UPLC-MS法分析紅參中人參皂苷及在2型糖尿病大鼠體內(nèi)代謝研究

王和宇，黃仁嵩，焦傳新，李 慧，焦麗麗，劉淑瑩，吳 巍

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130117)

紅參為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)栽培品的根和根莖經(jīng)蒸制后的干燥炮制品[1]，表面半透明、呈紅棕色，是應(yīng)用最廣泛的一種人參產(chǎn)品，其主要活性成分為人參皂苷[2]。紅參在炮制過(guò)程中常伴隨熱解、水解等反應(yīng)，使化學(xué)成分發(fā)生變化[3]。近年來(lái)，紅參能夠治療、預(yù)防2型糖尿病(T2DM)及并發(fā)癥的作用受到各國(guó)學(xué)者的廣泛關(guān)注[4-5]。研究表明[6-7]，人參皂苷具有治療T2DM的作用，但直接口服不易吸收，生物利用度較低。Zhou等[8]以紅參中人參皂苷作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)其吸收入血后的作用機(jī)制進(jìn)行了研究[8]。目前，腸道菌群對(duì)疾病的影響受到重視[9-10]。康安等[11]指出，藥物分子可與腸道微生物相互作用，產(chǎn)生腸道菌群代謝產(chǎn)物和經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化的中藥活性成分，與腸道菌群存在互動(dòng)調(diào)控，可能是揭示紅參潛在作用機(jī)制的新途徑。因此，有必要鑒定及闡明糞便中存在的人參皂苷。目前，超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS)在分析復(fù)雜的中藥成分及其代謝物研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有力手段[12-14]。

本研究擬利用UPLC-MS技術(shù)定性、定量分析紅參中人參皂苷，對(duì)灌胃給予紅參提取物的2型糖尿病大鼠的糞便、血清進(jìn)行分析測(cè)定，并鑒定代謝產(chǎn)物，希望為進(jìn)一步闡明紅參中人參皂苷的作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、TSQ Endura 三重四極桿質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源ESI、Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))、Thermo Syncronis-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)、ST8R型高速冷凍離心機(jī)：均為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；BT25S型電子天平：德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品；FDU-1100凍干機(jī)、N-1300D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化公司產(chǎn)品；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州智博睿儀器制造有限公司產(chǎn)品；MTN-2800D型氮吹儀：天津Auto-science儀器公司產(chǎn)品；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀：瑞士TECAN公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

五年生人參：2018年購(gòu)于吉林撫松，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王淑敏教授鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey)的干燥根莖；紅參：同批次人參炮制品。以上樣品均儲(chǔ)存于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院分析篩選實(shí)驗(yàn)室。

Noto-R1(80418-24-2)、Rf(52286-58-5)、Rk1(494753-69-4)、Rh1(80952-71-2)、Rg1(22427-39-0)、Rg2(52286-74-5)、Rg3(14197-60-5)、Re(52286-59-6)、Rc(11020-14-0)、Rd(52705-93-8)、Rb1(41753-43-9)、Rb2(11021-13-9)、Rb3(68406-26-8)、Ro(34367-04-9)人參皂苷對(duì)照品：純度>98%，上海寶曼生物科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，美國(guó)Tedia公司產(chǎn)品；甲醇、乙醇：北京化工廠產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 Thermo Syncronis-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～5 min(19%B),5～25 min(19%～28%B),25～70 min(28%～49%B),70～77 min(49%～90%B),77～80 min(90%B),80～83 min(90%～19%B),83～88 min(19%B)；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，噴霧電壓2.5 kV，負(fù)離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100.0～1 500.0，霧化氣溫度300 ℃，離子傳輸管溫度350 ℃，鞘氣壓力6.125 MPa，輔助氣壓力1.75 MPa，Xcalibur分析軟件處理數(shù)據(jù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1對(duì)照品溶液制備 精密稱取1 g人參皂苷Noto-R1、Rf、Rk1、Rh1、Rg1、Rg2、Rg3、Re、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Ro對(duì)照品，加入80%甲醇溶解，分別配制成1 g/L對(duì)照品母液。各取適量的對(duì)照品母液，使用80%甲醇定容至2 mL容量瓶中，制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，冷藏備用。

