中心切割反相/反相二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙葉潛香類(lèi)糖苷

陳 敏，董惠忠，沈世豪，王天南，汪陽(yáng)忠，吳 達(dá)，劉百戰(zhàn)

(上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，上海 200082)

糖苷是煙草致香中一類(lèi)重要的前體物質(zhì)，是指由單糖或低聚糖的R—OH、R2—NH、RSH和另一分子中的半縮醛羥基等基團(tuán)形成的化合物。煙葉中糖苷類(lèi)成分復(fù)雜，包括潛香糖苷類(lèi)和多酚糖苷類(lèi)[1]。離線分離制備實(shí)驗(yàn)表明，潛香類(lèi)糖苷含量(10-6g/g)遠(yuǎn)低于多酚類(lèi)糖苷(10-2g/g)，多酚類(lèi)糖苷背景干擾大，且二者分離難度大，目前尚無(wú)準(zhǔn)確、快速測(cè)定煙草潛香類(lèi)糖苷的報(bào)道。通過(guò)離線制備色譜研究發(fā)現(xiàn)，煙草潛香類(lèi)糖苷主要包括3-氧代-7,8-二氫-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷和3-羥基-β-二氫-大馬酮-β-D-吡喃葡萄糖苷等，在卷煙燃吸時(shí)裂解成3-氧代-α-紫羅蘭醇和巨豆三烯酮，對(duì)煙草吸味具有較大貢獻(xiàn)[2]。因此，開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確、快速的煙葉潛香類(lèi)糖苷測(cè)定技術(shù)，對(duì)評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)具有重要意義。

目前，用于檢測(cè)煙草中糖苷含量的方法包括氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[3-4]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[5-6]、電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI-MS)[7]、超臨界流體色譜法(SFC)[8]等。王燕等[9]利用熱重、紅外檢測(cè)器的GC-MS/MS聯(lián)用儀對(duì)3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在265 ℃條件下，糖苷可迅速反應(yīng)生成大量巨豆三烯酮。GC-MS/MS法檢測(cè)煙草糖苷的優(yōu)點(diǎn)在于選擇性好、儀器分辨率高、適于分析熱穩(wěn)定的小分子化合物，但缺點(diǎn)是化合物定性困難、無(wú)法同時(shí)準(zhǔn)確區(qū)分煙草中不同糖苷物質(zhì)。李葦葦?shù)萚10]采用反相高效液相色譜-質(zhì)譜法(RPLC-MS/MS)分析煙草提取液中5種糖苷類(lèi)化合物，通過(guò)分析相對(duì)分子質(zhì)量和碎片離子結(jié)構(gòu)，獲得待測(cè)物分子結(jié)構(gòu)，但該方法須反復(fù)制備，前處理繁瑣。LC-MS/MS法檢測(cè)煙草糖苷的優(yōu)點(diǎn)在于效率高、應(yīng)用范圍廣，但缺點(diǎn)是耗時(shí)較長(zhǎng)、前處理較繁冗[11-13]。

二維液相色譜技術(shù)分析復(fù)雜基質(zhì)樣品具有極高的靈敏度和選擇性[14]，現(xiàn)已被廣泛用于檢測(cè)煙氣中煙草特有的亞硝胺(TSNAs)[15-16]、煙葉農(nóng)藥殘留[17]、煙葉香味成分前體物等方面[17-20]。

本研究擬采用二維液相色譜法測(cè)定煙葉潛香類(lèi)糖苷，樣品經(jīng)第一維液相色譜有效分離后，目標(biāo)組分經(jīng)稀釋后中心切割至捕集柱，閥轉(zhuǎn)動(dòng)后目標(biāo)組分洗脫至第二維進(jìn)一步分離分析，最后進(jìn)入三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)分析。由于兩維采用不同的流動(dòng)相和色譜柱，且中心切割能夠有效去除大部分干擾成分，可顯著提高目標(biāo)物靈敏度。將該方法應(yīng)用于不同類(lèi)型、不同產(chǎn)地?zé)熑~樣品中3種糖苷的測(cè)定，并分析糖苷含量與煙葉品質(zhì)的內(nèi)在關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

