單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及其應(yīng)用研究進展

巴黎根·達列力汗 , 常鋌晉, 汪富文, 王朝飛, 黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著二、三代測序技術(shù)不斷發(fā)展和迭代，單細胞測序(single cell sequencing, SCS)領(lǐng)域開始迅猛發(fā)展，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。為了描述機體發(fā)育或者疾病發(fā)展過程中細胞類型的多樣性，揭示各種類型細胞發(fā)揮的功能與機制，需要研究單個細胞之間產(chǎn)生的基因表達差異。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技術(shù)在單細胞水平上，首先需要從組織或體液樣本中的細胞群分離出單個細胞，通過無偏、高通量和高分辨率的轉(zhuǎn)錄組測序，從而獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，最后進行信息分析[1]。scRNA-seq方法目前在腫瘤、生殖、組織器官、免疫、神經(jīng)發(fā)育、動物遺傳育種等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

1 單細胞分離技術(shù)

單細胞分離是將組織或體液樣本中的細胞群分離成單個細胞，常用的方法包括：連續(xù)稀釋法、顯微操作法(Micromanipulation)、激光捕獲顯微切割法(Laser capture microdissection, LCM)、熒光激活細胞分選法(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)和微流控法(Microfluidics)等。

2 scRNA-seq技術(shù)

Eberwine等[2]報道了體外轉(zhuǎn)錄線性擴增技術(shù)，Brady等[3]報道了PCR擴增單個細胞的互補DNA(cDNAs)技術(shù)，這種技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合，衍生出了scRNA-seq技術(shù)。Fluidigm、WaferGen、10×Genomics和Illumina/Bio-Rad等測序平臺是目前最常見的單細胞測序平臺。scRNA-seq技術(shù)之所以不同于其他RNA測序技術(shù)，是因為它先分離出單個細胞后，再進行RNA轉(zhuǎn)化成cDNA，并通過擴增來生成高通量的測序方法。生物學(xué)研究中的很多新思路都是通過scRNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)的，例如新細胞類型的鑒定，再到后來的隨機基因表達全局模式的研究，也實現(xiàn)了通過多組學(xué)來揭示生物發(fā)育調(diào)控機制[4]。

3 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用

3.1 在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用

正常細胞通過不斷積累突變進化形成腫瘤細胞，在進化過程中由于惡化的細胞之間基因突變或表達譜的多樣化，形成不同類型細胞或同種類型細胞的不同亞型，導(dǎo)致腫瘤細胞間普遍存在異質(zhì)性，這對于臨床診斷及治療帶來了嚴重的影響[5]。scRNA-seq技術(shù)為描述克隆多樣性和了解稀有細胞在腫瘤研究中的作用提供了新的工具。

Ren等[6]通過scRNA-seq檢測患者及對照組胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)腫瘤樣本，揭示了腫瘤干細胞(CSC)樣導(dǎo)管細胞向具有侵襲性導(dǎo)管細胞轉(zhuǎn)化的軌跡，并篩選出了CSC相關(guān)基因(CRGs)。Song等[7]對4例早期非小細胞肺癌(NSCLC)患者的腫瘤和鄰近正常組織的細胞組成和轉(zhuǎn)錄動態(tài)進行了scRNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)骨髓細胞群在腫瘤和正常組織之間表現(xiàn)出最多樣化的變化，這與腫瘤介導(dǎo)的重編程一致，通過軌跡分析，確定了從CD14+單核細胞到M2巨噬細胞的分化路徑。Yu等[8]研究顯示，大多數(shù)雙側(cè)腎細胞癌(RCC)細胞類型的基因表達高度相似，但不同部位腫瘤細胞的基因表達存在顯著差異。此外，通過GO分析確定了不同腫瘤細胞類型的潛在生物學(xué)功能，為RCC的診斷和治療提供了新的思路。Zhou等[9]使用scRNA-seq對2075個腫瘤細胞進行測序，篩選出2940個細胞標記，又對396例膀胱癌患者進行瘤內(nèi)異質(zhì)性評估，鑒定出96個瘤內(nèi)異質(zhì)性相關(guān)基因；通過Lasso和Cox多元回歸建立8對基因模型用于評估癌細胞的總生存率，這有助于臨床治療結(jié)果的預(yù)測。

