超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉和雞蛋中25種獸藥殘留

陳興連，李 倩，王志飛，方海仙，李彥剛，李茂宣，邵金良

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(昆明)，云南 昆明 650205；2.云南省漁業(yè)科學院，云南 昆明 650051)

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)呈集約化、規(guī)模化、商業(yè)化、高密度發(fā)展，畜禽病害呈現(xiàn)高頻化、復雜化趨勢，為降低發(fā)病與死亡帶來的經(jīng)濟損失，獸藥被廣泛用于預(yù)防和治療畜禽疾病，或以亞治療劑量添加于飼料中以促進動物生長、改善動物產(chǎn)品品質(zhì)和提高飼料利用率[1]。但部分畜禽養(yǎng)殖場人員缺乏對藥物危害的認知及科學用藥的指導，或受經(jīng)濟利益驅(qū)使，不合理用藥，甚至非法濫用各類獸藥，且不嚴格遵守休藥期[2-5]，導致畜禽產(chǎn)品中獸藥殘留超標現(xiàn)象時有發(fā)生。無論獸藥殘留水平高低，通過長期的食物鏈蓄集到一定量后會對人體產(chǎn)生毒副作用，如過敏反應(yīng)，泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心肌損害等，某些藥物還具有潛在的致畸性、致癌性，或致休克甚至死亡[6-8]。此外，病原菌在長期接觸這些低濃度藥物后，容易增加病毒的耐藥性及變異的可能性，從而減弱人類疾病的治療效果，使公共衛(wèi)生面臨嚴峻的挑戰(zhàn)和威脅[9-12]。獸藥殘留還會使畜禽產(chǎn)品出口受阻，影響畜禽業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展和國家的經(jīng)濟發(fā)展。因此，開展獸藥殘留的檢測研究，規(guī)范用藥，以指導生產(chǎn)，保障食品安全，提高人民健康水平，增強畜禽產(chǎn)品的市場競爭力。

目前，獸藥殘留的檢測方法有酶聯(lián)免疫法[13]、生物法[14]、電化學法[15]、氣相色譜法[16]、高效液相色譜法[17]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[4-8]等。其中，生物法和酶聯(lián)免疫法的檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性；高效液相色譜法和氣相色譜法的靈敏度低、選擇性差，且多集中于單一種類獸藥的分析，完成一個樣品中多類藥物測定需采用不同的方法，前處理過程耗時、繁瑣，檢測低效高價；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高通量、高選擇性、高分離度、高靈敏度、高檢測效率等優(yōu)勢，是獸藥多殘留檢測的首選方法[18]。雞蛋、雞肉樣品基質(zhì)復雜且獸藥大多為微量甚至痕量殘留，而國家要求的殘留限量較低，給檢測工作帶來巨大挑戰(zhàn)。雖然獸藥多殘留檢測已有較多文獻報道[19-22]，但未見同時測定雞蛋和雞肉中磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、金剛烷胺類獸藥殘留的報道。

本研究擬建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞蛋和雞肉中磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類和金剛烷胺類獸藥殘留，希望為禽類產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測提供有效手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

1290超高效液相色譜儀、ZORBAX C18色譜柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)：美國Agilent公司產(chǎn)品；QTRAP 5500三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；JD200-2電子天平：沈陽龍騰電子有限公司產(chǎn)品；TGL-15 B型高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國海道爾夫公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

磺胺二甲異噁唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁林、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噻二唑、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、氟羅沙星、培氟沙星、洛美沙星、氧氟沙星、金剛烷胺、金剛乙胺、金剛烷胺-D15(10 mg/L)，恩諾沙星-D5、諾氟沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3、磺胺間二甲氧嘧啶-D6、氯霉素-D5溶液標準物質(zhì)(5 mg/L)，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素溶液標準物質(zhì)(100 mg/L)：均購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究中心；甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，美國Sigma公司產(chǎn)品；無水硫酸鈉、乙酸銨、氯化鈉、正己烷、環(huán)己烷、鹽酸(優(yōu)級純)、氨水(分析純，含量25%～28%)、磷酸氫二鉀(分析純)：上海國藥集團產(chǎn)品；PSA、C18填料(50 μm)：中國迪馬科技公司產(chǎn)品；二甲亞砜：分析純，天津風船化學試劑科技有限公司產(chǎn)品；實驗用水：自制超純水。

