角膜硬度的測量方法及與眼部疾病相關(guān)性研究進(jìn)展△

蒲琪 馬倩 李新宇

角膜是位于眼球最前端的透明、無血管、有彈性的纖維膜，既是眼部屈光力最大的組織，又是關(guān)鍵的屏障結(jié)構(gòu)。正常情況下，角膜維持著相對穩(wěn)定的生物力學(xué)特性，包括硬度、彈性、黏滯性等。組織硬度是角膜研究的最廣泛的生物力學(xué)指標(biāo)，參與形成角膜屈光功能、保持眼球穩(wěn)定并維持眼表健康。為全面認(rèn)識角膜硬度的測量方法及與眼部疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展，本文就角膜的生物力學(xué)特點(diǎn)和角膜硬度的測量、影響因素、應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 角膜的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)特性

生物力學(xué)是在微觀和宏觀層面上研究作用于生物體內(nèi)部和之上的力的起源和作用的科學(xué)[1]?？紤]到角膜的屈光功能及屏障支持功能，研究角膜的生物力學(xué)將有助于人們更科學(xué)地認(rèn)識和管理相關(guān)眼部疾病，深化對青光眼患者的眼壓測量、屈光手術(shù)的設(shè)計(jì)和隨訪、圓錐角膜(keratoconus,KC)的診斷和隨訪等臨床診療操作的認(rèn)知。角膜的生物力學(xué)特性主要包括角膜硬度、張力、彈性、黏滯性及其他未被定義的因素[2]。其中，硬度是評估角膜生物力學(xué)特性最重要且最常用的指標(biāo)之一，借用機(jī)械工程學(xué)中的術(shù)語可稱其為彈性模量，它描述了在特定條件下載荷使角膜變形的程度，彈性模量越大，角膜越硬[1]。

角膜由上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層組成。其中，基質(zhì)層占角膜厚度的90%，由膠原纖維(Ⅰ型和Ⅳ型膠原)、角膜基質(zhì)細(xì)胞、黏蛋白和糖蛋白構(gòu)成；膠原纖維有規(guī)律地與角膜表面平行排列，形成200～300層膠原纖維板[3]。膠原纖維的含量和分布與角膜生物力學(xué)特性有重要關(guān)系，作為角膜主要承載層和膠原層，基質(zhì)層是角膜生物力學(xué)特性的主要貢獻(xiàn)者，且與角膜硬度直接相關(guān)[3-4]。

2 角膜硬度的測量技術(shù)進(jìn)展

迄今為止，已經(jīng)建立了多種測量角膜生物力學(xué)性能的方法，如軸向拉伸測試、膨脹測試、原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)、彈性成像技術(shù)、光學(xué)相干彈性成像(optical coherence elastography，OCE)、超聲剪切波成像(supersonic shear wave imaging，SSI)、眼反應(yīng)分析儀(ocular response analyzer，ORA)和Corvis ST等。不同測量方法的檢測原理、樣本要求、操作復(fù)雜度及應(yīng)用場景不盡相同，具有各不相同的應(yīng)用潛力。

2.1 拉伸和膨脹測試角膜硬度離體測量最為經(jīng)典的是軸向拉伸測試和膨脹測試，二者通過測量角膜的應(yīng)力-應(yīng)變反應(yīng)，計(jì)算彈性模量，獲得角膜的生物力學(xué)參數(shù)。軸向拉伸測試是單軸試驗(yàn)，可評估平行于應(yīng)變方向的膠原纖維，但是忽略了角膜曲面變平和拉伸的影響[5-6]。膨脹測試是雙軸和軸對稱試驗(yàn)，克服了軸向拉伸測試的缺陷，但是它存在技術(shù)本身帶來的操作難題，包括潛在的氣體泄漏及在溶液中溶解氣體時(shí)控制壓力困難[6]。此外，盡管軸向拉伸測試和膨脹測試是經(jīng)典的角膜硬度測量方法，但這兩種方法均為破壞性的，且會改變角膜的生理狀態(tài)，故無法準(zhǔn)確測量角膜硬度和在活體狀態(tài)下應(yīng)用[7]。

