城市生活污水中阿片類、苯丙胺類以及苯二氮卓類濫用物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜篩選及確證

原 帥，于治國(guó)，王海峰，向 平，施 妍，楊 歡，劉夢(mèng)曦，駱如欣，沈保華

(1.司法鑒定科學(xué)研究院，上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200063；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092)

濫用物質(zhì)是指連續(xù)使用后產(chǎn)生依賴性，并具有濫用傾向的精神活性物質(zhì)。近些年，除冰毒、海洛因等傳統(tǒng)的濫用物質(zhì)外，不法分子為逃避打擊而對(duì)毒品進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，得到了與毒品相似或更強(qiáng)的新精神活性物質(zhì)(new psychoactive substances, NPS)。根據(jù)最新的《2019年中國(guó)毒品形勢(shì)報(bào)告》，甲基苯丙胺和海洛因仍是我國(guó)濫用人數(shù)最多的毒品[1]。新精神活性物質(zhì)作為第三代毒品迅速擴(kuò)張，我國(guó)于2019年5月1日起將芬太尼類物質(zhì)整類列管?？ㄎ魍愇镔|(zhì)作為苯丙胺類新精神活性物質(zhì)，在許多國(guó)家的毒品市場(chǎng)大量涌現(xiàn)，并導(dǎo)致多人死亡。自2014年起，我國(guó)將甲卡西酮等卡西酮類物質(zhì)劃入第一類管制精神藥品。此外，地西泮等苯二氮卓類藥物屬于第二類管制精神藥品，但作為安眠藥的使用越發(fā)增多[2]。濫用物質(zhì)泛濫將導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因此，急需建立快速、精準(zhǔn)、篩選范圍廣的濫用物質(zhì)監(jiān)測(cè)體系。

濫用物質(zhì)監(jiān)測(cè)最早是通過(guò)結(jié)合犯罪統(tǒng)計(jì)、醫(yī)療記錄、毒品生產(chǎn)和緝獲率等人口調(diào)查中獲得，但是這種方法存在時(shí)間的滯后性以及人口的有限性等缺點(diǎn)[3]，導(dǎo)致低估濫用物質(zhì)使用率等問(wèn)題。2001年，Daughton[4]提出污水分析法，主要通過(guò)對(duì)污水中濫用物質(zhì)及其代謝物濃度的測(cè)定統(tǒng)計(jì)濫用物質(zhì)的使用情況，是一種客觀、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、便捷、有效的監(jiān)測(cè)技術(shù)。目前，包括我國(guó)在內(nèi)的眾多國(guó)家已經(jīng)開展了該項(xiàng)技術(shù)的研究，并開發(fā)了不同的分析方法[5-9]。

生活污水中濫用物質(zhì)含量少、干擾物質(zhì)多，不能直接進(jìn)入儀器進(jìn)行分析，需要經(jīng)過(guò)一系列的前處理過(guò)程以減少干擾性物質(zhì)[10]。固相萃取法是最常見的前處理方法，其操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、重復(fù)性強(qiáng)[10]，可以提高污水中濫用物質(zhì)的提取回收率，有效地分離分析物與干擾組分。提取濃縮后的樣品大多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對(duì)已知目標(biāo)物進(jìn)行分析，而在沒有標(biāo)準(zhǔn)品或者無(wú)法短時(shí)間內(nèi)優(yōu)化方法的情況下很難完成快速檢測(cè)。

高分辨質(zhì)譜(HRMS)已廣泛應(yīng)用于新型涉毒藥物案(事)件的鑒定及科學(xué)研究，并逐漸應(yīng)用于污水中濫用物質(zhì)的分析，特別是NPS分析[11-14]。與低分辨質(zhì)譜相比，HRMS具有高通量、高分辨、高特異性、精確分子質(zhì)量、多種掃描和碎裂組合等特點(diǎn)，此外，還可以在沒有參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下同時(shí)測(cè)定大量化合物[15]。因此，HRMS是監(jiān)測(cè)污水中濫用物質(zhì)的一種有效工具。