1.3 溶液配制

用甲醇稀釋各獸藥溶液標準物質(zhì)：金剛烷胺、金剛乙胺、氯霉素配制成0.1 mg/L，喹諾酮類、磺胺類、甲砜霉素、氟甲砜霉素配制成1.0 mg/L，7種內(nèi)標均配制為0.5 mg/L貯備液，于4 ℃下避光保存。系列標準溶液用甲醇配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

0.2 mol/L鹽酸溶液的配制：取1.5 mL鹽酸(36%～38%)，用超純水定容至100 mL。

1.4 樣品前處理

1.4.1樣品提取 稱取5.00 g(精確至0.01 g)均質(zhì)試樣于50 mL塑料離心管中，加入30 μL 0.5 mg/L 內(nèi)標溶液、5.0 mL鹽酸溶液，渦旋至樣品分散后，加15.0 mL乙腈和7～9 g氯化鈉至溶液呈過飽和狀態(tài)，渦旋提取5～7 min，以5 000 r/min離心5 min，取出乙腈層至50 mL離心管中，向殘渣中加15.0 mL乙腈重復提取1次，合并2次提取液，待凈化。

1.4.2樣品凈化 向上述待凈化提取液中加入8～10 mL正己烷-環(huán)己烷混合溶液(1∶1，V/V)，渦旋1 min，以5 000 r/min離心5 min，取乙腈層濃縮至干，加入2.0 mL 0.2%甲酸-乙酸乙酯溶液溶解殘留物，過0.22 μm濾膜后再將濾液蒸干，加入1.0 mL 0.2%甲酸-甲醇溶液復溶，待凈化。

將30 mg C18和60 mg PSA吸附材料混勻，加入下端墊有濾紙的2.0 mL塑料醫(yī)用注射器中，再加入2.0 mL 0.2%甲酸-甲醇溶液淋洗，除去淋洗液，將上述1.0 mL待凈化溶液轉(zhuǎn)移至凈化柱，使其在重力作用下流出，接收凈化液，過0.22 μm濾膜，待UHPLC-MS/MS測定。

1.5 實驗條件

1.5.1色譜條件 流動相：A為0.1%甲酸-水溶液(含0.1 mmol/L乙酸銨)，B為0.2%甲酸-甲醇溶液；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2.0 μL；梯度洗脫程序：0.00～3.00 min(10%～40%B)，3.00～6.00 min(40%～95%B)，6.00～8.00 min(95%B)，8.00～8.20 min(95%～10%B)，8.20～10.00 min(10%B)。

1.5.2質(zhì)譜條件 ESI離子源；離子源溫度550 ℃；噴霧氣(GS1)壓力0.379 MPa；輔助加熱氣(GS2)壓力0.379 MPa；氣簾氣壓力0.241 MPa；正、負離子模式同時掃描，其中氯霉素類藥物為負離子模式掃描，噴霧電壓-4 500 V，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；磺胺類、喹諾酮類、金剛烷胺類為正離子模式掃描，噴霧電壓5 500 V，多反應(yīng)監(jiān)測模式，其他質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 25種獸藥及7種內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of 25 veterinary drugs and 7 isotope internal standards

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取試劑的優(yōu)化 本實驗考察了4類獸藥在乙腈和甲醇中的提取效果。結(jié)果表明，甲醇提取的樣品中蛋白質(zhì)、脂肪等雜質(zhì)較多，后續(xù)凈化難度增加且對目標物有較大干擾，大多數(shù)藥物的回收率較差；而乙腈滲透性強，對多數(shù)目標化合物有較高的提取率，且沉淀蛋白質(zhì)效果較好，可以減少強極性雜質(zhì)和弱極性雜質(zhì)的提取[23]，因此選擇乙腈為提取試劑。

