漆黃素藥理作用研究進展

周茂花，程葦釔，邱建國，張巧艷，秦路平*，張泉龍*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源教研室，杭州 311204；2.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院藥劑科，蘭州 730050)

漆黃素(fisetin，3，7，3′，4′-四羥基黃酮，分子式C15H10O6)是一種存在于多種水果、蔬菜和中藥黃櫨(CotinuscoggygriaScop.)、漆樹(RhusvernicifluaStokes.)等植物中的類黃酮多酚化合物[1]，呈黃色針狀結(jié)晶?！侗静菔斑z》記載含漆黃素的黃櫨葉能除煩熱、解酒疸，目黃可水煮服之，表明其可用于治療黃疸型肝炎。近年來，漆黃素因具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等多種藥理活性被廣泛研究。本文旨在對漆黃素的各種藥理作用及其作用機制進行綜述，以促進其進一步的研究與開發(fā)。此外，本文還討論了目前已有的提高漆黃素生物利用度的方法及安全性研究。

1 抗腫瘤作用

漆黃素抗腫瘤的作用機制主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，與抗腫瘤藥物聯(lián)用可增強抗腫瘤作用，降低耐藥性。

1.1 誘導(dǎo)癌細胞凋亡 誘導(dǎo)癌細胞凋亡是抗腫瘤藥物的常見作用機制。細胞凋亡是一種細胞程序性死亡過程，對于維護組織正常運行及預(yù)防癌癥的發(fā)生起著非常重要的作用，主要有兩條途徑調(diào)控細胞凋亡：由死亡受體[人凋亡相關(guān)因子及其配體(human factor-related apoptosis and its ligand，F(xiàn)as-FasL)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體及其受體(TNF-related apoptosis-inducing ligand-receptor，TRAIL-R)、Ⅰ型TNF受體(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)]介導(dǎo)的外源性通路和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性通路。研究發(fā)現(xiàn)，漆黃素能通過內(nèi)源性和外源性通路同時誘導(dǎo)癌細胞凋亡。在外源性通路中，漆黃素通過促進TRAIL表達，提高下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3,8,9蛋白表達，從而誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡[2]。在內(nèi)源性通路中，漆黃素可通過對抗線粒體功能障礙，激活Caspase、促進凋亡因子(bcl-2和p53)生成，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路等多途徑，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。

1.2 細胞周期阻滯 細胞周期調(diào)控異常是腫瘤發(fā)生的內(nèi)因之一。細胞周期阻滯為細胞提供額外的時間用于修復(fù)損傷，從而減少突變，避免腫瘤的發(fā)生。通過調(diào)節(jié)細胞周期抑制癌細胞生長，已逐漸成為抗腫瘤的一個研究方向。研究發(fā)現(xiàn),漆黃素對細胞S、G2/M、G0/G1期均有阻滯作用[3-4]，其細胞周期阻滯作用與降低細胞周期蛋白D1、D2、E、DA和細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)4、CDK2、CDK6的水平，減少細胞分裂周期因子(cell division cycle，CDC)25a、CDC25c表達[3]，增加p53、細胞周期檢測點激酶1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(p21)和p27[3-4]表達有關(guān)。漆黃素還能直接與CDK6作用，抑制CDK6激酶活性[5]。