本研究擬建立超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法快速篩選及確證城市生活污水中阿片類、苯丙胺類以及苯二氮卓類濫用物質(zhì)，并將其應(yīng)用于實(shí)際的城市生活污水樣品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Vanquish Flex UPLC超高效液相色譜儀、ScientificTMOrbitrapTMID-X高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；GX-274自動(dòng)固相萃取儀：法國(guó)Gilson公司產(chǎn)品；MD200-2氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

嗎啡、單乙酰嗎啡、可待因、羥考酮、哌替啶、曲馬多、丁丙諾啡、美沙芬、芬太尼、阿芬太尼、瑞芬太尼、乙酰芬太尼、舒芬太尼、丙烯酰芬太尼、2-氟芬太尼、奧芬太尼、卡芬太尼、甲基苯丙胺、苯丙胺、3,4-亞甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亞甲基二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亞甲基二氧基-N-乙基-苯丙胺(MDEA)、氟苯丙胺、甲卡西酮、卡西酮、1-苯基-2-甲氧基-1-戊酮、4-甲氧基甲卡西酮、3,4-亞甲二氧基甲卡西酮、3,4-亞甲二氧基乙卡西酮、阿普唑侖、溴西泮、地西泮、艾司唑侖、氟西泮、硝西泮、去甲西泮：均購(gòu)自美國(guó) Cerilliant公司。

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；98%甲酸、甲酸銨、氨水(25%)：瑞士Fluka公司產(chǎn)品；鹽酸：中國(guó)永華化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 溶液配制

將上述36種對(duì)照品用甲醇配制成10 mg/L的混合溶液，置于-20 ℃冰箱中保存。使用前取適量的對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至所需濃度，制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品采集

從某地區(qū)不同區(qū)域的污水處理廠采集12個(gè)24 h復(fù)合污水樣品，將所有樣品存儲(chǔ)在600 mL聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)容器內(nèi)，并用鹽酸調(diào)至pH 2左右，然后送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。將樣品保存在-20 ℃冰箱中，分析前取出，解凍至室溫，避免多次凍融。

1.5 樣品前處理

采用固相萃取法對(duì)污水樣品進(jìn)行濃縮、凈化，具體操作如下：1) 將50 mL污水樣品經(jīng)玻璃微纖維濾紙過(guò)濾；2) 依次用4 mL甲醇、4 mL酸化水(pH 2，鹽酸酸化)活化Oasis MCX固相萃取小柱，流速4 mL/min；3) 以2 mL/min的流速加載污水樣品；4) 依次用4 mL純化水、4 mL甲醇淋洗Oasis MCX固相萃取小柱，流速2 mL/min；5) 持續(xù)干燥直至固相萃取小柱干燥；6) 用4 mL 5%氨-甲醇溶液洗脫固相萃取小柱，流速1 mL/min；7) 在50 ℃下，用緩和的氮?dú)饬鲗⑾疵撘簼饪s至200 μL；8) 用0.22 μm聚四氟乙烯過(guò)濾器過(guò)濾濃縮后的洗脫液；9) 將濾液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶，直接進(jìn)樣。

1.6 實(shí)驗(yàn)條件

1.6.1色譜條件 Accucore Hypersil Gold column色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm)，柱溫為室溫；流動(dòng)相：A為2 mmol/L甲酸銨緩沖溶液(含0.1%甲酸)，B為乙腈-甲醇溶液(1∶1，V∶V，含0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸銨)；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫：0～6 min(95%～80%A)，6～14 min(80%～0%A)，14～16.5 min(0%A)，16.5～16.6 min(0%～95%A)，16.6～20 min(95%A)。

