前列腺癌早期診斷及術(shù)后檢測(cè)試劑盒的研發(fā)*

陳勝輝，劉居理，陳伊，蔣祥龍，饒研文（南昌市生殖醫(yī)院，江西 南昌330006）

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，在歐美前列腺癌是男性癌癥死亡的主要原因之一［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，前列腺癌的發(fā)病率在北歐各國(guó)占男性腫瘤的第一位，目前北歐前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)美國(guó)，成為威脅男性健康的第一位腫瘤。近年來(lái)，我國(guó)的前列腺癌發(fā)病率明顯增加［2］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率已在所有腫瘤中居第十位，引起高度關(guān)注。前列腺癌的發(fā)病與年齡呈正相關(guān)，年齡越大，發(fā)病率越高。發(fā)病比較隱匿，癥狀容易和其他良性前列腺疾病如前列腺肥大等混淆，疾病的進(jìn)展比較緩慢。在我國(guó)，由于對(duì)前列腺癌的認(rèn)知程度比較低，沒(méi)有作定期體檢，因此很多病人都是到晚期出現(xiàn)癥狀以后才就診。

目前，前列腺癌的診斷和術(shù)后隨訪主要依靠血前列腺特異性抗原檢查，但其敏感性低，尤其在腫瘤的早期。除前列腺癌以外，許多因素均能導(dǎo)致血清PSA升高，包括泌尿系統(tǒng)感染、直腸或尿道內(nèi)檢查、尿潴留等［3］。文獻(xiàn)報(bào)道，PSA診斷前列腺癌的敏感性為43%～81%，特異性為59%～93%。尤其是tPSA值介于4.0ng/ml～10.0ng/ml之間的灰區(qū)時(shí)，其對(duì)前列腺癌的特異性顯著下降，僅大約25%左右為前列腺癌［4］。針對(duì)前列腺癌早期診斷存在的不足，急需研發(fā)一種靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的前列腺癌早期診斷試劑盒。本文擬通過(guò)分析尿外泌體中前列腺癌標(biāo)志物CA9和Survivin與前列腺癌的關(guān)系，旨在研發(fā)出一種靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)的前列腺癌早期診斷并可適用于前列腺癌術(shù)后隨訪的試劑盒。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月～2020年6月我院收治的前列腺癌患者50例為觀察組，選取同期收治的前列腺增生患者30例為對(duì)照組，選取健康志愿者20例健康組。觀察組年齡69.0±6.3歲；對(duì)照組年齡69.2±6.2歲；健康組年齡68.9±6.4歲。三組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的年齡資料比較，無(wú)顯著差異（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 觀察組納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）未給予激素治療、放療或手術(shù)治療；（2）所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移前列腺癌患者；（2）經(jīng)手術(shù)、放化療治療后存活5年且病情穩(wěn)定的前列腺癌患者；（3）嚴(yán)重肝腎功能異常的患者。

1.3 方法

1.3.1 尿液標(biāo)本收集 收集上述研究對(duì)象晨尿30ml，離心后棄去沉渣，留取尿液上清，-80℃儲(chǔ)存，用于后續(xù)提取外泌體。

1.3.2尿外泌體的提取 將上述尿液上清解凍并離心，取10ml尿液上清進(jìn)行外泌體的提取，提取方法按ExoQuick試劑（System Biosciences公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 外泌體RNA的提取 尿液外泌體RNA的提取采用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒（QIAGEN公司），根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行RNA的抽提，所得總RNA經(jīng)濃度測(cè)定后用于RT-PCR。