2.1.2樣品水解液的優(yōu)化 磺胺類、喹諾酮類藥物在生物體內(nèi)易與蛋白結(jié)合產(chǎn)生較強的結(jié)合力，影響藥物的提取效率。若將乙腈直接加入高蛋白樣品中會導致蛋白質(zhì)急劇變性凝聚，使提取液不能充分接觸藥物，提取效率偏低。但在加入乙腈前先加入一定體積和濃度的酸或堿溶液，可破壞這一結(jié)合力和細胞結(jié)構(gòu)，促使結(jié)合態(tài)藥物解離為游離態(tài)，充分釋放到提取液中，且水解后樣品含水量增加還可減緩蛋白質(zhì)的變性速度，增大提取試劑與藥物的接觸面積，提高藥物的提取效率；另外，酸、堿還可抑制化合物酸、堿基團的解離，提高其轉(zhuǎn)移到乙腈層中的效率。實驗考察了向樣品中加入相同濃度稀鹽酸、氨水、甲酸、磷酸氫二鉀溶液水解后藥物的提取效果。結(jié)果表明，堿溶液水解的雞蛋樣品乳化現(xiàn)象較嚴重，乙腈與基質(zhì)及水相難以分離；而酸水解的分層較好，其中加鹽酸的樣品中大多數(shù)藥物的回收率更高，對鹽酸濃度和體積優(yōu)化后，確定以5 mL 2 mol/L鹽酸水解樣品。

2.1.3鹽析試劑的優(yōu)化 由于水解樣品時帶入大量水而影響提取試劑的濃縮效率。本實驗考察了向提取液中加入過量的無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、碳酸鈉、碳酸氫鈉及氯化鈉以除去水。結(jié)果表明，除氯化鈉外，其余4種均不能使乙腈和水分層，無水硫酸鈉及無水硫酸鎂在本實驗中的使用量不僅不能將水全部去除，還使部分獸藥被吸附而降低回收率。而氯化鈉的鹽析作用可促使水相中的藥物大量轉(zhuǎn)移到乙腈層中，同時提取液中大量蛋白質(zhì)沉淀于水相，避免了提取液濃縮時產(chǎn)生泡沫而溢出的損失。因此，向提取液中加入過量氯化鈉至飽和(約7～9 g)，待乙腈和水分層后取出乙腈層再進行后續(xù)實驗。

2.1.4提取次數(shù)的優(yōu)化 本實驗考察了雞蛋、雞肉樣品水解后，每次加入15 mL乙腈分別提取1、2、3次后各藥物的回收率，結(jié)果列于表2?？梢姡崛?次部分藥物及相應(yīng)內(nèi)標物的提取效率有較大差異，部分藥物超出獸藥殘留對回收率(70%～120%)的要求；提取2次的回收率最好；提取3次的干擾峰增多。因此，選擇每次加入15 mL乙腈重復提取2次。

表2 樣品提取1、2、3次后獸藥的回收率Table 2 Recoveries of veterinary drugs after extracted of 1, 2, 3 times

2.1.5凈化試劑的優(yōu)化 提取液濃縮至干后，殘留物中有大量油狀物，因此先于提取液中加入8～10 mL正己烷除脂后測定。結(jié)果表明，大多數(shù)藥物的回收率高于除脂前，且靈敏度增強，但磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、洛美沙星和培氟沙星的回收率較差。若使用8～10 mL環(huán)己烷-正己烷溶液，則磺胺間甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉的回收率在70%～120%之內(nèi)，其余藥物的回收率也很好。因此，選擇8～10 mL環(huán)己烷-正己烷溶液去除提取液中的脂肪。

此外，部分氯化鈉溶于乙腈中，易對儀器造成污染。由于氯化鈉在乙酸乙酯中的溶解度較小，因此，將樣品提取液濃縮至干后，加入2 mL含不同濃度甲酸的乙酸乙酯溶解、過濾，考察對氯化鈉去除效果及藥物回收率的影響。結(jié)果表明，乙酸乙酯溶解后均有大量氯化鈉析出，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，去除氯化鈉后大多數(shù)藥物的回收率高于去除前，尤其是洛美沙星和培氟沙星，其中以0.2%甲酸-乙酸乙酯溶解的樣品最好。通過計算樣品提取液去除氯化鈉前、后的藥物基質(zhì)效應(yīng)(ME)(ME=空白基質(zhì)標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)×100%)發(fā)現(xiàn)，去除氯化鈉后部分藥物基質(zhì)效應(yīng)大大減弱，示于圖1。由此推測，氯化鈉對藥物回收率有較大影響，選擇0.2%甲酸-乙酸乙酯溶液溶解殘留物去除氯化鈉。

