膜等方面更有效[215,216]。因此一直以來(lái)圍繞海藻糖對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行冷凍報(bào)道的研究很多，不過(guò)也有一些其它如滲透壓調(diào)節(jié)劑等新型保護(hù)劑在嘗試使用。

1997年，Pellerin-Mendes等人測(cè)試對(duì)比了不同濃度的海藻糖和Dextran液氮冷凍保存人紅細(xì)胞的冷凍存活率以及各項(xiàng)凍后生化指標(biāo)，和17.5%甘油組的92%冷凍存活率相比，最優(yōu)終濃度0.5 M的海藻糖可達(dá)81%，但和15%的Dextran能達(dá)90%的冷凍存活率相比仍然較低，對(duì)此Pellerin-Mendes等人將其歸因于海藻糖只有同時(shí)在胞內(nèi)外出現(xiàn)才能發(fā)揮最大冷凍保護(hù)作用[217]。2017年，Huang等人在研究種冰和脫水機(jī)制對(duì)不同生物細(xì)胞冷凍保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)在冷凍人紅細(xì)胞前使用海藻糖對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)脫水至最小體積，相比為了減小復(fù)溫時(shí)發(fā)生的重結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞種冰，更能提升紅細(xì)胞冷凍存活率，最終在種冰和0.33 M海藻糖預(yù)脫水的雙重作用下冷凍存活率達(dá)到78%[218]。2020年，Shen等人重新測(cè)試了不同濃度下海藻糖預(yù)脫水對(duì)人紅細(xì)胞液氮冷凍效果，并利用EP管在僅含0.4 M海藻糖的情況下將冷凍存活率提升至90%，為了進(jìn)一步提高冷凍存活率并降低殘留的胞內(nèi)冰損傷，他們還在0.4 M海藻糖基礎(chǔ)上添加5%甘油后最終實(shí)現(xiàn)95%的冷凍存活率，和傳統(tǒng)17.5%甘油96%冷凍的存活率效果相當(dāng)，而且還簡(jiǎn)化了洗滌步驟，確保洗滌在30 min之內(nèi)完成，洗滌回收率可達(dá)88%[219]。

通常人們認(rèn)為脂質(zhì)體可以通過(guò)脂質(zhì)和膽固醇交換來(lái)修飾細(xì)胞膜，從而改變物理特性，有利于低溫下穩(wěn)定細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)。2012年，Stoll等人研究了不同脂質(zhì)體對(duì)HES和海藻糖液氮冷凍人紅細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)孵育處理的脂質(zhì)體可以提高海藻糖冷凍紅細(xì)胞的存活率（從77.8%到89.7%），也可以提高HES凍后紅細(xì)胞96 h長(zhǎng)期存活率（從66.5%到77.5%），但效果最好的還是直接使用12.25% HES和0.29 M海藻糖一起冷凍紅細(xì)胞，冷凍存活率可達(dá)97.8%，96 h長(zhǎng)期存活率可達(dá)81.8%。不過(guò)他們發(fā)現(xiàn)冷凍過(guò)程中海藻糖會(huì)進(jìn)入細(xì)胞（從凍前胞內(nèi)5.1 mM提高到大于100 mM），并認(rèn)為胞內(nèi)海藻糖有利于提高紅細(xì)胞復(fù)溫后的穩(wěn)定性[220]。類似的由冷凍導(dǎo)致非滲透性保護(hù)劑進(jìn)入紅細(xì)胞內(nèi)的結(jié)論，Daw在40%蔗糖冷凍人紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也報(bào)道過(guò)[221]，Morris也曾提到過(guò)高濃度的蔗糖（比如超過(guò)40%）會(huì)在冷凍復(fù)溫過(guò)程中進(jìn)入細(xì)胞[181]。