1.4.2供試品溶液制備 取紅參樣品，粉碎過(guò)篩，精密稱取樣品粉末，置于100 mL球形瓶中，加8倍量蒸餾水，加熱回流提取3次，每次90 min，合并提取液，過(guò)濾，用等體積飽和正丁醇水溶液萃取3次，合并正丁醇層，減壓蒸干，得紅參總皂苷。稱量后加入80%甲醇，于5 mL容量瓶中定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.4.3紅參總皂苷測(cè)定方法 精密吸取30 μL供試品溶液，置于具塞試管中，氮?dú)獯蹈扇軇尤?.2 mL新配制的5%香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，密封、搖勻，60 ℃水浴15 min，流水冷卻2 min，加入5.0 mL冰醋酸，搖勻，放置10 min；取30 μL 80%甲醇同法制備空白對(duì)照，得空白對(duì)照待測(cè)樣品。將所得溶液于550 nm處測(cè)定吸光度。

1.4.4方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察：取適量的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用80%甲醇逐級(jí)稀釋成6個(gè)濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，按1.3節(jié)條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度實(shí)驗(yàn)：取1.4.1節(jié)方法制備的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次 5 μL，計(jì)算各皂苷單體峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，評(píng)價(jià)儀器精密度。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：按1.4.2節(jié)方法制備6份供試品溶液，每份進(jìn)樣量5 μL，計(jì)算各皂苷單體峰面積的RSD值，評(píng)價(jià)方法重復(fù)性。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取1.4.2節(jié)方法制備的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，每次進(jìn)樣 5 μL，計(jì)算各皂苷單體峰面積的RSD值，評(píng)價(jià)供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取1 mg已知含量的紅參粉末6份，分別置于2 mL容量瓶中，精密加入適量的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率和RSD值。

1.5 生物樣品收集與處理

1.5.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 選擇雄性Wistar大鼠，體重(200±20) g，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠置于標(biāo)準(zhǔn)SPF(specific pathogen free) 級(jí)無(wú)特定病原體屏障環(huán)境中，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)一周后，采用高脂飼料喂養(yǎng)8周，隨后禁食12 h，腹腔注射新鮮配制的40 mg/kg鏈脲佐菌素檸檬酸緩沖液建立T2DM大鼠模型，一周后測(cè)定大鼠空腹血糖值(禁食12 h)，血糖值≥7.8 mmol/L為建立成功的T2DM模型。使用紅參總皂苷以100 mg/kg對(duì)10只T2DM大鼠連續(xù)灌胃干預(yù)21天，干預(yù)期間每天收集大鼠新鮮糞便。末次給藥后，大鼠隔夜禁食12 h，麻醉后腹動(dòng)脈采血，血漿于室溫靜置1 h，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將上清液分裝，置于-80 ℃冰箱，保存。

1.5.2糞便樣品 精密稱取5.0 g于30 ℃烘干、研碎的大鼠新鮮糞便，加入8倍量蒸餾水充分浸泡，100 ℃水浴提取3次，每次1 h。合并提取液，以10 000 r/min離心15 min，上清液中加入等體積正丁醇飽和溶液萃取3次，合并正丁醇層，過(guò)濾，減壓蒸干，加入80%甲醇復(fù)溶，于5 mL容量瓶中定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.5.3血清樣品 取出保存于-80 ℃冰箱中的血清樣品，置于4 ℃冰箱中復(fù)融，渦旋1 min，取100 μL血清，加入500 μL甲醇(4 ℃)，渦旋1 min后，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，上清液用氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，于4 ℃以12 000 r/min離心15 min，上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 含量測(cè)定及方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1紅參總皂苷 紅參總皂苷回歸方程為y=0.011x+0.04(R2=0.999 2)；精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.87%，表明儀器精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD為1.42%，表明該方法重復(fù)性良好；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)RSD為1.47%，表明供試品溶液在2.5 h內(nèi)穩(wěn)定；平均加樣回收率為98.16%，RSD為1.82%，表明本方法準(zhǔn)確、可靠。

紅參總皂苷含量測(cè)定：將紅參藥材粉碎，精密稱取5.020 3、5.050 9、5.040 5 g。經(jīng)計(jì)算可知，紅參總皂苷提取率分別為3.24%、3.29%、3.27%。

2.1.2人參皂苷UPLC-MS含量測(cè)定 各人參皂苷的回歸方程測(cè)定結(jié)果列于表1，14種人參皂苷在線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

各人參皂苷的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以及加樣品回收率結(jié)果列于表2。可知，儀器精密度、方法重現(xiàn)性良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，方法準(zhǔn)確、可靠。

表1 人參皂苷線性關(guān)系考察Table 1 Linear relationships of ginsenoside

表2 人參皂苷方法學(xué)考察Table 2 Methodological of ginsenoside

通過(guò)回歸方程計(jì)算紅參中人參皂苷的含量，結(jié)果列于表3。

表3 人參皂苷含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of ginsenoside content

