溫針灸對(duì)消化不良性腹瀉大鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白3、4表達(dá)的影響研究*

范曉艷，何 峰，韓 昭，王雅楠

(陜西省康復(fù)醫(yī)院，陜西 西安 710065)

慢性腹瀉(Chronic diarrhea)是兒科常見疾病，以消化不良性腹瀉為主[1]。該疾病多發(fā)于2歲以下兒童，主要由于過量飲食，導(dǎo)致腸胃負(fù)擔(dān)增加，加之小兒脾胃功能尚未發(fā)育成熟，若消化系統(tǒng)長(zhǎng)期處于負(fù)重狀態(tài)，很容易引起消化不良，嚴(yán)重時(shí)會(huì)發(fā)生腹瀉[2]。患兒臨床癥狀為腹瀉、腹脹、大便過頻且呈稀糊狀，若未得到及時(shí)治療，會(huì)導(dǎo)致脫水、電解質(zhì)失衡和菌血癥等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響兒童生長(zhǎng)發(fā)育[3]。中醫(yī)學(xué)名歸屬為“久瀉”，以濕邪困脾、脾濕健運(yùn)為主要病機(jī)。中醫(yī)治療慢性腹瀉以補(bǔ)益脾胃、化濕止瀉為基本原則[4]。溫針灸是針刺與艾灸相結(jié)合的一種中醫(yī)療法，通過溫?zé)嵝?yīng)和光輻射共同作用于患處，具有溫通經(jīng)脈、行氣活血的作用，促進(jìn)患處相關(guān)功能的恢復(fù)。本研究通過對(duì)消化不良慢性腹瀉小鼠模型特定穴位進(jìn)行溫針灸治療，觀察其療效，從分子和細(xì)胞水平探索溫針灸對(duì)于消化不良慢性腹瀉的治療作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5周齡健康SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量90 g左右，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)大鼠在室溫(24±3)℃，光照12 h，濕度(45±5)%，自由飲食條件下，適應(yīng)性觀察3 d。分籠喂養(yǎng)，稱體質(zhì)量。將20只大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D 4組。A組：空白組(5只)；B組：模型組(5只)；C組：溫針灸1個(gè)療程組(5只)；D組：溫針灸2個(gè)療程組(5只)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑和器材

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；兔多克隆抗體AQP-3及AQP-4一抗、羊抗兔AQP-3、AQP-4二抗(美國(guó)Abcam公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)和石蠟切片機(jī)(美國(guó)Bio-Rad公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；一次性無菌針灸針(0.25 mm×25 mm，由蘇州醫(yī)療器械有限公司提供)；艾粒[12 mm×15 mm，(0.7±0.07)g/粒,由上海泰成科技發(fā)展有限公司提供]。

1.3 模型制備

參考劉舒[5]的方法，空白組(A組)飼料不變，將B、C、D組基礎(chǔ)飼料中的葡萄糖全部改為乳糖，其余成分保持不變，即為高乳糖飼料。SD大鼠高乳糖飼料喂養(yǎng)，飲水采用滅菌純凈水。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均自由進(jìn)食和飲水。每日同一時(shí)間進(jìn)行體質(zhì)量、飲水量測(cè)量和大便觀察。觀察大便的性狀、顏色和大鼠精神狀態(tài)。對(duì)每只大鼠每天的稀便、干便進(jìn)行計(jì)數(shù)，用分規(guī)和刻度尺測(cè)量每一稀便污跡的直徑，根據(jù)直徑可分為4級(jí)：<1 cm為1級(jí)，1～1.9 cm為2級(jí)，2～3 cm為3級(jí)，>3 cm為4級(jí)。以腹瀉率和腹瀉指數(shù)作為評(píng)判腹瀉的主要指標(biāo)。稀便率=每只動(dòng)物所排的稀便數(shù)÷該動(dòng)物總便數(shù)；腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級(jí)。腹瀉指數(shù)為3～4即建模成功。

1.4 干預(yù)方法

模型建立成功后，每組均給予正常飲食。A空白組和B模型組均不予治療；C組給予溫針灸，1次/d，治療周期為5 d；D組給予溫針灸，1次/d，治療5 d后休息2 d，再行針灸5 d。針灸部位：天樞、關(guān)元、中脘配足三里[6]。溫針灸方法：將大鼠用自制固定器固定，使其仰臥，75%乙醇將施針穴位周圍消毒3遍，右手持針垂直刺入5 mm，得氣后將艾粒置于針柄，從下端點(diǎn)燃艾粒，每穴每次灸2壯，燃盡起針。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 各組大鼠腹瀉情況 觀察并記錄模型組大鼠及溫針灸組大鼠活動(dòng)狀態(tài)及排便情況。