還有一些在微生物中廣泛存在的以兩性電解質(zhì)為主的滲透壓調(diào)節(jié)劑也被應(yīng)用到紅細(xì)胞冷凍保存研究之中，比如四氫嘧啶、甜菜堿、各種氨基酸等。2014年，Assal等人使用以4.5%四氫嘧啶為主的保護(hù)劑，結(jié)合納升級(jí)液滴打印技術(shù)，通過(guò)冷凍紙收集人紅細(xì)胞液滴后直接浸入液氮實(shí)現(xiàn)玻璃化，并系統(tǒng)地從形態(tài)、力學(xué)、功能等方面詳細(xì)評(píng)估了凍后紅細(xì)胞各方面指標(biāo)[222]。2017年，周洋等人使用3%的四氫嘧啶來(lái)代替國(guó)產(chǎn)57%復(fù)方甘油溶液中的3%乳酸鈉，可將原來(lái)84%的人紅細(xì)胞慢速冷凍洗滌回收率提高到89%，并能有效維持紅細(xì)胞正常體積[223]。2017年，Yang等人研究了脯氨酸、甘氨酸和?；撬釋?duì)羊紅細(xì)胞液氮冷凍效果，最好的是4.5%脯氨酸，冷凍存活率可達(dá)72%[224]。2019年，Dou等人使用1.5 M脯氨酸和0.2 M海藻糖一起液氮冷凍羊紅細(xì)胞，得到88.8%的冷凍存活率[225]。2019年，Sui等人使用15%的甜菜堿研究兔紅細(xì)胞液氮冷凍，存活率可達(dá)69%，如果繼續(xù)添加少量的膜保護(hù)劑，如蔗糖、海藻糖、甘氨酸或脯氨酸，冷凍存活率可提升至90%[226]。

至于其它類別的新型低溫保護(hù)劑也有若干報(bào)道。2019年，Liu等人使用0.1%合成的帶海藻糖官能團(tuán)的糖肽PLR8T13將原來(lái)僅使用0.36 M海藻糖情況下液氮冷凍羊紅細(xì)胞的冷凍存活率從49.1%提升到75%[227]。2020年，Liu等人還通過(guò)改進(jìn)糖肽PKDF1T將冷凍存活率提高到87.3%[228]，不過(guò)貌似比修飾改性聚谷氨酸PGA-g-PEA的90%冷凍存活率略低一點(diǎn)[229]。2020年，Cao等人發(fā)現(xiàn)2%海藻酸鈣水凝膠纖維封裝對(duì)人紅細(xì)胞在低濃度甘油下有明顯提升作用，但對(duì)10%以上濃度的甘油和DMSO來(lái)說(shuō)無(wú)效甚至起到反作用[230]。

4.2 胞內(nèi)遞送海藻糖：2000年，Eroglu等人在Nature報(bào)道了通過(guò)基因改造的金黃葡萄球菌溶血素突變體能在細(xì)胞膜上形成可逆的小孔，從而能向胞內(nèi)加載低濃度（0.2 M）的海藻糖，長(zhǎng)期冷凍后最終可使80%以上的3T3成纖維細(xì)胞和70%以上的人類角質(zhì)細(xì)胞存活[231]。該結(jié)果讓人意識(shí)到海藻糖只有在細(xì)胞膜的兩側(cè)才能發(fā)揮出最大的冷凍保護(hù)作用，因此人們開(kāi)發(fā)出一系列方法將海藻糖輸運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，比如冷凍或者滲透壓誘導(dǎo)的膜相變、聚合物或者多肽誘導(dǎo)的膜通透、溶血素類的成孔劑、脂質(zhì)體或者納米顆粒封裝遞送、電穿孔或者超聲輔助、微注射或者液相內(nèi)吞、基因工程下的內(nèi)源合成等[232,233]。其中很多技術(shù)也被應(yīng)用到紅細(xì)胞的冷凍干燥中，這里主要介紹一些典型的非凍干用的通過(guò)胞內(nèi)遞送海藻糖技術(shù)提升人或者羊紅細(xì)胞冷凍存活率的案例。