1.3 抑制癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移 腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤治療的最大障礙。目前，癌癥患者死亡的主要原因是癌細胞的全身擴散和侵襲。研究報道，漆黃素主要通過以下兩個途徑來抑制癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。(1)逆轉(zhuǎn)上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。漆黃素通過減少在EMT上游的多個信號蛋白[如β-連環(huán)蛋白、核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、表皮生長因子受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT-3)]的表達[6]，抑制Y-盒結(jié)合蛋白1(Y-box binding protein-1，YB-1)的表達(注：YB-1能夠促進EMT)[7]，降低EMT調(diào)節(jié)因子Twist蛋白水平，上調(diào)上皮標(biāo)記物E-鈣黏蛋白，下調(diào)間充質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白、N-鈣黏蛋白、纖連蛋白，通過PTEN-AKT-GSK3β信號通路[注：PTEN表示gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，AKT表示蛋白激酶B(protein kinase B)，GSK3β表示糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β)]來抑制或逆轉(zhuǎn)EMT，從而抑制非小細胞肺癌細胞、黑素瘤細胞、三陰性乳腺癌細胞和潛伏膜蛋白1陽性鼻咽癌細胞等多種癌細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。(2)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，減少基質(zhì)膠原降解，從而抑制癌細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。漆黃素可通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路、蛋白激酶C/活性氧(reactive oxygen species,ROS)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)途徑以及抑制胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/AKT和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路[8]，抑制MMP-2和MMP-9的表達，從而抑制乳腺癌細胞等多種癌細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。臨床研究發(fā)現(xiàn)，正在接受化療的結(jié)直腸癌患者每天口服100 mg漆黃素，連續(xù)用藥7周后，漆黃素能抑制MMP-7的蛋白表達水平，并改善結(jié)直腸癌患者的炎癥狀態(tài)[9]。

1.4 抑制血管生成 目前，已有越來越多的研究表明，癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，新生血管為腫瘤擴散提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，這使得新生血管成為抗腫瘤治療的目標(biāo)。腫瘤生成會引起促血管生成因子(血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板源性生長因子)和抗血管生成因子(血管抑制素、內(nèi)皮抑素)表達不平衡。動物實驗發(fā)現(xiàn)，漆黃素和漆黃素膠束均能抑制攜帶人卵巢癌細胞(SKOV3細胞)的異種移植小鼠模型的血管生成[10]。BHAT等[11]在裸鼠皮下移植人惡性黑素瘤細胞(A375和SK-MEL-28)之后發(fā)現(xiàn)，與單用索拉非尼相比，漆黃素和索拉非尼聯(lián)合治療能抑制血管生成，顯著抑制腫瘤生長。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，漆黃素通過降低人臍靜脈內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶和血管內(nèi)皮生長因子表達，劑量依賴性地抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的生長和存活。

1.5 與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用 漆黃素除了其自身的抗腫瘤作用，還能與其他幾種抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，增強其抗腫瘤活性，降低耐藥性。動物實驗發(fā)現(xiàn)，在移植22Rν1和PC-3M人前列腺癌細胞的小鼠模型中，漆黃素能夠增強卡巴他賽對人前列腺癌細胞的化療作用[12]。TOUIL等[13]發(fā)現(xiàn)，漆黃素可以提高環(huán)磷酰胺對Lewis肺癌小鼠的抗血管生成和抗腫瘤活性。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，漆黃素能降低細胞周期蛋白B1和E1的水平，增強依托泊苷對骨肉瘤細胞周期的阻滯，增強抗增殖作用[14]。此外，漆黃素還可通過抑制EMT，增強索拉非尼對黑素瘤細胞的抗侵襲和抗轉(zhuǎn)移能力[11]。SMITH等[15]研究發(fā)現(xiàn)，漆黃素與順鉑、氟尿嘧啶和環(huán)磷酰胺代謝物4-羥基環(huán)磷酰胺聯(lián)合應(yīng)用，能增強這些藥物對三陰性乳腺癌細胞的殺傷作用。KLIMASZEWSKA-WISNIEWSKA等[16]發(fā)現(xiàn)，單獨的紫杉醇對正常細胞毒性大，而其與漆黃素聯(lián)合應(yīng)用可以為正常細胞提供保護，且抗腫瘤作用增強。在拮抗耐藥性方面，漆黃素通過抑制MAPK和Akt通路，克服肺腺癌細胞對厄洛替尼的耐藥性[17]。ZHUO等[18]也發(fā)現(xiàn)，漆黃素通過MAPK/凋亡抑制基因Survivin/Caspase途徑，逆轉(zhuǎn)肺腺癌細胞對順鉑的獲得性耐藥，其機制可能是通過抑制MAPK信號通路的異常激活，提高A549-CR細胞對順鉑的敏感性。

