豬精液常溫保存稀釋粉研究進(jìn)展

賀巾津，牛統(tǒng)娟，李 宇，張利坤，馮天雨，張 星，張 眉，胡建宏*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2. 陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西 西安 710016)

豬肉在所有肉類消費(fèi)品中占有非常大的比重，是美食制作及生活中不可或缺的肉類食材，隨著社會的發(fā)展人們生活質(zhì)量得到了不斷的提升，豬肉的消費(fèi)量也逐漸增加。2017年我國生豬的存欄量占世界生豬存欄量的56.56%，生豬出欄量占比54.45%，豬肉產(chǎn)量占比48.09%；2017年世界豬肉消費(fèi)量11058×104t，我國豬肉消費(fèi)量5481×104t，占世界豬肉消費(fèi)量的49.6%[1]。

人工授精作為現(xiàn)代化養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要技術(shù)手段，在生豬生產(chǎn)和繁殖中有非常必要和十分突出的作用，是生豬生產(chǎn)的重要保障。當(dāng)前，人工授精技術(shù)在國內(nèi)已經(jīng)普及，在我國大約有80%～90%的大型養(yǎng)殖場使用人工授精技術(shù)，50%～60%的小型養(yǎng)殖場也在使用人工授精技術(shù)[2]。在生產(chǎn)中使用人工授精技術(shù)可以減少種公豬的存欄量、減少疾病的傳播和不受時間地點(diǎn)限制來利用優(yōu)良基因，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。豬精液的保存方法按保存溫度不同分為三種，常溫保存(17～25 ℃)、低溫保存(0～5 ℃)、冷凍保存(-196～-79 ℃)。由于人工授精應(yīng)用豬冷凍精液會導(dǎo)致母豬受胎率和產(chǎn)仔數(shù)降低，在實(shí)際生產(chǎn)中主要采用豬精液常溫保存技術(shù)。豬精液常溫保存技術(shù)的發(fā)展使豬精液常溫保存稀釋粉應(yīng)運(yùn)而生。

豬精液常溫保存稀釋粉用于配置稀釋液，為精子提供一個適宜其生存并能保存其受精能力、適當(dāng)pH和滲透壓的環(huán)境，保證精子在體外能夠存活較長時間并且結(jié)構(gòu)完整[3]。雖然不同產(chǎn)品之間配方不同，但其成分基本類似，一般包括營養(yǎng)物質(zhì)、緩沖劑、抗氧化劑、抗菌劑及其他保護(hù)成分。本文綜述了豬精液常溫保存稀釋粉中營養(yǎng)物質(zhì)、緩沖劑、抗菌劑、抗氧化劑、無機(jī)鹽離子及其他保護(hù)成分的研究進(jìn)展，目的在于為今后豬精液常溫保存稀釋粉配方的研發(fā)提供理論依據(jù)，起到參考作用。

1 豬精液常溫保存技術(shù)

豬精液的保存根據(jù)其保存溫度的不同分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存。由于公豬精子膜結(jié)構(gòu)的特殊性使之對低溫特別敏感，容易產(chǎn)生冷應(yīng)激。豬精液進(jìn)行冷凍保存后凍融精子的活力不易恢復(fù)，且受精能力和受孕率都不高，這限制了冷凍保存精液的使用[4]，所以生產(chǎn)中常常采用常溫保存精液。