2007年，Guo等人發(fā)現(xiàn)在使用40% PVP和20%人血清蛋白在-80℃中速冷凍人紅細(xì)胞前，先經(jīng)過(guò)0.8 M海藻糖或者葡萄糖37℃3 h孵育處理（其中胞內(nèi)海藻糖和葡萄糖濃度分別約為16.7 mM和26.5 mM，孵育溶血率分別35%和5%），冷凍存活率相比未經(jīng)孵育處理的顯著提高（從40%多提高到90%多），但單獨(dú)使用0.8 M海藻糖或者葡萄糖冷凍幾乎沒(méi)有存活。雖然胞內(nèi)葡萄糖冷凍效果較好，但凍后60%的PS外翻率卻比胞內(nèi)30%海藻糖要高很多[234]。2008年，Guo等人在無(wú)冷凍實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)葡萄糖孵育過(guò)程中添加大于800 mM的亮肽素或者大于100 mM海藻糖/蔗糖可以將原來(lái)紅細(xì)胞膜上PS暴露百分比降低至10%或者5%以下[235]。2009年，Guo等人更換PVP為Dextran并選擇液氮冷凍方案，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用單糖（葡萄糖，果糖，半乳糖）孵育可以增強(qiáng)40%Dextran液氮冷凍紅細(xì)胞的冷凍存活率和膜完整性，胞內(nèi)單糖還能通過(guò)參與胞內(nèi)糖酵解穩(wěn)定紅細(xì)胞代謝功能，另外單糖中的半乳糖冷凍保護(hù)作用最好，但葡萄糖孵育引起的長(zhǎng)期溶血率過(guò)高的影響因素還未知[236]。2011年，Guo等人認(rèn)為葡萄糖和低聚糖（海藻糖、蔗糖、麥芽糖或棉子糖）按照3:1混合且總濃度控制在0.4 M后孵育紅細(xì)胞，再用40%Dextran液氮冷凍后紅細(xì)胞的各方面指標(biāo)情況（比如滲透脆性和PS外翻）效果會(huì)更好，最終冷凍存活率可達(dá)95%并有效解決了后期長(zhǎng)期溶血率的問(wèn)題[237]。

2008年，Holovati等人通過(guò)熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了使用擠出方法合成的含有單層海藻糖的脂質(zhì)體可以在不損傷細(xì)胞膜的前提下通過(guò)和人紅細(xì)胞膜融合從而向胞內(nèi)輸送海藻糖，并通過(guò)控制膜成分改變帶電屬性等方法可以將原來(lái)輸送不到1 mM海藻糖提高到≈15 mM[238,239]。2009年，Holovati等人在使用典型慢、中、快三種降溫速率冷凍人紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，在胞外僅含生理鹽水的情況下，經(jīng)過(guò)帶負(fù)電荷的包裹海藻糖的脂質(zhì)體37℃ 4 h孵育處理的紅細(xì)胞的冷凍存活率可從20%水平提高到40%水平，如果胞外含0.3 M海藻糖，冷凍存活率可從30%水平提高到60%水平。不過(guò)讓人意外的是，當(dāng)胞外使用脂質(zhì)體替換0.3 M海藻糖時(shí)，冷凍存活率比60%還要高一點(diǎn)。還有使用同樣帶負(fù)電荷但包裹的是生理鹽水的脂質(zhì)體處理的紅細(xì)胞在胞外含有0.3 M海藻糖的情況下，冷凍存活率也能達(dá)到60%水平。該結(jié)果說(shuō)明提高紅細(xì)胞冷凍存活率的并不是利用脂質(zhì)體向胞內(nèi)遞送的≈15 mM海藻糖，而是因?yàn)閹ж?fù)電荷的以單層囊泡形式出現(xiàn)的脂質(zhì)體能夠通過(guò)和紅細(xì)胞膜充分相互作用來(lái)增強(qiáng)紅細(xì)胞抗凍能力[240]。當(dāng)然≈15 mM胞內(nèi)海藻糖不能提高冷凍存活率也符合人們對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)至少需要100～200 mM海藻糖才能達(dá)到胞內(nèi)保護(hù)作用的認(rèn)知[241]。