2 抗氧化作用

從結(jié)構(gòu)上分析，漆黃素具有類黃酮多酚結(jié)構(gòu)，具有良好的抗氧化作用。漆黃素具有清除自由基的活性，是因為其分子結(jié)構(gòu)中存在自由的羥基(C-3、C-3′、C-4′、C-7)和羰基(C-4)。漆黃素的B環(huán)和C環(huán)與A環(huán)相比，有更高的自由基清除活性，其鄰二羥基結(jié)構(gòu)在參加電子離域時可以作為電子供體，從而防御ROS，抑制低密度脂蛋白氧化。IMAI等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在漆黃素的多個碳位點上引入甲基取代基，能夠提高其清除自由基的活性，提高抗氧化能力。在其甲基衍生物中，5′-甲基漆黃素清除自由基的活性最好。

漆黃素的自由基清除作用依賴于多酚氧化酶的存在，其抗氧化作用能夠被多酚氧化酶抑制劑抑制。從機制上分析，漆黃素發(fā)揮抗氧化作用的主要機制包括激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)并誘導(dǎo)血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)基因表達，抑制ROS生成，調(diào)節(jié)抗氧化酶谷胱甘肽(glutathione)的水平等。ZHANG等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)途徑是漆黃素在細胞中發(fā)揮抗氧化活性的主要途徑之一。在轉(zhuǎn)錄后水平上，漆黃素可以通過抑制Nrf2的降解，將Nrf2轉(zhuǎn)入細胞核，上調(diào)下游HO-1基因的表達，減輕小鼠顱腦損傷后的氧化應(yīng)激。漆黃素可通過抑制ROS生成，保護DNA免受自由基誘導(dǎo)的氧化損傷。ZHAO等[21]以10、20和40 mg/kg的漆黃素灌胃小鼠7 d，發(fā)現(xiàn)漆黃素能夠抑制肝組織和L-02細胞(人正常肝細胞)中ROS的生成，并恢復(fù)谷胱甘肽過氧化物酶1、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶等抗氧化酶基因的表達，調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝和相關(guān)抗氧化信號的表達，來預(yù)防對乙酰氨基酚在小鼠和L-02細胞中誘導(dǎo)的肝毒性。EHREN等[22]研究發(fā)現(xiàn)，漆黃素增加谷胱甘肽水平的機制與其能快速促進Nrf2和活化轉(zhuǎn)錄因子4表達有關(guān)。

3 抗炎作用

炎癥是多種疾病的誘因，也與腫瘤發(fā)生的增殖、轉(zhuǎn)移等各個階段有著密切的關(guān)系，因此抗炎治療是對癌癥等炎癥伴隨疾病進行預(yù)防和治療的有效策略。漆黃素發(fā)揮抗炎作用的機制主要包括以下兩方面。(1)抑制中性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞等炎癥細胞的活性：漆黃素能逆轉(zhuǎn)支氣管肺泡灌洗液中由香煙煙霧引起的中性粒細胞和巨噬細胞群增加，從而減輕肺部炎癥[23]。漆黃素通過抑制NF-κB活化、p38 MAPK磷酸化，下調(diào)肥大細胞活性，限制肥大細胞與活化T細胞之間的相互作用，發(fā)揮抗炎作用[24]。(2)抑制炎癥介質(zhì)表達：已有研究報道，漆黃素能夠通過NF-κB、JAK-STAT、PI3K-Akt、MAPK[25]等通路，抑制Toll樣受體4表達，抑制環(huán)氧合酶2、前列腺素E2、TNF-α、白介素、趨化因子等炎癥介質(zhì)的表達，從而發(fā)揮抗炎作用，能有效抑制應(yīng)激性腎損傷腎炎、肝炎、急性肺損傷、視網(wǎng)膜炎癥、氣道炎、急性中耳炎等動物模型的炎癥反應(yīng)。