豬精液常溫保存是指將稀釋后的精液在15～25 ℃的條件下保存的技術(shù)，又稱為室溫保存。常溫保存主要是采用弱酸環(huán)境抑制精子活動和代謝，減少能量的消耗，再恢復(fù)pH等環(huán)境條件又使精子復(fù)蘇的原理來達(dá)到保存精液的目的。在豬精液常溫保存過程中會受到溫度、滲透壓、pH、稀釋倍數(shù)、抗氧化劑、緩沖劑、細(xì)菌等多種因素的影響[5]。而隨著保存時間的延長引起精液質(zhì)量不斷下降的兩大因素就是活性氧和微生物，過量的活性氧會對精子的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生損傷，而微生物的滋生會大量消耗精子的營養(yǎng)物質(zhì)，并增加豬生殖機(jī)能降低的風(fēng)險。目前，豬精液常溫保存稀釋粉種類非常多，但大多數(shù)都是美國、丹麥、日本、法國等國外專利產(chǎn)品。為了提高產(chǎn)品競爭力，國內(nèi)研究者也在不斷努力研制國產(chǎn)稀釋粉產(chǎn)品，研究通過添加抗氧化劑、抗菌劑、中草藥提取物等提高豬精液的保存效果[6]。維生素E、谷氨酰胺、谷胱甘肽、褪黑激素、五味子乙素和?；撬岬瘸Ｗ鳛榭寡趸煞钟糜谪i精液常溫保存，來減緩氧化應(yīng)激對精子造成的影響，提高精液保存質(zhì)量[7]。

2 豬精液常溫保存稀釋粉

一般情況下，稀釋粉配方應(yīng)該滿足以下要求：首先是在為精子提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時對精子沒有毒副作用；其次是稀釋粉pH、滲透壓要適宜精子存活；最后是稀釋粉的原料成本較低，成分簡單。

常溫保存稀釋粉按保存精液的時間長短分為短效稀釋粉(1～3 d)、中效稀釋粉(4～5 d)和超長效稀釋粉(7～14 d)三種[8]。規(guī)?；i場通常使用短效稀釋粉，因?yàn)槠涑煞窒鄬唵?。常見的短效稀釋粉有BTS、Kive和BL-1，其中保存效果和適用性最高的是BTS。中效稀釋粉的種類較多，有效保存精液時間為4～5 d。而長效稀釋粉通常都可以保存5d以上，成分相對于其他兩種要復(fù)雜一些，其中Diltec能有效保存精液5～10 d，而力之源則可以有效保存精液長達(dá)7～14 d[9]。

2.1 營養(yǎng)物質(zhì)

精子在常溫保存過程中需要消耗能量來維持其代謝和運(yùn)動、完成獲能、超活化和頂體反應(yīng)。精子的代謝活性以及它們在體外保存后利用ATP的能力，決定了精子的能量狀態(tài)，體外保存精子的受精能力可能受到可用ATP數(shù)量的限制[10]。精子在體外常溫保存時，精子細(xì)胞除了消耗自身很少的ATP外，主要通過稀釋液中的糖類來獲取能量，此外稀釋液中的糖類還能夠維持精液滲透壓的動態(tài)平衡。常添加的糖類主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖和海藻糖等，而葡萄糖因?yàn)閮r格低廉應(yīng)用最為廣泛[11]。其中果糖和葡萄糖這樣分子量低的糖可以穿過精子質(zhì)膜，而像蔗糖、海藻糖和葡聚糖則不能穿過精子質(zhì)膜，但是其可以和質(zhì)膜中的磷脂相互作用，從而穩(wěn)定精子膜蛋白質(zhì)-脂類復(fù)合物，起到保護(hù)精子膜的作用，提高精子活率。高建明等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液常溫保存稀釋液中添加1.5 g/L海藻糖可以提高精液保存效果。潘紅梅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，用66.7%的蔗糖與33.3%的乳糖組合添加，精子活力達(dá)37.0%，顯著高于其它各組，說明在稀釋液中添加乳糖能夠提高豬精子活力。因此，在豬精液常溫稀釋粉配方中，營養(yǎng)物質(zhì)至關(guān)重要，它能夠?yàn)榫拥拇x及其運(yùn)動提供能量，保障精子能夠完成受精。