2010年，Lynch等人使用一種合成的pH響應(yīng)的生物聚合物PP-50，可以顯著提高紅細(xì)胞膜對(duì)海藻糖的通透性，將其與0.36 M海藻糖、羊紅細(xì)胞一起經(jīng)過(guò)pH 7.05 37℃ 9 h孵育后，胞內(nèi)海藻糖濃度可達(dá)123 mM，在液氮冷凍實(shí)驗(yàn)中，相比未孵育僅胞外含有0.36 M海藻糖的實(shí)驗(yàn)組，冷凍存活率可由62.2%提到高到86.6%，其缺點(diǎn)是由于孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，孵育過(guò)程溶血率可達(dá)20%以上，而且慢凍實(shí)驗(yàn)下胞內(nèi)海藻糖對(duì)冷凍提升并不明顯[242]。2011年，Lynch等人在人紅細(xì)胞PP-50加載海藻糖實(shí)驗(yàn)中，將胞外0.36 M海藻糖孵育濃度提升到0.7 M，可實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)251 mM海藻糖濃度的加載，經(jīng)液氮冷凍后相比胞外僅含0.7 M海藻糖的實(shí)驗(yàn)組，可將冷凍存活率由不到60%提升到75%，并且他們還研究了海藻糖裝載量、細(xì)胞體積、冷凍存活率之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)只有裝載了最大濃度的海藻糖的紅細(xì)胞才能接近等滲體積，從而獲得最高的冷凍存活率[243,244]。2020年，Chen等人使用改進(jìn)的pH響應(yīng)的擬肽聚合物PLP-NDA18對(duì)羊紅細(xì)胞進(jìn)行胞內(nèi)海藻糖介導(dǎo)遞送實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在pH 6.1 37℃ 15 min孵育下就能迅速實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)177.9 mM海藻糖遞送，孵育溶血率僅為16.7%，經(jīng)液氮冷凍后相比僅胞外含有0.36 M海藻糖的實(shí)驗(yàn)組，冷凍存活率可由69.4%提高到90.3%，和PP-50對(duì)比遞送效率明顯提升（從9 h孵育實(shí)現(xiàn)35%遞送效率提升至15 min孵育獲得49.4%遞送效率）[245]。

2017年，Stefanic等人使用經(jīng)穩(wěn)定劑處理后的表面帶雙層正負(fù)有機(jī)電暈的膠體狀磷灰石納米顆粒來(lái)和羊紅細(xì)胞膜產(chǎn)生特異相互作用，促進(jìn)海藻糖滲透進(jìn)紅細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)37℃ 7 h孵育以及控制pH 6.5實(shí)現(xiàn)最多50.9 mM海藻糖滲透（孵育溶血最高6.8%），相比pH 7.4下單獨(dú)使用0.35 M海藻糖，經(jīng)液氮冷凍并轉(zhuǎn)移-80℃冰箱儲(chǔ)存一天后冷凍存活率可以從51.8%提升到90.7%。此外，Stefanic等人還通過(guò)雙層脂質(zhì)模型和熒光分子實(shí)驗(yàn)證明弱酸性的pH在調(diào)整磷灰石納米顆粒的生物活性方面的重要作用，并認(rèn)為磷灰石納米顆粒增強(qiáng)介導(dǎo)的無(wú)孔滲透機(jī)制可能是低溫保護(hù)劑或者其它藥物原始遞送機(jī)制[246]。不過(guò)遺憾的是Stefanic等人并未做人紅細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠蚣t細(xì)胞和人紅細(xì)胞部分特性方面存在較大差異，例如羊紅細(xì)胞呈球形且僅占人紅細(xì)胞體積的三分之一[7]，羊紅細(xì)胞對(duì)甘油的滲透性相比人紅細(xì)胞要低60倍左右[247]等。此外，CPD或CPDA對(duì)羊紅細(xì)胞會(huì)造成輕微損害，因此更推薦肝素作為羊紅細(xì)胞首選的抗凝劑[7]?？傊?，羊紅細(xì)胞的冷凍方案不能完全照搬到冷凍人紅細(xì)胞上來(lái)。

4.3 冰重結(jié)晶抑制劑：冰重結(jié)晶抑制（Ice recrystallization inhibition，IRI）的思想來(lái)源于從自然界極地魚(yú)類、冬眠昆蟲(chóng)、耐寒植物等生物體上發(fā)現(xiàn)的能夠避免自然凍結(jié)的抗凍（糖）蛋白（Antifreeze proteins or glycoproteins，AF(G)Ps），具有典型的熱滯性、重結(jié)晶抑制性、動(dòng)態(tài)冰生成等特點(diǎn)，可以通過(guò)調(diào)控冰的形成方式（比如調(diào)節(jié)冰核，控制冰的形狀，抑制冰生長(zhǎng)和重結(jié)晶等）來(lái)保護(hù)生物活體免受低溫傷害[248-250]。