2.2 AFMAFM通過檢測樣品與微懸臂針尖之間極微弱的原子間相互作用力來研究物質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、材料科學(xué)領(lǐng)域[8]。AFM可在探針接近或壓入樣品表面后再離開的過程中，測量并記錄探針?biāo)艿牧?，得到?距離曲線，通過分析針尖-樣品作用力，得到樣品的各種物理屬性，如壓彈性、黏彈性、硬度等[9]。AFM具有樣品制備要求低、對樣品原狀態(tài)影響小、測量環(huán)境無特殊要求及測量分辨率達(dá)納米級等優(yōu)點(diǎn)[8]。然而AFM檢測樣本需要經(jīng)過制備處理，檢測探針需與角膜直接接觸，因而難以應(yīng)用于臨床患者的角膜硬度測量。

2.3 彈性成像技術(shù)彈性成像技術(shù)是通過內(nèi)置力學(xué)模型，利用成像組織的位移來量化其生物力學(xué)特性的一類測量技術(shù)。傳統(tǒng)的彈性成像技術(shù)，如超聲彈性成像、磁共振彈性成像等，均依賴于額外給予的力學(xué)刺激，然后通過測量組織對刺激的位移反應(yīng)來量化組織的生物力學(xué)特性[10-13]。彈性成像技術(shù)主要缺點(diǎn)包括需要較大的刺激才可產(chǎn)生可測量信號、較差的空間分辨率和基于接觸式測量[7]。

2.4 SSISSI是基于超聲技術(shù)的組織硬度測量方案，也可用于角膜硬度的測量。Nguyen等[14]使用SSI檢測了離體及在體的豬角膜樣本，生成了描述角膜硬度的二維和三維圖。然而，SSI需要與角膜直接接觸以實(shí)現(xiàn)聲耦合，這一操作本身會導(dǎo)致患者不適，且其空間分辨率也相對較低，因而限制了其在臨床的應(yīng)用。

2.5 OCE基于光學(xué)相干斷層掃描(OCT)的彈性成像技術(shù)OCE是通過OCT檢測組織位移和應(yīng)變圖，生成組織彈性和黏彈性特性的圖像，并最終生成彈性模量的定量圖，具有微米級空間分辨率、納米級靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[7-15]。OCE的測量過程分為機(jī)械載荷、組織響應(yīng)和運(yùn)動檢測三步，其中機(jī)械載荷有靜態(tài)和動態(tài)、接觸和非接觸之分，動態(tài)非接觸的方法更適用于臨床[15]。

2.6 布里淵顯微鏡布里淵顯微鏡是一種非侵入性的檢測手段，是通過光學(xué)方法來量化組織硬度的方法。簡單來說，當(dāng)用單色光照射物體時(shí)，光子會經(jīng)歷輕微的頻率偏移，這可能與物體的材料特性及密度有關(guān)[16]。這種基于布里淵頻移分析的非侵入性光學(xué)技術(shù)能夠以微米級的空間分辨率生成角膜的深度彈性分布圖，已用于人角膜生物力學(xué)測量的體內(nèi)外研究[17-18]。盡管布里淵位移可能與彈性有關(guān)，但要準(zhǔn)確地從布里淵位移中獲得定量的生物學(xué)參數(shù)(如彈性模量)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[19]。

2.7 臨床常用檢測方法及進(jìn)展以上檢測方法僅適用于實(shí)驗(yàn)，臨床中尚不可用。目前投入商用的角膜生物力學(xué)測量儀器有ORA和Corvis ST。ORA是一個(gè)非接觸式眼壓計(jì)，其原理是利用可控的空氣脈沖壓陷3～6 mm范圍的中央角膜，使其發(fā)生變平-凹陷-變平-復(fù)原的形變過程，光電系統(tǒng)監(jiān)測記錄角膜2次變平時(shí)空氣脈沖的壓力，最后通過系統(tǒng)計(jì)算得到角膜滯后量和角膜阻力因子[20-23]。其中，角膜阻力因子是反映角膜硬度的參數(shù)。Corvis ST與ORA原理類似，二者區(qū)別在于數(shù)據(jù)采集和分析系統(tǒng)。Corvis ST采用高速Scheimpflug攝像機(jī)(每秒4330幀)記錄下角膜的運(yùn)動，然后在內(nèi)置的控制面板上以超慢速度回放并記錄圖形，最后根據(jù)記錄的圖形計(jì)算出相關(guān)生物力學(xué)參數(shù)，如中央角膜厚度(central corneal thickness，CCT)、眼壓、形變幅值比率、第1次壓平時(shí)的剛度參數(shù)(stiffness parameter at first applanation,SP-A1)等[24]。其中，SP-A1是角膜硬度參數(shù)[24-25]。雖然這些參數(shù)可以為疾病檢測提供有用的信息，但由于其不能測量彈性模量，且測量受角膜厚度和眼壓的影響較大，因此其檢測角膜生物力學(xué)特性的能力尚存在爭議[26-27]。