中心切割二維色譜由Agilent 1290 液相色譜、Agilent 1260四元泵、Agilent 1260單泵和六通閥構(gòu)成：均為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品；電子天平(感量0.000 1 g)：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；SW12H超聲儀：瑞士Sono Swiss公司產(chǎn)品；Milli-Q純水儀：美國(guó)Millpore公司產(chǎn)品。第一維液相色譜柱CAPCELL PAK MGⅢ C18(2.0 mm×50 mm×3 μm)，第二維液相色譜柱Welch Ultimate XB C18(2.1 mm×200 mm×3 μm)，捕集柱(C18柱)Thermo Scientific Acclaim Polar Advantage Ⅱ(4.6 mm×10 mm×5 μm)：均為安譜公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

烤煙煙末(0.42 mm，40目)：上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；乙腈、甲酸、甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；0.22 μm有機(jī)相濾膜：安譜公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1樣品預(yù)處理 稱(chēng)取0.5 g煙末(精確至0.1 mg)于20 mL離心管中，加入10 mL純乙腈，30 ℃超聲萃取20 min，以2 000 r/min離心3 min，取上清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜。

1.3.2色譜條件 中心切割二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)樣量為2 μL，柱溫均為30 ℃。第一維反相液相色譜中，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液；梯度洗脫程序：0～3 min(95%A)，3～20 min(95%～25%A)，20～20.1 min(25%～5%A)，20.1～25 min(5%A)，25～26 min(5%～95%A)，26～50 min(95%A)；流速0.2 mL/min。第二維反相液相色譜中，流動(dòng)相C為0.1%甲酸水溶液，D為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～20 min(95%C)，20～40 min(95%～60%C)，40～40.1 min(60%～5%C)，40.1～45 min(5%C)，45～45.1 min(5%～95%C)，45.1～50 min(95%C)，流速0.4 mL/min。六通閥切割時(shí)間為16～18 min，此時(shí)補(bǔ)液流路為水，流速1 mL/min，其他時(shí)間流速0.1 mL/min。

1.3.3質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描；噴霧電壓(ion-spray voltage)5 500 V；霧化氣Gas1壓強(qiáng)413.7 kPa；輔助霧化氣Gas2壓強(qiáng)344.7 kPa；氣簾氣(curtain gas)壓強(qiáng)137.9 kPa；離子源溫度300 ℃；去簇電壓60 V；檢測(cè)時(shí)間20 ms；糖苷檢測(cè)離子對(duì)列于表1。

表1 糖苷檢測(cè)的離子對(duì)Table 1 Ion pairs of mentioned glycoside detection

2 結(jié)果與討論

2.1 中心切割二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)的建立

本研究建立的中心切割二維液相色譜檢測(cè)裝置示于圖1。第一維色譜系統(tǒng)(1D)利用C18柱對(duì)樣品基質(zhì)分離除雜，將目標(biāo)餾分經(jīng)中心切割至第二維色譜柱內(nèi)收集保留，再利用第二維色譜系統(tǒng)(2D)分離后進(jìn)行定量檢測(cè)。同時(shí)，在分析過(guò)程中通過(guò)六通閥切換，達(dá)到理想的分離純化效果。

圖1 中心切割反相/反相二維液相色譜系統(tǒng)Fig.1 Heart-cutting Rp/Rp two dimensional liquid chromatography system

煙葉糖苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)樣品難以獲得，因此，采用易獲得的蕓香苷標(biāo)樣代替。由于煙葉潛香類(lèi)糖苷與蕓香苷的極性相似，在反相液相色譜上的保留時(shí)間接近[22]。采用蕓香苷標(biāo)樣對(duì)糖苷可能流出的區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記，在此基礎(chǔ)上確定二維切割時(shí)間，將煙葉潛香類(lèi)糖苷轉(zhuǎn)移至第二維反相液相色譜進(jìn)一步分離。蕓香苷的一維液相色譜紫外吸收?qǐng)D示于圖2，保留時(shí)間為17.3 min，推測(cè)煙葉糖苷可能在附近共流出。

以蕓香苷保留時(shí)間為基準(zhǔn)，分別將二維切割時(shí)間設(shè)置為15～16 min、16～17 min、17～18 min、18～19 min。餾分經(jīng)過(guò)補(bǔ)液稀釋后在捕集柱上富集，通過(guò)閥轉(zhuǎn)動(dòng)，被第二維流動(dòng)相分離后進(jìn)入MRM模式。第一維不同切割時(shí)間的糖苷MRM譜圖示于圖3。第一維切割15～16 min、18～19 min餾分中均無(wú)3種糖苷目標(biāo)物；第一維切割16～17、17～18 min餾分中，3種糖苷均有信號(hào)。因此確定第一維餾分切割時(shí)間為16～18 min。