1992年，Carpenter等人曾報(bào)道使用重組I型AFP（Antifreeze protein，抗凍蛋白）來(lái)提高人紅細(xì)胞的冷凍存活率，他們發(fā)現(xiàn)在23% HES液氮冷凍中加入低濃度30～60 μg/mL的AFP能夠在次優(yōu)復(fù)溫速率下（室溫自然復(fù)溫，非水浴快速?gòu)?fù)溫）將紅細(xì)胞冷凍存活率從55%提升到88%，證明了AFP在抑制重結(jié)晶中的重要作用，可是當(dāng)繼續(xù)提高AFP濃度到1.54 mg/mL時(shí)溶血率會(huì)大幅度增加，通過(guò)冷臺(tái)甚至觀察到出現(xiàn)了破壞性雙錐體冰晶。他們認(rèn)為AFP雖然具有很強(qiáng)的重結(jié)晶抑制能力，但其本身并不具有冷凍保護(hù)作用，另外在已有HES液氮冷凍并選擇快速?gòu)?fù)溫的情況下不管是否添加AFP冷凍存活率都能達(dá)到97%，不過(guò)值得注意的是AFP可以降低洗滌過(guò)程中的溶血率[194]。1994年，Ishiguro使用低溫冷臺(tái)通過(guò)定向凝固實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)添加20 mg/mL的AFP能夠顯著改變20%甘油形成的冰晶形態(tài)，使得原本應(yīng)該存活的紅細(xì)胞因尖銳冰晶的存在而全部死亡，也間接說(shuō)明了胞外冰晶機(jī)械損傷對(duì)即使已經(jīng)受到甘油保護(hù)的紅細(xì)胞來(lái)說(shuō)仍具有傷害作用[251]。1996年，Chao等人擴(kuò)展研究了重組III型AFP中不同突變體輔助HES冷凍保存人紅細(xì)胞的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)蛋白本身相對(duì)的熱滯后活性和抑冰能力對(duì)提高紅細(xì)胞冷凍存活率至關(guān)重要[252]。

考慮到AF(G)Ps潛在的免疫原毒性、過(guò)高生產(chǎn)成本、易形成動(dòng)態(tài)針狀冰晶等問(wèn)題，近些年人們不斷地尋找或者努力合成各種和AF(G)Ps一樣具有抑冰效果但能克服其缺點(diǎn)的冰晶抑制劑，比如小分子化合物、高分子聚合物、聚兩性電解質(zhì)、納米材料等[196]。

在小分子化合物方面，Ben課題組設(shè)計(jì)合成了一系列糖苷小分子（MW＜340 Da），比如酚類糖苷小分子、芳基糖苷小分子等來(lái)研究對(duì)人紅細(xì)胞冷凍保存效果。2015年，Ben課題組通過(guò)兩步冷凍法模擬慢速冷凍（-5℃種冰，然后以1℃/min降溫至-40℃/-50℃再放入-80℃干冰）向15%的甘油中添加不同的可滲透性酚類糖苷小分子110 mM β-PMPGlc和30 mM β-pBrPh-Glc（2019年補(bǔ)充了部分實(shí)驗(yàn)），將原來(lái)只有25%的冷凍存活率提高30%～50%，最高接近80%，但是對(duì)于20%的甘油慢凍提升并不明顯，而且離40%甘油慢凍98%左右的冷凍存活率相比仍具有較大差距[253,254]。2016年，Ben課題組還設(shè)計(jì)了反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)（不種冰直接放入-80℃干冰后復(fù)溫至-20℃反復(fù)5次）來(lái)驗(yàn)證向15%甘油中添加芳基糖苷小分子對(duì)重結(jié)晶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞冷凍存活率可由原來(lái)不到40%提升到近90%，和40%甘油反復(fù)凍存效果幾乎一致，還通過(guò)冷臺(tái)證明了抑冰劑的加入可以降低冰/水比例從而減小溶液損傷[255]。2016年，Ben課題組還發(fā)現(xiàn)一些抑冰能力較差但卻能作為有效冰核抑制劑的小分子β-PMP-Gal也能顯著提高15%甘油慢凍存活率，并通過(guò)抑制AgI液滴成核實(shí)驗(yàn)認(rèn)為小分子化合物低溫保護(hù)的有效性并不體現(xiàn)在抑制重結(jié)晶，而是抑制冰成核[256]。