除上述專為角膜生物力學(xué)測量開發(fā)的各種檢測手段和儀器之外，近期，Pye[27]還介紹了2種使用臨床現(xiàn)有儀器估算活體角膜彈性模量的方法。一種方法適用于所有人群，其利用Goldmann壓平眼壓計(jì)和帕斯卡動態(tài)角膜眼壓計(jì)(pascal dynamic corneal tonometer，PDCT)測量中央角膜曲率(central corneal curvature，CCC)、CCT和眼壓，計(jì)算表征角膜硬度的Ecalc值。PDCT可在任何情況下得到更準(zhǔn)確真實(shí)的眼壓，使角膜硬度的測量結(jié)果更接近真實(shí)。另一種方法僅適用于年輕健康人，利用Goldmann壓平眼壓計(jì)測得CCT和Goldmann眼壓(tonometer intraocular pressure of Goldmann，IOPG)，計(jì)算Eiopg值。Pye[27]認(rèn)為由于年輕健康成人的Ecalc和Eiopg之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，而且CCC對Eiopg沒有影響，因此，僅從CCT和IOPG計(jì)算正常角膜Eiopg表征角膜硬度是可行的。CCT和IOPG是在臨床中常規(guī)測量的指標(biāo)，這將使Eiopg在臨床中相對容易獲得。

目前的角膜硬度測量方法取得諸多進(jìn)展，也面臨相當(dāng)多的技術(shù)及應(yīng)用挑戰(zhàn)。在未來的一段時(shí)間內(nèi)，相關(guān)的研究工作仍集中在兩方面：(1)使用已相對成熟的技術(shù)對角膜硬度這一生物力學(xué)特性進(jìn)行分析，深化其參與角膜功能的調(diào)節(jié)及相關(guān)疾病的發(fā)展中作用的認(rèn)知，提高包括臨床醫(yī)師在內(nèi)的研究人員對該領(lǐng)域的認(rèn)識；(2)探索新的用于檢測角膜硬度的技術(shù)手段，這將有助于開發(fā)更精確便捷的檢測手段，有助于相關(guān)研究的開展。

3 影響角膜硬度的因素

角膜生物力學(xué)由細(xì)胞外基質(zhì)、膠原層、滲透壓、激素和環(huán)境條件共同決定[28]，凡是影響上述條件的因素都可能對角膜硬度產(chǎn)生影響。角膜自身狀態(tài)、角膜水合狀態(tài)和膠原交聯(lián)狀態(tài)的改變與角膜硬度的改變密切相關(guān)。角膜基質(zhì)的含水量為80%，其水合狀態(tài)是影響角膜硬度的因素之一[29]。Hatami-Marbini等[30]研究了豬角膜硬度與水化/脫水引起的角膜厚度變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)豬角膜面內(nèi)彈性模量隨角膜厚度的減小(脫水)而增大。此外，與脫水的角膜相比，腫脹的角膜具有更柔軟的拉伸特性、更低的硬度[31]。有研究關(guān)注膠原交聯(lián)狀態(tài)與角膜硬度相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，糖基化誘導(dǎo)的角膜基質(zhì)膠原纖維間交聯(lián)增加，膠原蛋白不斷沉積導(dǎo)致膠原纖維橫截面積增加，這兩種年齡相關(guān)的角膜變化均可能使得角膜隨著年齡的增長而變得越來越硬[32-33]。

3.1 眼部疾病及手術(shù)眼部疾病，尤其是涉及角膜的疾病會對角膜硬度產(chǎn)生影響，如角膜營養(yǎng)不良性疾病、KC、遲發(fā)性芥子氣性角膜病等。相關(guān)研究表明，角膜硬度與眼壓、屈光不正和前房容積也有一定的相關(guān)性，但角膜硬度與上述因素的因果關(guān)系尚無明確定論[34-36]。此外，角膜手術(shù)也會改變角膜的硬度，如角膜交聯(lián)術(shù)可增強(qiáng)角膜硬度、角膜屈光手術(shù)和白內(nèi)障手術(shù)可降低角膜硬度[37-39]。角膜基質(zhì)是角膜硬度的主要貢獻(xiàn)組織，侵及基質(zhì)層的感染性角膜炎、角膜外傷及基質(zhì)層的清創(chuàng)操作均會對角膜硬度產(chǎn)生一定程度的影響，然而，不同因素導(dǎo)致的角膜損傷及疾病的不同病程對角膜硬度的影響尚需進(jìn)一步研究。