1.5.2 Western blot檢測(cè)水通道蛋白3(Aquaporin-3,AQP-3)、水通道蛋白4(Aquaporin-4,AQP-4) 治療結(jié)束后處死大鼠，剖腹，取2 cm結(jié)腸中段。使用RIPA裂解液在冰上提取組織總蛋白，蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定所得總蛋白濃度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，PVDF膜快速轉(zhuǎn)印1.5 h，5 %脫脂奶粉封閉液封閉2 h，TBST洗膜5 min，重復(fù)3次，分別加入AQP-3、AQP-4一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min，重復(fù)3次，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜5 min，重復(fù)3次，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件計(jì)算灰度值，采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為蛋白表達(dá)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.3 qPCR法檢測(cè)AQP-3 mRNA、AQP-4 mRNA的表達(dá) 治療結(jié)束后處死大鼠，剖腹，取2 cm結(jié)腸中段組織，稱取50 mg于液氮中研磨成粉。置于離心管中，加入1.5 mL BB4及75 μL Proteinase K溶液，輕搖混勻后置于56 ℃水浴鍋15 min。之后12 000 r/min離心5 min，取上清1 mL轉(zhuǎn)移至RNase-free離心管中。向RNase-free離心管上清中加入1 mL 70%乙醇，徹底混勻后，12 000 r/min離心30 s后，棄上清。提取RNA。檢查RNA純度和含量后，采用qPCR法，檢測(cè)AQP-3 mRNA和 AQP-4 mRNA含量，并計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.5.4 ELISA法檢測(cè)大鼠結(jié)腸粘膜組織細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8及IL-10的表達(dá) 治療結(jié)束后處死大鼠，剖腹，取2 cm結(jié)腸中段組織樣本，加入0.02 M濃度 PBS(PH 7.4)溶液，研磨成5%組織勻漿，靜置10 min，3 500 r/min速度，4 ℃離心20 min，取上清液儲(chǔ)存于-20 ℃凍存待測(cè)。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)組織中TNF-α、IL-6、IL-8及IL-10含量。

1.5.5 免疫組化檢測(cè)AQP3和AQP4陽性細(xì)胞表達(dá) 于溫針灸結(jié)束后，麻醉斷頸處死，剖腹，取2 cm結(jié)腸中段。用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，在顯微鏡下于結(jié)腸黏膜、腸絨毛處選取3個(gè)高倍視野(400×)，對(duì)AQP3和AQP4陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腹瀉情況

模型大鼠大便溏泄、食欲差及活動(dòng)減少，并出現(xiàn)消瘦現(xiàn)象。開始治療后，治療組模型大鼠腹瀉情況有所緩解。不同療程溫針灸組腹瀉指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同療程溫針灸對(duì)大鼠腹瀉指數(shù)的影響

2.2 Western blot檢測(cè)溫針灸對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白AQP-3、AQP-4相對(duì)表達(dá)的影響

與模型組比較，溫針灸1個(gè)療程和溫針灸2個(gè)療程組AQP3和AQP4蛋白的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)。同時(shí)，溫針灸2個(gè)療程組AQP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于溫針灸1個(gè)療程組和空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組AQP3、AQP4蛋白表達(dá)

圖1 不同療程溫針灸對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白AQP-3、AQP-4表達(dá)的影響

2.3 溫針灸對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜水通道蛋白AQP-3 mRNA、AQP-4 mRNA相對(duì)表達(dá)的影響

模型組AQP3 mRNA和AQP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于空白組、溫針灸1個(gè)療程和溫針灸2個(gè)療程組，溫針灸2個(gè)療程組AQP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。溫針灸2個(gè)療程組AQP3 mRNA和AQP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于溫針灸1個(gè)療程組，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組AQP3 mRNA、AQP4 mRNA擴(kuò)增曲線圖

表3 各組AQP3 mRNA、AQP4mRNA相對(duì)表達(dá)變化

2.4 不同療程溫針灸對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜TNF-α、IL-10、IL-6及IL-8表達(dá)的影響