在高分子聚合物方面，2014年，Gibson課題組發(fā)現(xiàn)聚乙烯醇PVA比常規(guī)非滲透性保護(hù)劑如PEG、HES有更顯著的抑冰效果，并在-78℃異丙醇干冰浴快速冷凍羊紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)使用0.1% PVA就可以達(dá)到40%冷凍存活率。隨后在人紅細(xì)胞中向21.5% HES中添加0.1% PVA并采用23℃室溫慢速?gòu)?fù)溫可將原來(lái)只有20%多的存活率提升到60%，但仍不及45℃水浴快速?gòu)?fù)溫得到的80%存活率[195]。2015年，Gibson課題組改變冷凍方式，使用更常規(guī)的液氮冷凍，重新研究了不同濃度的PVA對(duì)17.5% HES冷凍羊紅細(xì)胞的提升作用，效果最好的是0.5% PVA，在23℃室溫慢速?gòu)?fù)溫下冷凍存活率提升10%～15%到40%左右，42℃水浴快速?gòu)?fù)溫下冷凍存活率提升30%到80%以上，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以利用PVA來(lái)降低紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移-20℃儲(chǔ)存后的溶血率[192]。2016年，Gibson課題組還將0.1%的PVA和5%仿生高度羥基化的嵌段蠕蟲(chóng)共聚物結(jié)合起來(lái)，利用PVA抑制重結(jié)晶以及蠕蟲(chóng)共聚物熱敏特性（20℃以上為凝膠態(tài)，12℃以下成液態(tài)），通過(guò)液氮冷凍4 ℃超慢速?gòu)?fù)溫實(shí)現(xiàn)68%的羊紅細(xì)胞冷凍存活率，和同等實(shí)驗(yàn)條件下20% HES外加0.1% PVA的70%存活率基本一致，更重要的是該方法可以通過(guò)溫度控制，比如從4℃升溫到20℃，能將原來(lái)呈液態(tài)的紅細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，為紅細(xì)胞的儲(chǔ)存和運(yùn)輸提供了新的解決思路[257]。

在聚兩性電解質(zhì)方面，已經(jīng)有人成功將聚賴氨酸、聚甜菜堿以及聚脯氨酸等聚兩性電解質(zhì)用于人或動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存[258-261]。在紅細(xì)胞方面，2015年Gibson課題組自行合成的帶氨基和羧基的聚兩性電解質(zhì)，在液氮冷凍室溫慢速?gòu)?fù)溫下向HES加入0.5%的聚兩性電解質(zhì)可將僅使用HES的羊紅細(xì)胞的冷凍存活率從20%提升到30%，添加2%的聚兩性電解質(zhì)甚至可以提升到60%[262]。2021年，Wang課題組在沒(méi)有使用HES下直接使用6%的聚（D/L-絲氨酸）對(duì)羊紅細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍后45℃水浴快速?gòu)?fù)溫，冷凍后存活率最高達(dá)52.3%，而單獨(dú)HES冷凍僅有31.8%存活[263]。

在納米材料方面，2017年Wang課題組利用1%的氧化物準(zhǔn)碳氮量子點(diǎn)OQCN[264]、2019年Brinker課題組利用0.05%的基于鋯Zr的金屬有機(jī)骨架MOF納米顆粒[265]，均使用和Gibson課題組一樣的液氮冷凍4℃超慢速?gòu)?fù)溫實(shí)驗(yàn)方法[257]，達(dá)到40%～50%的冷凍存活率，略高于使用21.5% HES的不到40%的冷凍存活率，不過(guò)Wang課題組使用的是羊紅細(xì)胞，Brinker課題組使用的是人紅細(xì)胞。2020年，Wang課題組還使用水熱碳化合成的來(lái)自葡萄糖的2%的碳點(diǎn)G-CDs對(duì)羊紅細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍45℃水浴快速?gòu)?fù)溫，實(shí)現(xiàn)60%的冷凍存活率，而單獨(dú)21.5%的HES冷凍僅有40%存活[266]。