2.2 緩沖劑

新鮮豬精液的pH為7.2～7.5，若是pH低于這個范圍，將會對精子活力產(chǎn)生較大的影響。弱酸性環(huán)境更適宜精子的生存，更有利于精液的常溫保存，能夠提高精液的常溫保存效果。精子的主要代謝途徑是糖酵解，在代謝過程中會產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)降低環(huán)境中的pH[7]。過多酸性物質(zhì)的積累會導(dǎo)致精子代謝過程減慢甚至出現(xiàn)精子酸中毒死亡現(xiàn)象[14]。在精液常溫保存過程中，為了保持其內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，添加適量的緩沖劑變得非常必要[15]。目前常用的緩沖劑主要有檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES、MOPS、TES和Tris等。鮮紅等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Tris的緩沖效果要優(yōu)于NaHCO3-檸檬酸鈉體系，Tris作為緩沖劑可以顯著增加精液常溫保存的時間。由此可見，在豬精液常溫稀釋液中添加一定量的緩沖劑可以維持精子細(xì)胞外環(huán)境的相對穩(wěn)定，增加精液常溫保存的時間，從而提高精液保存效果。

2.3 抗菌劑

在豬精液常溫保存過程中，適宜的溫度、pH、滲透壓和營養(yǎng)物質(zhì)等環(huán)境容易引起細(xì)菌微生物的滋生，對精液保存質(zhì)量造成不良影響。大量滋生的細(xì)菌微生物會與精子爭奪稀釋液中的營養(yǎng)成分，而細(xì)菌微生物的代謝產(chǎn)物會對精子的生存造成危害，導(dǎo)致精子細(xì)胞死亡。Althouse等[17]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌體內(nèi)的凝集因子會使得精子發(fā)生凝集效應(yīng)，改變精液稀釋液的滲透壓，造成精子頂體腫脹破損，精子進(jìn)行無氧發(fā)酵產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使精液稀釋液的pH下降，嚴(yán)重影響到精液的保存時間和質(zhì)量。常見的細(xì)菌有沙門菌、變形桿菌、大腸桿菌、棒狀桿菌、葡萄球菌、鏈球菌等。

豬精液中的細(xì)菌污染源主要分為動物源和非動物源兩種。因此，在采集精液和處理精液時加強(qiáng)衛(wèi)生管理，可以減少非動物源的細(xì)菌污染；同時也可以加入抗生素來抑制細(xì)菌微生物的生長繁殖[18]。在豬精液常溫保存中，為了提高精液保存質(zhì)量，通常會添加合適濃度的抗生素對細(xì)菌微生物的生長繁殖進(jìn)行抑制。添加抗生素可以有效抑制細(xì)菌的繁殖，能夠有效增加精液保存的時間，提高母豬受胎率[19]。慶大霉素在豬精液稀釋液BTS中的標(biāo)準(zhǔn)添加量為0.25 g/L。劉兆軍[20]研究表明，在BTS中添加0.2 g/L的雙乙酸鈉替代40%的慶大霉素，可以起到和標(biāo)準(zhǔn)添加量相同的保存效果。

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)豬精液中常見的一些細(xì)菌已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥性，而且一些喹諾酮類抗生素由于存在食品安全問題已被國家農(nóng)業(yè)部禁用。所以，研發(fā)新型的抗生素替代物變得至關(guān)重要。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作為一種具有廣譜抗菌性的天然物質(zhì)，受到廣泛的關(guān)注。Puigtimonet等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液稀釋液中添加3 μM的兩種抗菌肽，豬β防御素-1(PBD1)和豬β防御素-2(PBD2)，可以抑制一部分細(xì)菌的生長。雖然AMPs具有廣譜、快速的殺菌活性以及低耐藥性，但研究發(fā)現(xiàn)一些特定的AMPs對精子細(xì)胞有毒害作用[19]。因此，人們在尋找更多的新型抗生素替代物，希望能夠替代抗生素廣泛應(yīng)用在豬精液常溫保存中。王健[22]研究表明，稀釋液中添加80 μM的蛋氨酸碘能夠顯著抑制變形桿菌屬、葡萄球菌屬以及假單胞菌的生長繁殖，從而改善了公豬精子的活力和質(zhì)膜完整性，提高了豬精液常溫保存效果。魏寧等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液稀釋液中添加0.16 g/L的ε-聚賴氨酸最多可替代75%標(biāo)準(zhǔn)添加量的慶大霉素。溶菌酶是一種抗菌物質(zhì)，能夠直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁起抑菌作用。鄧昌海[24]研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液中添加2.0 mg/mL的溶菌酶在豬精液常溫稀釋液中能顯著提高精液的活力以及質(zhì)膜頂體完整率。因此，在豬精液常溫稀釋液中添加合適濃度的抗生素類替代物的抗菌劑能夠提高精液保存質(zhì)量，同時又不會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，有助于加強(qiáng)畜產(chǎn)品生物安全。