3.2 激素和全身性疾病除眼部的影響因素外，激素和全身性疾病也可對角膜硬度產(chǎn)生影響。Spoerl等[40]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可使豬角膜硬度降低，并提出這或可解釋女性屈光手術(shù)后角膜擴(kuò)張的發(fā)生率高于男性的臨床現(xiàn)象。自身免疫性疾病，如Sj?gren 綜合征、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等均表現(xiàn)出角膜硬度降低[41-42]。糖尿病是一種以高血糖為特點(diǎn)的常見的代謝性疾病，高血糖增加糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-product，AGE)介導(dǎo)的膠原纖維非酶交聯(lián)，進(jìn)而增加角膜硬度[43-44]。此外，糖尿病患者的血糖控制水平也可對角膜硬度產(chǎn)生影響，血糖控制不佳的糖尿病患者角膜硬度更高[45]。

3.3 藥物影響某些藥物的使用也可影響角膜硬度。研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可降低角膜硬度，Spoerl等[46]發(fā)現(xiàn)使用含氫化可的松的培養(yǎng)基孵育新鮮豬角膜可使角膜彈性模量減小，角膜硬度降低37%；與之類似的是 Yu等[47]發(fā)現(xiàn)用氟米龍給兔滴眼8周，實(shí)驗(yàn)組角膜硬度較對照組降低33.5%。前列腺素也可降低角膜硬度，將兔角膜分別在曲伏前列素溶液和無曲伏前列素的相似溶液中保存10 d，結(jié)果顯示，曲伏前列素溶液組的角膜硬度明顯降低[48]。

4 角膜硬度與眼部疾病的相關(guān)性

隨著角膜硬度檢測技術(shù)的進(jìn)步和對眼部疾病認(rèn)識的深入，角膜生物力學(xué)在眼科疾病診療中的作用也逐漸被發(fā)掘。角膜硬度已被應(yīng)用于KC的診斷、眼壓的精準(zhǔn)測量以及屈光術(shù)后殘余屈光不正的預(yù)測等。

4.1 角膜硬度與圓錐角膜KC是一種以角膜變薄和擴(kuò)張為特征的雙側(cè)進(jìn)行性角膜病變，可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙，其特征是中央或中央旁基質(zhì)變薄、角膜曲率改變、角膜細(xì)胞密度降低、膠原纖維板層數(shù)量減少及基質(zhì)中的成纖維細(xì)胞降解[41]。角膜基質(zhì)是角膜生物力學(xué)特性的主要貢獻(xiàn)結(jié)構(gòu)，KC患者表現(xiàn)為角膜硬度降低，對于尚無臨床癥狀的KC患者，角膜生物力學(xué)的檢測也是發(fā)現(xiàn)并診斷KC的重要手段[49-50]。另外，Shah等[50]發(fā)現(xiàn)，隨著KC病情進(jìn)展，角膜硬度隨之降低。交聯(lián)或手術(shù)治療后的KC患者角膜硬度的隨訪對評估治療效果和預(yù)測疾病復(fù)發(fā)也有極為重要的意義[51]。

4.2 角膜硬度與屈光手術(shù)角膜屈光手術(shù)破壞了角膜的原有結(jié)構(gòu)，會對角膜生物力學(xué)特性產(chǎn)生一定程度的影響，表現(xiàn)為角膜硬度降低。Ortiz等[52]比較了KC患者和LASIK術(shù)后患者的角膜硬度，盡管LASIK術(shù)后角膜硬度有所降低，但依然高于KC患者角膜硬度。與之不一致的是，Shah等[50]發(fā)現(xiàn)，LASIK和LASEK術(shù)后角膜硬度明顯降低，但與KC患者相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。角膜屈光手術(shù)改變角膜硬度的潛在影響因素很多，如手術(shù)方式、消融深度及患者的屈光不正類型等，因此兩項(xiàng)研究結(jié)果存在差異并不奇怪，但是屈光術(shù)后角膜硬度降低的趨勢是一致的。