1.6.2質(zhì)譜條件 加熱電噴霧電離源(HESI)，正離子掃描模式；噴霧電壓3 500 V；鞘氣流速5 mL/min；輔助氣流速10 L/min；毛細(xì)管溫度325 ℃；噴霧溫度350 ℃；數(shù)據(jù)采集模式為一級(jí)全掃描以及自動(dòng)觸發(fā)的二級(jí)質(zhì)譜掃描(Full MS/dd MS2)；一級(jí)掃描分辨率設(shè)為60 000，質(zhì)量掃描范圍m/z80～1 200，最大注入時(shí)間50 ms；二級(jí)掃描分辨率設(shè)為15 000，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，最大注入時(shí)間22 ms，分離窗口為m/z1.6；碰撞能量設(shè)為20、40、60。

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

本實(shí)驗(yàn)采用TraceFinder軟件進(jìn)行快速篩選。首先建立了生活污水中阿片類、苯丙胺類以及苯二氮卓類共36種濫用物質(zhì)的篩選數(shù)據(jù)庫(kù)，利用其對(duì)照品溶液獲得準(zhǔn)確的保留時(shí)間以及相應(yīng)的質(zhì)譜信息等，列于表1。然后建立篩選方法，以保留時(shí)間、分子質(zhì)量、碎片離子以及同位素分布為篩選依據(jù)，當(dāng)樣品中的某物質(zhì)全部符合這4個(gè)條件時(shí)，才能判定為陽(yáng)性。因此，使用該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行濫用物質(zhì)的篩選與確證時(shí)，其定性能力更強(qiáng)，得到的結(jié)果更加真實(shí)可靠，很大程度上降低了假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的可能性。該分析方法的篩選參數(shù)如下：峰面積閾值5 000 000，保留時(shí)間窗口閾值20 s，最小碎片離子數(shù)為2，同位素相似度的閾值90%，同位素離子的允許強(qiáng)度偏差為10%，分子離子、碎片離子以及同位素的質(zhì)量偏差均小于5×10-6。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

分別取不同來(lái)源的空白生活污水樣品，按1.5節(jié)方法處理后進(jìn)樣分析；另取空白污水樣品，添加適量的待測(cè)物對(duì)照品溶液，按1.5節(jié)方法處理后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，各待測(cè)物分離良好，且在保留時(shí)間處均未出現(xiàn)干擾峰，說(shuō)明該方法的專屬性強(qiáng)。此外，取若干份50 mL空白污水，添加適量的待測(cè)物對(duì)照品溶液，制得不同濃度的污水樣品，按1.5節(jié)方法處理后進(jìn)樣分析，以信噪比為3時(shí)的濃度為檢出限(LOD)。結(jié)果顯示，36種濫用物質(zhì)的LODs范圍為5～20 ng/L。

選取50 ng/L污水樣品，按1.5節(jié)方法處理后進(jìn)樣的峰面積為A，空白樣品按1.5節(jié)方法處理后，加入相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣后的峰面積為B，對(duì)照品溶液進(jìn)樣后的峰面積為C，提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=(B/C-1)×100%，其結(jié)果列于表2。結(jié)果表明，36種濫用物質(zhì)經(jīng)提取后，提取回收率為74.5%～104.1%，基質(zhì)效應(yīng)為-24.4%～21.2%，可以滿足污水中36種濫用物質(zhì)的日常監(jiān)測(cè)。

2.2 實(shí)際樣品檢測(cè)

運(yùn)用本方法分析12個(gè)實(shí)際生活污水樣品，利用TraceFinder軟件中已建立的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)以及篩選方法進(jìn)行快速篩選與確認(rèn)。結(jié)果表明，12個(gè)污水樣品中均檢出濫用物質(zhì)，且所有濫用物質(zhì)的質(zhì)量精度均小于5×10-6，列于表3。