2.4 抗氧化劑

在正常生理情況下，精液具有一定的抗氧化能力。精子在代謝過程中會產(chǎn)生一定量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。合適水平的ROS對精子結(jié)構(gòu)以及功能的成熟等有一定的有利作用[25]，同時對維持精子體內(nèi)穩(wěn)態(tài)、精子發(fā)生細(xì)胞的生長、精子的獲能、增加頂體反應(yīng)發(fā)生率等具有促進(jìn)作用[26]。當(dāng)精子中積累的ROS超出了精子自身的抗氧化能力后，會對精液的質(zhì)量造成不良影響，這是因?yàn)楣i精子比較特殊，精子質(zhì)膜中不飽和脂肪酸、磷脂酞乙醇胺和鞘氨醇較高，這些脂類極易受到ROS的攻擊而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物丙二醛等，使精子產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對精子產(chǎn)生毒害作用，造成精子質(zhì)膜、頂體、線粒體損傷[27]。而抗氧化劑能夠有效的抑制或者減緩自由基的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)精子細(xì)胞氧化還原平衡，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，降低精子細(xì)胞受到的氧化損傷。因此，為了降低ROS對精子的氧化損傷，在稀釋粉中添加抗氧化劑成為保護(hù)精子在保存過程中免受氧化應(yīng)激的有效方法。

抗氧化劑主要包括酶類和非酶類抗氧化劑。酶類抗氧化劑包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶等。谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶能夠通過將過氧化氫還原成水分子來清除過氧化氫從而起到抗氧化作用。非酶類抗氧化劑主要有α-硫辛酸、褪黑素、谷胱甘肽、類胡蘿卜素、維生素類、銅、鋅、硒等。谷胱甘肽是一種強(qiáng)的抗氧化劑，谷胱甘肽分子中的巰基容易被氧化脫氫，從而將細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫還原成水，清除細(xì)胞內(nèi)自由基，減少自由基對細(xì)胞造成的氧化損傷。褪黑激素(Melatonin )是一種有很強(qiáng)抗氧化性能的內(nèi)源性抗氧化劑，能夠有效清除細(xì)胞中自由基，減少氧化損傷。維生素E作為親脂性抗氧化劑，帶有過氧化氫自由基清除基團(tuán)(LOO)，能夠保護(hù)精子質(zhì)膜中多不飽和脂肪酸免受過氧化損傷。

Ajina等[29]研究表明，維生素E和鋅都能起到一定的抗氧化作用，能夠提高精子的活率。何蘭花等[30]研究發(fā)現(xiàn)，添加維生素E的豬精液常溫保存稀釋液能夠有效提高精子活率，從而改善精液品質(zhì)。朱林煒[11]研究發(fā)現(xiàn)，在BTS中添加1 mmol/L的GSH精子活率最高0.753，添加200 IU/mL SOD精子活率最高(0.683±0.006)，兩者都能夠增強(qiáng)豬精液常溫保存的效果。在豬精液常溫稀釋液中添加0.5 μmol/L蝦青素，能夠提高精子的活力[31]。所以，在豬精液常溫稀釋液中添加合適濃度的抗氧化劑能夠顯著提高精液保存質(zhì)量，延長保存時間，從而提高精液保存效果。