角膜擴(kuò)張是角膜屈光術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥，考慮到角膜擴(kuò)張是角膜組織結(jié)構(gòu)的直接變化，其產(chǎn)生必然與角膜生物力學(xué)存在相關(guān)性。通過將角膜硬度檢查納入到角膜屈光術(shù)前及術(shù)后常規(guī)分析，對照角膜擴(kuò)張的患者及其他患者，可幫助人們探索角膜硬度及其他生物力學(xué)參數(shù)與角膜擴(kuò)張發(fā)生的相關(guān)性，同時(shí)探索其能否作為預(yù)測發(fā)生角膜擴(kuò)張或KC的風(fēng)險(xiǎn)因子，有助于完善屈光手術(shù)的診療流程。

4.3 角膜硬度與青光眼青光眼是最常見的致盲性眼病之一，眼壓是其診斷、預(yù)后及治療效果監(jiān)測的關(guān)鍵指標(biāo)，因此，準(zhǔn)確的眼壓監(jiān)測對青光眼患者管理十分重要。目前測量眼壓的金標(biāo)準(zhǔn)是Goldmann壓平眼壓計(jì)測量法，但是其準(zhǔn)確性受角膜整體硬度的影響[53]。Vinciguerra等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與正常受試者、高眼壓癥患者、高眼壓青光眼患者相比，正常眼壓青光眼患者角膜硬度參數(shù)SP-A1明顯降低。此外，他們還對原發(fā)性開角型青光眼患者視野丟失情況和角膜生物力學(xué)相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)角膜硬度較小的患者更容易出現(xiàn)視野丟失[25]。

青光眼患者的臨床管理中應(yīng)該考慮到角膜硬度對眼壓測量的影響，對正常眼壓青光眼患者有必要將低角膜硬度作為預(yù)測其進(jìn)展的危險(xiǎn)因素[25]。由于糖尿病患者的角膜硬度會因AGE介導(dǎo)的膠原纖維非酶交聯(lián)增加而變硬，導(dǎo)致測量眼壓過高，這可能增加青光眼的誤診率。因此，針對糖尿病患者的眼壓測量也應(yīng)考慮到這一點(diǎn)[54]。

4.4 角膜硬度與角膜上皮損傷愈合角膜上皮是角膜的最表層組織，感染、外傷及理化刺激等因素可使其損傷。角膜上皮損傷后，可以通過上皮細(xì)胞的增殖和遷移完全修復(fù)。角膜硬度可對上述細(xì)胞行為產(chǎn)生重要影響，Masterton等[55]發(fā)現(xiàn)較硬的底物傾向于促進(jìn)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)成熟的角膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生；而較軟的底物則更有助于維持細(xì)胞的干性，誘導(dǎo)角膜緣干細(xì)胞表型表達(dá)。Gouveia等[56]關(guān)于角膜硬度影響上皮細(xì)胞行為的在體研究顯示，利用膠原酶軟化堿燒傷兔角膜，可促進(jìn)角膜緣上皮干細(xì)胞樣表型表達(dá)，從而改善堿燒傷愈合。此外，角膜硬度還可影響間充質(zhì)干細(xì)胞對角膜上皮損傷愈合的促進(jìn)作用[57]。鑒于此，在臨床工作中角膜上皮愈合不良的患者是否存在角膜硬度異常需要進(jìn)一步探索和研究。

雖然本綜述只提及了角膜硬度與KC、角膜屈光手術(shù)、青光眼、角膜上皮損傷愈合等常見眼科疾病中的相關(guān)性，但其臨床價(jià)值遠(yuǎn)不止于此,需持續(xù)不斷地進(jìn)行相關(guān)研究。

5 總結(jié)

綜上所述，角膜硬度是最常見的生物力學(xué)指標(biāo)之一，其大小受多種因素影響。角膜硬度既會影響眼部疾病的發(fā)生，又會隨著疾病的進(jìn)展而變化。在診治和隨訪相關(guān)疾病過程中，臨床醫(yī)師應(yīng)充分考慮到角膜硬度的影響，并監(jiān)測角膜硬度變化情況。此外，角膜硬度的測量方式和參考指標(biāo)并無統(tǒng)一，未來的研究中期待有更精確、標(biāo)準(zhǔn)的測量手段和計(jì)算模型服務(wù)于臨床和科研。