Dai等[10]利用scRNA-seq分析結(jié)腸直腸癌患者腫瘤組織中的2824個細胞，研究表明，可以將細胞分為5個不同的簇，每個簇內(nèi)的基因存在不同的功能。Zhang等[11]對膽囊癌(GBC)肝轉(zhuǎn)移組織進行了10X Genomics scRNA-seq，確定了8種細胞類型，共7788個細胞，研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細胞表現(xiàn)出高度的瘤內(nèi)異質(zhì)性，中性粒細胞與促進GBC細胞的增殖、遷移和侵襲有關(guān)，巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。Wang等[12]使用scRNA-seq對3例胃癌患者的原發(fā)癌和成對的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)癌組織進行了分析，確定了胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標記基因(ERBB2，CLDN11和CDK12)以及潛在的胃癌進化驅(qū)動基因(FOS和JUN)。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)是由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶經(jīng)過侵襲、脫落進入血液循環(huán)的腫瘤細胞[13]。Sun等[14]使用scRNA-seq對肝細胞癌(HCC)患者的肝靜脈(HV)、外周動脈(PA)、外周靜脈(PV)和門靜脈(PoV)等4個不同血管部位的113個單個循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)進行分析，發(fā)現(xiàn)在血液運輸過程中，CTCs的轉(zhuǎn)錄動態(tài)與應(yīng)激反應(yīng)、細胞周期和免疫逃逸信號有關(guān)；此外，還發(fā)現(xiàn)了趨化因子CCL5是CTCs免疫逃逸的重要中介因子。

3.2 在發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

3.2.1 生殖系統(tǒng)方面 單細胞測序技術(shù)最早運用于生殖生物學(xué)，但是仍然存在很多需要探索并解決的問題。卵母細胞的正常發(fā)育為生命的延續(xù)提供了保障。He等[15]對小鼠新生兒(P0.5)卵巢單個生殖細胞進行了RNA-seq檢測。通過分析，建立了卵母細胞發(fā)育的統(tǒng)一軌跡。GO富集分析顯示減數(shù)分裂相關(guān)基因顯著減少，卵母細胞特異性基因顯著增加，標志著從生殖細胞向功能性卵母細胞的轉(zhuǎn)變。另外，系統(tǒng)地重建了卵母細胞的分子級聯(lián)結(jié)構(gòu)，確定了卵泡形成和發(fā)育的一系列基因和分子通路。

精子的受精能力和前進動力都是在附睪運輸過程中獲得的，這些能力的獲得說明了附睪的重要性。雖然有附睪細胞圖譜的報道，但附睪管內(nèi)細胞的異質(zhì)性和基因表達譜仍是未知數(shù)。Shi等[16]應(yīng)用scRNA-seq研究了小鼠附睪細胞組成及其亞群，附睪段差異表達基因及線粒體相關(guān)基因的時空表達差異，全面提供了附睪單細胞水平的解析圖譜。研究結(jié)果還表明，附睪體和尾側(cè)上皮細胞線粒體水平升高可能參與了精子成熟過程。Law等[17]利用scRNA-seq對小鼠的精原干細胞(SSC)進行發(fā)育動力學(xué)研究，確定了前精原細胞在胎兒晚期和新生兒發(fā)育過程中經(jīng)歷的動態(tài)軌跡。