4 其他藥理作用

漆黃素除了具有上述藥理作用外，還在抗衰老、保護心肌損傷[26]、改善非酒精性脂肪肝[27]、保護皮膚紫外線和炎性損傷[28]等方面發(fā)揮多種藥理作用。此外，漆黃素具有神經(jīng)保護作用，主要表現(xiàn)為改善記憶功能、減輕神經(jīng)毒性損傷、抑制β淀粉樣蛋白生成和Tau蛋白磷酸化等，發(fā)揮抗阿爾茨海默病[29]和抗缺血性腦卒中[30]作用。漆黃素還具有骨保護作用，通過上調(diào)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的轉(zhuǎn)錄活性，促進成骨細胞的分化[31]，通過抑制NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1依賴信號通路抑制破骨細胞活性[32]，從而發(fā)揮骨保護作用，顯示出治療骨質(zhì)疏松癥的潛力。漆黃素通過抑制肝臟糖異生[33]、調(diào)節(jié)多種糖代謝關(guān)鍵酶等作用維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮抗糖尿病作用。

5 體內(nèi)代謝

漆黃素在結(jié)構(gòu)上是含四羥基的黃酮化合物，水溶性低，口服吸收度差。藥動學(xué)研究表明[34]，漆黃素以223 mg/kg的劑量經(jīng)腹腔注射后，在小鼠體內(nèi)存在較長的半衰期(3.12 h)和平均滯留時間(4.51 h)，15 min后達到血藥濃度峰值(2.53 μg/ml)，藥-時曲線下面積(AUC)為4.0 μg·h·ml-1，組織分布按濃度從高到低依次為腎臟、小腸、肝臟。在代謝方面，研究發(fā)現(xiàn)，漆黃素(10 mg/kg)靜脈注射后，能在大鼠肝臟中被快速轉(zhuǎn)化為硫酸鹽形式；而經(jīng)口服給藥(50 mg/kg)，漆黃素被快速轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸形式，很少以原型成分存在體內(nèi)。除了硫酸化和葡萄糖醛酸化，甲基化是漆黃素的另一條主要代謝途徑[34]，其中3′-甲氧基化代謝物geraldol是其活性代謝產(chǎn)物，具有抗增殖、抗遷移、抗血管生成的作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

6 小結(jié)和展望

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)漆黃素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護等多種藥理活性，但目前尚未有漆黃素相關(guān)新藥用于臨床的報道。主要原因在于漆黃素的水溶性低(水中溶解度為10.45 μg/ml)，口服生物利用度低(僅為44.1%)，口服吸收差，使其動物藥理研究及臨床應(yīng)用均受到了限制。目前采用脂質(zhì)囊泡、聚合物納米顆粒、固體脂質(zhì)納米粒和絡(luò)合等技術(shù)[35]，可以提高漆黃素的溶解度與生物利用度。市場上有漆黃素膳食補充劑正在開展臨床試驗[9]。在安全性評價方面，2 g/kg高劑量的漆黃素急性毒性實驗結(jié)果均為陰性；長期毒性實驗中，25 mg/kg漆黃素對小鼠體重?zé)o明顯影響，心臟、胃、腎、腸、肝、脾、肺和生殖器官的病理檢查均未見毒性癥狀；埃姆斯致癌誘導(dǎo)試驗結(jié)果呈陰性[36]。但GOLLAPUDI等[37]研究發(fā)現(xiàn)，漆黃素能誘導(dǎo)人淋巴母細胞(TK6細胞)非整倍體和多倍體，可引起人細胞的染色體異常。因此，應(yīng)對漆黃素的細胞及動物毒理學(xué)進行深入研究，尤其應(yīng)關(guān)注其可能的遺傳毒性。在藥理學(xué)研究方面，雖然已報道漆黃素具有多種生理活性，但其作用靶標(biāo)尚未完全闡明，今后應(yīng)圍繞其作用靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，進一步闡明作用機制，為漆黃素的新產(chǎn)品開發(fā)及其在疾病治療中的應(yīng)用提供更多依據(jù)。