注：a.蕓香苷標(biāo)樣;b.煙葉樣品圖2 一維液相色譜的紫外吸收譜圖Fig.2 UV absorption spectra in the first dimensional chromatography

注：a.15～16 min；b.c.16～17 min；d.e.17～18 min；f.18～19 min圖3 不同切割時(shí)間的第一維餾分經(jīng)第二維分離后進(jìn)入質(zhì)譜的MRM圖Fig.3 MRM diagrams of glycoside mentioned in the first dimensional step during different elution times

2.2 方法重復(fù)性

對(duì)實(shí)際樣品中糖苷A、B和C進(jìn)行日內(nèi)、日間重復(fù)性考察，結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，日內(nèi)重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.0%～3.2%之間，日間重復(fù)性RSD在2.8%～8.4%之間，能夠滿(mǎn)足日常檢測(cè)需求。

2.3 不同類(lèi)型煙葉樣品考察

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同類(lèi)型的煙葉樣品，結(jié)果列于表3?？梢?jiàn)，白肋煙中糖苷含量很低，烤后煙葉和青煙葉中糖苷含量較高，與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致。香料煙、曬紅煙、曬黃煙中糖苷的相對(duì)含量約為烤煙的10%～20%，這可能由于白肋煙、曬煙在晾曬調(diào)制過(guò)程中糖苷發(fā)生了降解。

表2 實(shí)際樣品測(cè)定中方法重復(fù)性考察(n=3)Table 2 Repeatability in real samples (n=3)

烤煙、白肋煙、香料煙、曬煙等不同類(lèi)型煙葉的還原糖含量差異顯著，烤煙還原糖含量顯著高于晾曬煙，葡萄糖含量一般在10%以上。因此，烤煙中類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物3-氧代-α-紫羅蘭醇、3-羥基-β-二氫大馬酮、3-氧代-7,8-二氫-α-紫羅蘭醇在C13-降異戊二烯醇的糖苷含量最高。白肋煙調(diào)制過(guò)程中，煙葉水分和晾房溫濕度適宜，調(diào)制周期長(zhǎng)，煙葉酶活性維持時(shí)間長(zhǎng)，糖分呼吸消耗多，還原糖消耗量大，因此白肋煙中糖和糖苷含量最低，該結(jié)果與文獻(xiàn)[21-22]報(bào)道一致。

表3 不同類(lèi)型煙葉中糖苷的相對(duì)含量(峰面積)Table 3 Relative concent (peak area) of detected glycosides in different tobacco leaves

香料煙、曬煙煙葉中的還原糖含量介于烤煙與白肋煙之間，潛香糖苷含量也介于二者之間。因此，不同類(lèi)型煙葉中還原糖含量越高，則糖苷含量越高。

2.4 不同香型、產(chǎn)地樣品的糖苷含量分析

對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的157個(gè)煙葉樣品進(jìn)行測(cè)定，以中間香型樣品為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化，將清香型、濃香型和中間香型樣品取均值進(jìn)行分析，結(jié)果示于圖4。可以發(fā)現(xiàn)，不同香型的樣品中，清香型樣品的糖苷A含量較高，濃香型樣品的糖苷B和糖苷C含量相對(duì)較高，中間香型煙葉樣品各組分含量處于二者之間。

圖4 不同香型煙葉樣品中糖苷的相對(duì)含量Fig.4 Relative concents of glycosides in different tobacco samples

不同產(chǎn)地烤煙的糖苷相對(duì)含量均值示于圖5。糖苷A，糖苷B和糖苷C含量有明顯差異，總體上糖苷B和糖苷C含量較高，變化規(guī)律相似，糖苷A含量略低。從糖苷總量看，糖苷總量較低的為黑龍江、四川，糖苷總量較高的為河南、山東，糖苷總量中等的為福建、云南、貴州。

注：a.3-氧代-7,8-二氫-α-紫蘭羅醇-β-D-吡喃葡萄糖苷；b.3-氧代-α-紫羅蘭醇-β-D-吡喃葡萄糖苷；c.3-羥基-β-二氫-大馬酮-β-D-吡喃葡萄糖苷；d.糖苷總量圖5 不同產(chǎn)地烤煙糖苷的相對(duì)含量均值Fig.5 Average relative contents of glycosides from different regions

3 結(jié)論

本研究建立了中心切割反相/反相二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定煙葉中潛香類(lèi)糖苷含量，具有樣品前處理簡(jiǎn)單、儀器自動(dòng)運(yùn)行、重復(fù)性好、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，適用于大批量煙葉樣品的日常檢測(cè)。