3.2.2 組織器官發(fā)育方面 Haber等[18]報道了首個高分辨率的小鼠小腸和類器官的基因表達圖譜，使得之前未知的小腸上皮細胞亞型及其基因標記的鑒定成為可能，為揭示腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及應(yīng)對病原體入侵提供了新的線索。Santos等[19]用scRNA-seq對小鼠尿路上皮類器官進行分析，發(fā)現(xiàn)有5種細胞類型，結(jié)合γ-分泌酶抑制劑的使用，證實Notch信號通路參與類器官的分化。Seow等[20]用scRNA-seq分析了5種不同的肝組織類型約30萬單個細胞，以確定可能涉及COVID-19病毒侵入的肝細胞類型，報道了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2和跨膜絲氨酸蛋白酶2在TROP2+肝祖細胞中的共表達，發(fā)現(xiàn)在冠狀病毒(COVID-19)相關(guān)的肝功能障礙和細胞死亡中，TROP2+肝祖細胞的病毒感染可能顯著損害患者的肝臟再生。單細胞測序技術(shù)在腎臟上也有著大量的研究，小鼠腎臟的性別、譜系和區(qū)域多樣性的單細胞測序技術(shù)應(yīng)用進一步推進了人類疾病建模和受損系統(tǒng)修復(fù)研究的快速進步[21]。Jia等[22]利用scRNA-seq技術(shù)描述了糖尿病模型小鼠的腎小球細胞中糖尿病腎病的動態(tài)變化，鑒定了五種不同的細胞群，包括腎小球內(nèi)皮細胞、系膜細胞、足細胞、免疫細胞和腎小管細胞，并確認了腎小球細胞特異性標記基因和幾個新的腎小球細胞潛在標記基因。

3.2.3 免疫學(xué)方面 Monika等[23]應(yīng)用PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞在多發(fā)性肌炎患者肌肉和血液組織中克隆性增生，隨后結(jié)合CDR3光譜分析、激光顯微解剖和單細胞PCR技術(shù)分析了其扮演的病理角色。Savas等[24]使用scRNA-seq分析了人乳腺癌中6311個T細胞，發(fā)現(xiàn)CD8+TRM與患者生存率提高相關(guān)，有更好的預(yù)后，并推測CD8+TRM參與對乳腺癌的免疫監(jiān)測，可能是免疫檢查點療法的關(guān)鍵靶點。CD4+細胞毒性T淋巴細胞(CD4-CTL)在幾種病毒感染中發(fā)揮保護作用。然而，人類對CD4-CTL生成的生物學(xué)、功能特性和異質(zhì)性知之甚少，特別是與其他描述良好的CD4+記憶T細胞亞群的關(guān)系。Patil等[25]通過對9000多個細胞的單細胞測序數(shù)據(jù)分析，闡明了人類CD4-CTL的異質(zhì)性、轉(zhuǎn)錄譜和克隆性。不同免疫細胞的異質(zhì)性也能夠通過單細胞測序去分析[26]，在器官水平上，有關(guān)于腎臟免疫排斥的單細胞測序研究更進一步解釋了器官水平的排斥反應(yīng)[27]。特應(yīng)性皮炎(AD)是一種流行的炎癥性皮膚病，發(fā)病機制復(fù)雜，涉及免疫細胞和表皮異常。He等[28]使用單細胞RNA測序，評估AD患者與對照組皮膚中細胞組成和細胞特異性基因表達的區(qū)別。除此以外，心臟的炎癥免疫機制也通過單細胞測序作了一定的研究。Martini等[29]使用單細胞RNA測序來繪制標準鼠非缺血性、壓力過載心力衰竭模型中的心臟免疫組成。通過將分析重點放在CD45+細胞上，獲得了對心臟、疾病早期和晚期以及對照中免疫細胞亞群的更高分辨率的識別。然后在小鼠和人類中使用流式細胞術(shù)、免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)整合，最終得出心力衰竭模型中免疫激活的程度分布。

3.2.4 神經(jīng)系統(tǒng)方面 哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的細胞組成和功能具有很高的異質(zhì)性和復(fù)雜性，了解神經(jīng)系統(tǒng)的機制需要了解神經(jīng)系統(tǒng)中各種細胞類型之間的相互作用。Lake等[30]報道了改進的微流體的單核測序(single-nucleus droplet-based sequencing, snDrop-seq)和單細胞轉(zhuǎn)座體超敏性位點測序(single-cell transposome hypersensitive site sequencing, scTHS-seq)方法，對成人大腦視覺皮層、額葉皮層和小腦的6萬多個單細胞進行檢測，揭示了構(gòu)成細胞類型差異性的調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子，還將疾病相關(guān)的風(fēng)險變異映射到特定的細胞群體中，這為人類大腦中正常和致病的細胞過程提供了見解。Wang等[31]對健康和紅色斑點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)感染的魚的中腦進行了scRNA-seq分析，確定了28個神經(jīng)元細胞和7個非神經(jīng)元細胞類型。高深度的單細胞測序分析還解釋了小膠質(zhì)細胞和腦髓樣細胞的發(fā)育異質(zhì)性[32]。人、小鼠和干細胞的中腦發(fā)育機制也借助于單細胞測序技術(shù)對其進行了更深入的了解[33]。2020年，小鼠腸道神經(jīng)系統(tǒng)的單細胞圖譜被成功繪制出來[34]。在此之前，就有研究者利用單細胞測序技術(shù)確定了結(jié)腸感覺神經(jīng)元存在7個亞型[35]。除此以外，為了促進單細胞的擴展分析，全新的SPLiT-seq測序技術(shù)也被應(yīng)用于小鼠的大腦和脊髓，進一步提供了鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)出生后早期發(fā)育的快照[36]。