2.5 無機(jī)鹽離子

在豬精清中含有Na+、K+、Ca2+、Mg2-、Cl-、P043-以及HCO3-等無機(jī)離子。K+有利于維持精子的運(yùn)動能力；而過量的HCO3-會導(dǎo)致腺普酸環(huán)化酶的異常活化，從而誘導(dǎo)精子提前獲能，不利于精液在體外常溫保存；同樣當(dāng)Ca2+濃度過高時，也會導(dǎo)致精子的提前獲能和頂體反應(yīng)，影響精液品質(zhì)[32]。六價鉻是一種廣泛存在的重金屬離子，精液中的六價鉻會使精子受到氧化應(yīng)激損傷。所以，在配制常溫稀釋液時應(yīng)該使用去離子水，同時為了維持稀釋液pH和滲透壓的動態(tài)平衡，稀釋液配方中的無機(jī)鹽離子種類和添加濃度都應(yīng)該嚴(yán)格控制。同時，為了避免Cu2+和六價鉻等有害金屬離子對精子造成損傷，通常會在稀釋液中加入適量具有鰲合作用的EDTA[33]。所以，在豬精液常溫稀釋液中添加合適種類、適宜濃度的無機(jī)鹽離子能夠維持稀釋液的pH和滲透壓動態(tài)平衡，可以適當(dāng)延長豬精液體外保存時間，有效提高精液保存質(zhì)量。

2.6 其他保護(hù)劑

牛血清白蛋白(BSA)是一種蛋白類保護(hù)劑，通過中和精子產(chǎn)生的有害代謝物從而穩(wěn)定精子的結(jié)構(gòu)，維持精子運(yùn)動狀態(tài)和減少精子凝集，從而對精子起保護(hù)作用，BSA是一種良好的精子保護(hù)劑[34]。Shannon等[35]研究發(fā)現(xiàn)，牛血清白蛋白有利于維持精液-稀釋液體系膠體的滲透壓平衡，同時能夠提高精子質(zhì)膜和頂體完整性。在不同劑量BSA對豬精液常溫保存效果的研究中發(fā)現(xiàn)，添加4 g/L BSA的稀釋液的精子活率顯著高于其他組[36]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)添加適量的脫脂奶粉可以有效改善豬精液常溫保存效果[37]。劉琦[34]研究了四種氨基酸類保護(hù)劑三七皂甙R1、L-谷氨酞胺(Gln)、?；撬?Tau)和中藥活性成分五味子乙素(Sch B)對豬精液常溫保存效果的影響，發(fā)現(xiàn)添加5 mmol/L的三七皂甙R1、4 mmol/L的Gln、5 mmol/L的Tau以及15 μmol/L的Sch B可以顯著提高精子活率0.69，0.70，0.70，0.71，提高精液常溫保存效果。因此，在豬精液常溫稀釋液中添加適量的牛血清白蛋白、脫脂奶粉等其他保護(hù)劑，能夠有效改善豬精液常溫保存效果。

3 展 望

隨著我國現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展越來越迅速，人工授精技術(shù)的普及率也越來越高，所以研發(fā)出保存效果更好的豬精液常溫保存稀釋粉變得迫在眉睫。目前，市面上有許多新開發(fā)的添加劑在豬精液常溫保存稀釋粉中應(yīng)用，但是它們的最佳添加量及其作用的機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。而這些新型添加劑的研發(fā)和應(yīng)用對進(jìn)一步完善豬精液常溫保存技術(shù)起著重要作用，對推進(jìn)我國養(yǎng)豬業(yè)集約化發(fā)展有著重大意義。