圖1 除去氯化鈉前(a)、后(b)，樣品提取液中4類獸藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig.1 Matrix effect of 4 kinds of veterinary drugs in samples before (a) and after (b) removing sodium chloride

2.1.6凈化方式的優(yōu)化 樣品中含有色素、糖、有機酸、礦物質(zhì)等多種雜質(zhì)，會減弱色譜柱的性能，影響儀器使用壽命。PSA可有效吸附糖類、色素、有機酸，C18可吸附脂肪和一些礦物質(zhì)等，因此，實驗將C18與PSA混合作為吸附劑，分別采用分散固相萃取法和改良分散固相萃取法(按1.4.2節(jié)操作)對經(jīng)前兩步凈化后的提取液再凈化。結(jié)果表明，由于改良分散固相萃取法中待凈化液與填料接觸更加充分，去除雜質(zhì)效果更好，回收率較高，大多集中在80%～110%范圍內(nèi)。最終選擇C18為30 mg，PSA為60 mg為吸附劑的改良分散固相萃取法對樣品進行凈化。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化 多種獸藥殘留檢測的流動相一般采用甲醇或乙腈為有機相，實驗按1.5.1節(jié)洗脫程序?qū)?5種藥物和7種內(nèi)標物進行測定。結(jié)果表明，以乙腈為有機相時，部分藥物或內(nèi)標物響應(yīng)比甲醇低，回收率也比甲醇差，所以選擇甲醇為流動相的有機相。

H+能促進Q1四極桿內(nèi)[M+H]+峰的形成，增加化合物在正離子模式下的離子化效率、分離度和響應(yīng)強度；乙酸銨能提高化合物響應(yīng)，改善部分藥物的峰形。本實驗在文獻[24-28]的基礎(chǔ)上，考察了含不同濃度甲酸、乙酸銨的水-甲醇溶液作為流動相的分離效果。結(jié)果表明，當使用0.1%甲酸水(含0.1 mmol/L乙酸銨)-甲醇溶液時，大多數(shù)藥物的峰形、分離度和峰響應(yīng)強度均最佳，但諾氟沙星的回收率大于120%，磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的回收率小于70%。經(jīng)與藥物標準品峰對比發(fā)現(xiàn)，樣品中諾氟沙星-D5、磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的峰面積遠遠低于標準品。向甲醇中加入甲酸，隨著甲酸濃度的增加，上述3種藥物的峰面積逐漸增大，磺胺噻唑和磺胺甲噻二唑的回收率逐漸升高，諾氟沙星回收率降低。但由于正、負離子模式電離原理的區(qū)別，甲酸的加入會抑制負離子模式下化合物電離，導致峰響應(yīng)值降低。為兼顧正、負離子模式同時測定時各藥物的回收率與靈敏度，確定當流動相為0.1%甲酸水(含0.1 mmol/L乙酸銨)-0.2%甲酸甲醇時，25種藥物回收率均達到最佳，批內(nèi)、批間樣品中各藥物重復性最優(yōu)，且氯霉素類檢出限均低于GB/T 20756—2006要求。優(yōu)化后的實驗條件測定獸藥混合溶液MRM色譜圖示于圖2。雖然大多數(shù)獸藥峰重疊，但分別提取離子對后各物質(zhì)峰形良好。