上述樣品中共檢出4種苯二氮卓類物質(zhì)，分別為地西泮、去甲西泮、艾司唑侖、阿普唑侖，其MS2譜圖示于圖1。地西泮是臨床上用于鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)定抗焦慮的藥物，在上述12個(gè)污水樣品中均有檢出，去甲西泮為地西泮的主要代謝產(chǎn)物，在樣品4、5、6、7、8、10中有檢出。有文獻(xiàn)報(bào)道，在中國(guó)多個(gè)城市的污水中均有檢出地西泮及其代謝物，如王聰聰?shù)萚16]在北京多個(gè)污水采樣點(diǎn)均檢測(cè)到地西泮及其代謝物；孫倩等[17]在廈門污水處理廠檢測(cè)到地西泮的存在，但對(duì)污水中除地西泮以外的其他苯二氮卓類藥物的研究較少。樣品7和10中檢出阿普唑侖，樣品5、7、10、11、12中檢出艾司唑侖，說(shuō)明本方法可篩選發(fā)現(xiàn)更多的濫用物質(zhì)。此外，在樣品7和10中同時(shí)檢出了阿普唑侖與艾司唑侖，表明在這2個(gè)樣品的覆蓋人群中使用苯二氮卓類藥物的可能較多。部分歐美國(guó)家的污水樣品中同時(shí)檢出了地西泮及其他苯二氮卓類藥物[18-19]。

在上述污水樣品中共發(fā)現(xiàn)了嗎啡、可待因、哌替啶、曲馬多等4種阿片類物質(zhì)，其MS2譜圖示于圖2。在阿片類濫用物質(zhì)中，海洛因消費(fèi)量最大，是我國(guó)監(jiān)控、查禁的主要毒品之一。在污水分析中常采用嗎啡來(lái)估算海洛因的使用量。而污水中嗎啡的主要來(lái)源有：?jiǎn)岱缺旧碜鳛槁樽硇枣?zhèn)痛藥使用、海洛因代謝、可待因代謝。在樣品2、3、5、7、8、9、10中檢出嗎啡，樣品2、3、4、5、7、9、10中檢出可待因。根據(jù)文獻(xiàn)[20]報(bào)道，在北京、哈爾濱、西安、蘭州、銀川、太原、石家莊、武漢、濟(jì)南、南京、杭州、南寧、廣州、成都、昆明、貴陽(yáng)、大連、洛陽(yáng)、青島、蘇州、廈門、深圳等城市的生活污水中均檢出嗎啡與可待因。嗎啡、可待因在國(guó)外的應(yīng)用也較為廣泛，如在馬來(lái)西亞[21]、西班牙[22]、美國(guó)、法國(guó)、德國(guó)[7,23-24]等國(guó)家的污水中均有檢出。曲馬多和哌替啶這兩種藥品為我國(guó)生產(chǎn)及使用的鎮(zhèn)痛麻醉藥品，以往未在生活污水中進(jìn)行篩查。本研究在樣品3中檢出了曲馬多，樣品4和10中檢出了哌替啶。近年來(lái)，這兩種藥物濫用較為廣泛，除臨床使用外，某些海洛因依賴者在無(wú)法獲得海洛因的情況下，會(huì)以這兩種藥物作為替代品使用。

表1 污水中36種阿片類、苯丙胺類以及苯二氮卓類濫用物質(zhì)的HRMS數(shù)據(jù)庫(kù)Table 1 HRMS database of 36 opioids, amphetamines and benzodiazepines in wastewater

表2 污水中36種濫用物質(zhì)的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)(n=6)Table 2 Extraction recovery and matrix effect of 36 abused substances in wastewater (n=6)

表3 污水樣品的篩選結(jié)果Table 3 Screening results of wastewater samples

續(xù)表3

在樣品2、4、8中檢出甲基苯丙胺，其MS2譜圖示于圖3。此外，北京、南京、西安、大連等城市的污水樣品中也均有檢出[25]。甲基苯丙胺在其他國(guó)家的濫用也非常普遍[26-27]，因此需要進(jìn)一步加強(qiáng)管控與治理。