1.3.4 CA9和Survivin的RT-PCR檢測(cè) 取上述提取的RNA為模板，采用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA公司）進(jìn)行cDNA的合成，實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分別取8μl cDNA為模板，采用20μl反應(yīng)體系，以β-actin作為內(nèi)參，按照SYBRPremix Ex TaqTMII PCR試劑盒（TAKARA公司）要求進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外泌體中CA9和Survivin表達(dá)與否。其中CA9的引物為F：GGACAAAGAAGGGGATG ACC；R：AGTTCTGGGAGCGGCGGGA。Survivin的引物為F：TCTGGCGTAAGATGATGGA；R：CACAGCAGTGTTTGAAATGAC。β-actin的引物為F：AGCGGGAAATCGTGCGTG；R：CAGGGTACATGGTGGTGCC。反應(yīng)條件如下：95℃10min預(yù)變性，95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用±s表示，行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例（百分率）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組中有41例尿外泌體中檢測(cè)出CA9或Survivin，其中CA9陽(yáng)性30例，Survivin陽(yáng)性34例。對(duì)照組及健康組未檢測(cè)出CA9或Survivin。觀察組CA9和Survivin的檢出率顯著高于對(duì)照組、健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)照組CA9和Survivin的檢出率與健康組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；單獨(dú)采用CA9對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行檢測(cè)其檢出率為60.0%，單獨(dú)采用Survivin對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行檢測(cè)其檢出率為68.0%，而采用CA9聯(lián)合Survivin對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行檢測(cè)其檢出率為82.0%。

3 討論

當(dāng)前，尋找尿液中標(biāo)志物來(lái)早期發(fā)現(xiàn)或診斷前列腺癌是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，以期減少或替代創(chuàng)傷性檢查。前列腺癌腫瘤標(biāo)志物一直是前列腺癌研究的一個(gè)重點(diǎn)，到目前為止，用的最多還是前列腺特異性抗原（PSA），但光靠這個(gè)經(jīng)典指標(biāo)或多或少存在敏感性不高，假陽(yáng)性率和假陰性率過(guò)高的問(wèn)題，無(wú)法取代前列腺穿刺活檢。液體活檢領(lǐng)域是一個(gè)很有潛力的領(lǐng)域。隨著研究發(fā)現(xiàn)的不斷積累，越來(lái)越多的疾病將可以使用體液檢測(cè)來(lái)實(shí)現(xiàn)診斷和監(jiān)控。液體活檢主要包括血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞、游離DNA、外泌體等。其中外泌體發(fā)現(xiàn)比較新，雖然發(fā)展迅速，但醫(yī)院還未見(jiàn)外泌體的診斷試劑盒出現(xiàn)。

外泌體是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，一直被認(rèn)為是一種細(xì)胞廢棄物［5］。最近發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號(hào)分子傳遞給其它細(xì)胞從而影響其它細(xì)胞的功能，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長(zhǎng)與遷移、組織損傷的修復(fù)等［6］。不同細(xì)胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物［7］。最新研究表明，尿上清中有大量從癌細(xì)胞分泌出來(lái)的外泌體，這些外泌體含有大量RNA或DNA標(biāo)記物。因此，檢測(cè)尿液中外泌體DNA或RNA標(biāo)記物有望為前列腺癌的診斷提供一個(gè)新方法。生存素（Survivin）基因是一種重要的凋亡抑制基因，它有獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能［8］。在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和血管形成中有著關(guān)鍵作用［9］。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，研究表明在正常組織中無(wú)表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展和術(shù)后判斷有關(guān)，在前列腺癌中有較多研究。Survivin在前列腺癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)表達(dá)分別為55%、75%、81%。說(shuō)明惡性程度越高Survivin表達(dá)越豐富［10］。碳酸酐酶9（Carbonic anhydrase 9，CA9）屬于碳酸酐酶的成員，主要功能為調(diào)節(jié)PH和維護(hù)正常生理功能［11］。CA9為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記物。CA9在腫瘤的表達(dá)主要是由于缺氧而導(dǎo)致HIF1X升高后引起CA9的表達(dá)增加，研究表明CA9是前列腺癌一個(gè)新的標(biāo)記物［12］。目前國(guó)內(nèi)外尙無(wú)CA9和Survivin診斷前列腺癌的專門(mén)試劑盒，而當(dāng)前我國(guó)腫瘤診斷試劑行業(yè)比較落后，產(chǎn)業(yè)化的項(xiàng)目還是那些常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物，急需開(kāi)發(fā)一些新腫瘤標(biāo)志物并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化。本研究表明，可以通過(guò)檢測(cè)尿外泌體中的CA9和Survivin來(lái)輔助診斷前列腺癌及用于術(shù)后隨訪，具有較好地敏感性及特異性。

綜上所述，若能將CA9和Survivin作為標(biāo)志物進(jìn)行試劑盒的組裝應(yīng)用于前列腺癌的早期診斷及術(shù)后隨訪具有一定的應(yīng)用前景。