2.2.2質(zhì)譜條件的選擇 通過針泵以流動注射的方式對1.3節(jié)配制的標準溶液進行分析，為每個待測藥物選取響應(yīng)較高的2對離子對，為內(nèi)標物選取響應(yīng)最高的1對離子對，并優(yōu)化相應(yīng)的去簇電壓和碰撞能作為最初的質(zhì)譜參數(shù)。但在實際樣品測試中，環(huán)丙沙星-D8響應(yīng)最高的離子對峰受雜質(zhì)峰的干擾嚴重，無法準確積分。以雞蛋為例，其質(zhì)譜圖示于圖3a，部分樣品中雜質(zhì)峰與恩諾沙星響應(yīng)最高的離子對峰完全重疊，造成離子比率遠遠超出允許偏離范圍，二者對定性和定量結(jié)果均有極大影響，通過調(diào)整流動相難以將雜質(zhì)與目標物分離。因此，在滿足靈敏度需求的前提下，對恩諾沙星優(yōu)化出第三高響應(yīng)離子對，環(huán)丙沙星-D8優(yōu)化出次高響應(yīng)離子對，示于圖3b，相關(guān)參數(shù)列于表1。

注：a.磺胺類、喹諾酮類、金剛烷胺類；b.氯霉素類圖2 4類標準品的多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of 4 kinds of standard solutions

2.3 方法學評價

2.3.1線性范圍和檢出限 根據(jù)每種藥物在儀器上的靈敏度，以空白樣品提取液作為溶劑，將4類藥物配制成一系列質(zhì)量濃度混合標準工作溶液，在優(yōu)化的實驗條件下測定，以藥物峰面積與內(nèi)標物峰面積比值(y)對被測組分的質(zhì)量濃度(x)作圖，確定25種藥物的線性方程。在空白樣品中加入系列低濃度25種獸藥標準液，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限和定量限，列于表3。25種獸藥在0.2～250 μg/L濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r>0.99)，檢出限和定量限分別為0.1～0.9 μg/kg和0.3～3.0 μg/kg。

2.3.2回收率和精密度 根據(jù)混合標準溶液的濃度，分別添加約1倍(低)、5倍(中)、20倍(高)定量限濃度的25種標準溶液于雞蛋和雞肉陰性樣品中，每個樣品基質(zhì)做6次平行實驗，計算平均回收率及相對標準偏差，結(jié)果列于表4。4類獸藥的平均回收率為79.5%～119%，相對標準偏差為0.9%～9.2%。

圖3 樣品中環(huán)丙沙星-D8響應(yīng)最高離子對(a)及次高響應(yīng)離子對(b)的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectra of the highest (a) and highter (b) response ion pair of ciprofloxacin-D8 in eggs

表3 25種獸藥的線性范圍、線性方程、檢出限、定量限、相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges, linear equations, limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and correlation coefficients of 25 veterinary drugs

續(xù)表3

表4 3個添加水平下，25種獸藥在雞蛋和雞肉樣品中的平均回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 25 veterinary drugs in eggs and chicken at three spiked levels (n=6)

2.4 實際樣品檢測

使用本方法檢測實驗室采集的5份雞蛋和5份雞肉樣品，以驗證方法的可行性和準確性。結(jié)果表明，有1份雞蛋中恩諾沙星含量為3.20 μg/kg，氟甲砜霉素含量為31.0 μg/kg，另有1份雞蛋中金剛烷胺含量為1.80 μg/kg；有1份雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星含量分別為11.3、4.5、14.7 μg/kg。采用GB/T 21312—2007標準方法檢測，雞蛋中恩諾沙星含量為3.34 μg/kg，雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星含量分別為11.1、4.2、15.5 μg/kg；采用SN/T 4253—2015標準方法檢測，雞蛋中金剛烷胺含量為1.5 μg/kg；采用GB/T 20756—2006標準方法檢測，雞蛋中氟甲砜霉素含量為28.1 μg/kg。其他藥物定性結(jié)果與標準方法一致，表明本方法準確性較好。

3 結(jié)論

本實驗根據(jù)樣品基質(zhì)的特點和4類獸藥的性質(zhì)，對前處理方法及儀器分析方法進行了優(yōu)化，建立了同時提取凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法正、負離子模式同時掃描測定雞蛋、雞肉中4類25種獸藥殘留。該方法前處理簡便、高效、回收率高、重復性好、成本低，一次測定即可完成4種標準方法才能完成的工作量，且對陽性樣品的檢出結(jié)果與標準方法得到的結(jié)果一致，對多種類獸藥的檢測具有借鑒意義，可為實驗室日常檢測、禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患排查及政府監(jiān)管提供技術(shù)支持。