注：a.地西泮；b.去甲西泮；c.阿普唑侖；d.艾司唑侖圖1 4種苯二氮卓類物質(zhì)的MS2譜圖Fig.1 MS2 spectra of four benzodiazepines

注：a.可待因；b.嗎啡；c.哌替啶；d.曲馬多圖2 4種阿片類物質(zhì)的MS2譜圖Fig.2 MS2 spectra of four opioids

圖3 甲基苯丙胺的MS2譜圖Fig.3 MS2 spectrum of methamphetamine

12個(gè)污水樣品中未發(fā)現(xiàn)芬太尼及卡西酮等NPS。不同國(guó)家和地區(qū)，NPS在污水中表現(xiàn)出不同的流行特征。如Iria等[12]利用HRMS篩選意大利4個(gè)城市中的NPS，發(fā)現(xiàn)了卡西酮類的NPS[12]；Richard等[14]利用HRMS監(jiān)測(cè)澳大利亞NPS的使用情況，在所有區(qū)域和大都市污水處理廠中共發(fā)現(xiàn)22種不同的NPS，其中包括多種卡西酮類NPS。

上述12個(gè)污水樣品取自某地區(qū)不同區(qū)域，篩選結(jié)果也不相同。其中，樣品1中僅檢出地西泮，而樣品10中檢出的濫用物質(zhì)最多，分別為地西泮、去甲西泮、艾司唑侖、阿普唑侖等4種苯二氮卓類物質(zhì)以及嗎啡、可待因、哌替啶等3種阿片類物質(zhì)，其全掃描總離子流圖示于圖4。表明在不同區(qū)域，阿片類、苯丙胺類以及苯二氮卓類濫用物質(zhì)的流行性不同。

2.3 結(jié)果的影響因素

城市生活污水中目標(biāo)化合物的出現(xiàn)與濃度可能受多種因素的影響，如采樣過(guò)程、下水道環(huán)境、目標(biāo)化合物的擴(kuò)散和分散效應(yīng)等。其中，采樣是污水分析的關(guān)鍵步驟，科學(xué)的采樣是獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的前提。污水的采樣方法包括連續(xù)取樣、流量比例連續(xù)取樣、隨機(jī)單次取樣等。本實(shí)驗(yàn)每2 h采集500 mL污水樣品，然后將同一天收集的12個(gè)污水樣品混合，最后將得到的24 h復(fù)合樣品裝入600 mL PET瓶中。與其他方法相比，該采樣方法可以有效減少采樣誤差，獲得準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。

此外，由于污水中某些化合物的擴(kuò)散和分散效應(yīng)，不同的采樣高度也可能影響監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)使用自動(dòng)采樣器從水下50 cm采集污水樣品，比較不同污水處理廠中目標(biāo)化合物的出現(xiàn)情況，可以消除分析物的擴(kuò)散和分散效應(yīng)。下水道系統(tǒng)中目標(biāo)化合物的轉(zhuǎn)化、降解、穩(wěn)定性和掩蔽效應(yīng)也是需要考慮的重要方面，然而，目前還未見該方面的研究報(bào)道。因此，我們下一步將對(duì)此進(jìn)行探究。

注：?jiǎn)岱?.18 min；可待因3.74 min；哌替啶8.89 min；艾司唑侖10.89 min；阿普唑侖11.23 min；去甲西泮11.59 min；地西泮11.94 min 圖4 樣品10的TIC圖Fig.4 Total current chromatogram of sample 10

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定城市生活污水中阿片類、苯丙胺類以及苯二氮卓類濫用物質(zhì)，構(gòu)建了36種濫用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)及篩選方法，并將其應(yīng)用到12個(gè)取自不同區(qū)域的污水樣品中，篩選并確認(rèn)了嗎啡、可待因、哌替啶、曲馬多4種阿片類物質(zhì)，甲基苯丙胺1種苯丙胺類物質(zhì)，以及地西泮、去甲西泮、艾司唑侖、阿普唑侖4種苯二氮卓類物質(zhì)。