3.3 在動物科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

單細胞測序技術(shù)主要應(yīng)用在組織器官發(fā)育、疾病發(fā)生及免疫學(xué)領(lǐng)域，在動物科學(xué)領(lǐng)域目前研究較少，主要集中在動物繁殖、胚胎發(fā)育及肌肉組織方面。FecB基因上的一個錯義突變顯著影響小尾寒羊的產(chǎn)羔率，郭曉飛等[37]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因主要在卵丘顆粒細胞中表達，且突變后其下游SMAD4基因和相關(guān)繁殖激素受體基因(FSHR、LHCGR)的表達量差異顯著；FecB基因突變后，可通過激素受體基因的表達差異來調(diào)控激素信號的接受能力。張恒[38]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序等先進分子技術(shù)，研究確定了豬合子基因組激活發(fā)生在四細胞到八細胞時期；通過與人、小鼠、牛基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行比較，發(fā)現(xiàn)相比于小鼠、豬等大動物的早期胚胎發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能與小型動物存在巨大的差別[38]。

基于單細胞測序技術(shù)，對分別利用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)和體細胞核移植技術(shù)(Somatic cell nuclear transfer, SCNT)得到的兩組豬植入前各時期胚胎的轉(zhuǎn)錄組進行系統(tǒng)分析，在ICSI組相鄰時期間共鑒定得到9931個差異表達的蛋白編碼基因(differentially expressed gene, DEG)；在ICSI組和SCNT組胚胎發(fā)育的各個時期，鑒定出數(shù)量差別很大的可變剪切基因，發(fā)現(xiàn)在各個時期均表達的可變剪切基因主要發(fā)揮如RNA剪切和細胞周期等基礎(chǔ)的功能；在ICSI組和SCNT組相同時期間共鑒定得到6080個DEGs，其中在8細胞期DEGs數(shù)量最多，囊胚期次之，這些DEGs主要在RNA加工運輸、脂質(zhì)代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用[39]。

肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat, IMF)是影響肉品質(zhì)的重要因素之一，由于不能直接從雞的肌肉組織中分離出IMF，傳統(tǒng)測序方法檢測的IMF的基因表達容易受到肌肉細胞的影響，因此，通過scRNA-seq技術(shù)對兩個不同發(fā)育階段的胸肌組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)了11個表達差異顯著的基因，包括7個可作為IMF沉積的重要候選基因，再結(jié)合RNA原位雜交驗證鑒定出了IMF細胞特異性表達基因[40]。

4 總結(jié)與展望

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)實現(xiàn)了對單個細胞的無偏性、高通量以及高分辨率的轉(zhuǎn)錄組分析，為轉(zhuǎn)錄組信息提供了一個相對于傳統(tǒng)的描述大量細胞群的方法外的額外維度，已成為揭示組織組成、轉(zhuǎn)錄動力學(xué)和基因間調(diào)控關(guān)系方面的新一代分析技術(shù)。目前，scRNA-seq大多應(yīng)用于腫瘤、生殖、組織器官、免疫、神經(jīng)發(fā)育等領(lǐng)域，在動物遺傳育種研究領(lǐng)域的報道較少。由于scRNA-seq操作過程相對繁瑣，而且目前的檢測主要集中在mRNA，對于非編碼RNA的檢測還存在一定困難，但隨著各種測序平臺及算法的產(chǎn)生，多領(lǐng)域技術(shù)的進步和融合，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)必將會有新的突破和進一步發(fā)展。