2.2 化學(xué)成分分析

利用UPLC-MS方法結(jié)合MS/MS碎片離子等信息，定性分析14種人參皂苷，示于圖1，人參皂苷MS/MS分析數(shù)據(jù)列于表4。

2.3 人參皂苷大鼠體內(nèi)代謝研究

2.3.1糞便中人參皂苷代謝研究 利用UPLC-MS方法結(jié)合MS/MS信息，分析了灌胃給藥紅參水提物1～20天的大鼠糞便中的代謝產(chǎn)物。負(fù)離子模式下，大鼠糞便樣品處理后鑒定的代謝產(chǎn)物示于圖2。通過(guò)保留時(shí)間及選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)二級(jí)質(zhì)譜信息，檢測(cè)到Noto-R1、Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rh1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rd、Rg3、Rk114種皂苷。通過(guò)分析20天內(nèi)大鼠糞便代謝產(chǎn)物變化趨勢(shì)可知，大鼠經(jīng)灌胃給藥紅參水提物后，人參皂苷Noto-R1、Rg2、Rg1、Rd在20天內(nèi)呈遞減的趨勢(shì)，其中Noto-R1、Rd在第10～20天內(nèi)趨于穩(wěn)定；人參皂苷Re、Rf、Rh1、Rc、Ro、Rb2、Rb3、Rg3在前15天內(nèi)呈遞減趨勢(shì)，在第15～20天呈略微升高趨勢(shì)；人參皂苷Rk1在20天內(nèi)趨勢(shì)未發(fā)生明顯變化。

2.3.2血清中人參皂苷代謝研究 在上述檢測(cè)條件下，對(duì)灌胃紅參水提物后第21天大鼠血清中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在血清中提取到12種人參皂苷，分別為達(dá)瑪烷型原人參二醇型皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3，達(dá)瑪烷型原人參三醇型皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2，齊墩果烷型皂苷Ro及稀有皂苷Rk1，示于圖3。

注：a.混合對(duì)照品；b.紅參水提物圖1 UPLC-MS基峰離子流圖 Fig.1 UPLC-MS base peak chromatograms

表4 UPLC-MS/MS法鑒定紅參提取物Table 4 Identification of red ginseng extract by UPLC-MS/MS

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01圖2 灌胃給藥紅參大鼠糞便中人參皂苷變化趨勢(shì)Fig.2 Trend of ginsenoside in feces of red ginseng administered by intragastric administration

注：a.Rg1、Rf;b.Re、Rd;c.Rb1;d.Ro;e.Rc、Rb2、Rb3;f.Rg2、Rg3;g.Rk1圖3 灌胃紅參水提物21天大鼠血清中各人參皂苷UPLC-MS圖Fig.3 UPLC-MS chromatograms of ginsenoside in rat serum after oral administration of red ginseng water extract for 21 days

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS技術(shù)對(duì)大鼠灌胃人參及炮制品后血漿及糞便中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，通過(guò)分析大鼠糞便中人參皂苷含量的變化，表明人參皂苷在腸道菌群的作用下發(fā)生了代謝、轉(zhuǎn)化、脫糖等變化。三醇型人參皂苷與二醇型人參皂苷的區(qū)別在于三醇型人參皂苷的C-6位連有羥基，而二醇型人參皂苷的C-6位無(wú)羥基取代，二者在腸道中的代謝途徑類似，均是在腸道細(xì)菌的作用下，C-3或C-20位的糖鏈發(fā)生糖苷鍵開(kāi)裂[8]，生成次級(jí)代謝產(chǎn)物。腸道菌群也可使人參皂苷發(fā)生相互轉(zhuǎn)化，如三醇型人參皂苷Re在腸道中可轉(zhuǎn)化為Rg1、Rg2、Rh1、F1、PPT，Rg1可轉(zhuǎn)化為Rh1；二醇型人參皂苷Rb1可轉(zhuǎn)化為Rd、F2、CK、PPD等。原人參二醇型皂苷口服后吸收較差，大部分在腸道中發(fā)生脫糖反應(yīng)，最終產(chǎn)物為人參皂苷Compound K和原人參二醇PPD。人參皂苷Rb1、Rg3、Rb3、Re和Rg1可通過(guò)降低炎癥反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗、降低血糖、降低血脂等途徑改善糖尿病癥狀[15]。本實(shí)驗(yàn)大鼠血清檢測(cè)結(jié)果表明，有少部分人參皂苷以原型成分吸收入血，如二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3，三醇型人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rg2，齊墩果型皂苷Ro和稀有皂苷Rk1等，表明胃腸道并未對(duì)人參皂苷進(jìn)行完全轉(zhuǎn)化，直接吸收入血的成分可發(fā)揮治療T2DM的作用。本研究可為紅參中人參皂苷的檢測(cè)及藥效成分探究提供參考。