5 總結(jié) 紅細(xì)胞冷凍保存已經(jīng)發(fā)展了70余年，從最早偏向保存過(guò)程和經(jīng)驗(yàn)的發(fā)展，逐漸轉(zhuǎn)移到低溫冷凍損傷和保護(hù)劑機(jī)制的基礎(chǔ)研究，再到最新的抑冰和納米材料等先進(jìn)低溫保存技術(shù)探索，整個(gè)紅細(xì)胞冷凍保存的歷史其實(shí)就是低溫生物學(xué)發(fā)展的歷史。作為低溫生物學(xué)中最成熟和最廣泛的臨床技術(shù)應(yīng)用，臨床輸注冷凍紅細(xì)胞的成功來(lái)源于多方面的協(xié)同合作，其中既有低溫生物學(xué)家在積極探索冷凍損傷機(jī)理和并提出預(yù)防冷凍損傷方案，也有生理學(xué)家和臨床工作者做了大量的凍后細(xì)胞功能評(píng)估和臨床實(shí)驗(yàn)，還有電子機(jī)械工程師不斷完善和開(kāi)發(fā)冷凍、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和凍后洗滌紅細(xì)胞的自動(dòng)化設(shè)備[125]。

雖然人們?cè)鴷诚脒^(guò)最理想的冷凍方法是向紅細(xì)胞制劑中添加允許輸注人體的物質(zhì)，冷凍復(fù)溫后的游離血紅蛋白也在安全范圍之內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)免洗滌直接輸注[39,102]。但至今仍然沒(méi)有尋到一種適用范圍廣、操作簡(jiǎn)單、無(wú)毒價(jià)廉，并且保存效果能媲美甘油的低溫保護(hù)劑。既然避免不了保護(hù)劑的使用，那么人們洗滌的目標(biāo)就是在最短的時(shí)間內(nèi)使用最少體積的洗滌液得到最高的紅細(xì)胞回收率[110]。在面對(duì)自然災(zāi)難和戰(zhàn)爭(zhēng)等特殊情況時(shí)，冷凍紅細(xì)胞的價(jià)值尤為重要，特別是軍隊(duì)對(duì)非甘油冷凍紅細(xì)胞的新技術(shù)非常感興趣，因?yàn)樵诰o急情況下花費(fèi)大量時(shí)間在洗滌紅細(xì)胞上是不被允許的，非滲透性保護(hù)劑在冷凍紅細(xì)胞中仍具有一定發(fā)展空間[267]。

隨著生物材料、納米科技、工程技術(shù)的飛速發(fā)展，21世紀(jì)開(kāi)始已經(jīng)出現(xiàn)了很多新型的極具潛力的紅細(xì)胞低溫保存技術(shù)。但不可否認(rèn)的是這些先進(jìn)的低溫保存技術(shù)大多仍然停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走，如一些新型的低溫保護(hù)劑面臨能否獲得FDA批準(zhǔn)的問(wèn)題、海藻糖孵育遞送過(guò)程溶血率仍然較高、冰重結(jié)晶抑制劑無(wú)法擺脫傳統(tǒng)保護(hù)劑依賴或者單獨(dú)使用冷凍存活率較低（最高才60%～70%），以及絕大多數(shù)新技術(shù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)中冷凍體積太?。▋H1-2毫升甚至幾百微升），部分技術(shù)甚至還停留在動(dòng)物紅細(xì)胞的測(cè)試上。盡管如此，我們依然相信這些先進(jìn)的冷凍保存技術(shù)會(huì)隨著科技的發(fā)展不斷進(jìn)步，上述缺點(diǎn)在將來(lái)也會(huì)被克服，所有的冷凍保存方案最終都會(huì)朝著安全高效的方向發(fā)展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突