與模型組比較，溫針灸1個(gè)療程組和溫針灸2個(gè)療程組TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)降低，IL-10表達(dá)升高，除溫針灸1個(gè)療程組的IL-8以外，其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。且溫針灸2個(gè)療程組IL-6的表達(dá)低于空白組，IL-10的表達(dá)高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同療程溫針灸對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α表達(dá)變化

2.5 免疫組化檢測(cè) 不同療程溫針灸對(duì)大鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞AQP3、AQP4蛋白表達(dá)的影響

空白組、溫針灸1個(gè)療程組和溫針灸2個(gè)療程組光密度值高于模型組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表5、圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP4免疫陽性細(xì)胞表達(dá)情況(400×)

表5 各組大鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP4免疫陽性細(xì)胞光密度值變化

3 討論

針灸是中醫(yī)領(lǐng)域重要的外治方法之一，其基于整體觀念和辨證論治，通過穴位刺激產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，具有疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)理陰陽和扶正驅(qū)邪等作用。研究表明，針灸可增加施針部位的血液循環(huán)[7]，還可影響針刺部位及所對(duì)應(yīng)臟腑的糖、脂類、蛋白質(zhì)的代謝及能量代謝[8-9]。廣泛用于骨關(guān)節(jié)、脈管炎和中風(fēng)后遺癥等多種疾病的治療[10-12]。艾灸作為一種熱療手段，通過溫?zé)岽碳ぃせ钛ㄎ痪植康奶禺惛惺芷?、熱敏感免疫?xì)胞等，從而誘發(fā)多種局部效應(yīng),達(dá)到溫通溫補(bǔ)的作用[13]，并能調(diào)節(jié)局部穴位組織紊亂的神經(jīng)遞質(zhì)[14]，從不同層面改善患者的神經(jīng)和免疫通路，達(dá)到治療疾病的目的。

天樞為胃經(jīng)之穴，又為大腸募穴，具有斂腸止痛之功；足三里為足陽明胃經(jīng)的合穴。中醫(yī)理論認(rèn)為，脾胃乃后天生化之源，胃腑的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是保證機(jī)體抵御邪氣的重要基礎(chǔ)。溫針灸足三里可有效生發(fā)胃氣，起到維護(hù)胃腑的作用[15]；關(guān)元?dú)w任脈，為足三陰經(jīng)交會(huì)穴，又為小腸募穴，可補(bǔ)腎培元、振奮陽氣，舒調(diào)肝脾腎3條陰經(jīng)之氣。研究表明，針灸關(guān)元穴可增強(qiáng)大鼠能量代謝，有效調(diào)節(jié)大鼠免疫功能[16-17]；中脘為陽明經(jīng)募穴，八會(huì)穴，可調(diào)胃益氣?！肚Ы鹨矸健酚涊d中脘主治病癥，如“虛勞吐血，灸胃管三百壯，亦主嘔逆吐血，少食多飽及多睡百病”“胸滿，飲食不消”[18]。足三里配合中脘穴，對(duì)于治療胃實(shí)證、脾實(shí)證的干預(yù)效果優(yōu)于單穴[19]。“合主逆氣而瀉”“五臟六腑之氣皆秉于胃”，可以調(diào)節(jié)中焦、升清降濁，與天樞一起“合募配穴”，共奏調(diào)理大腸之功[6]。

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一類重要的跨膜蛋白，廣泛分布于人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，可通過促進(jìn)滲透梯度的擴(kuò)散，促進(jìn)液體和小溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。廣義地講，AQPs的生理功能包括上皮液體運(yùn)輸、液體分泌、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移和甘油運(yùn)輸，其與多種調(diào)控機(jī)制有關(guān)，參與機(jī)體的生理和病理轉(zhuǎn)歸[20]。AQP3分布于小腸末端上皮細(xì)胞的頂端和基部，結(jié)腸絨毛和表皮的角化細(xì)胞[21]，有報(bào)道顯示，LPS處理的HT-29細(xì)胞可通過JNK/p38信號(hào)通路下調(diào)AQP3的表達(dá)，從而改變結(jié)腸糞水含量[22]；刺激性瀉劑可通過結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞巨噬細(xì)胞活化和腫瘤壞死因子α的分泌間接誘導(dǎo)AQP3表達(dá)水平的下降[23]。AQP4除在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)豐富外，也廣泛分布于哺乳動(dòng)物胃腸道，參與胃腸道水代謝及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。其在腸道主要定位于小腸隱窩細(xì)胞和結(jié)腸表面上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜。Zhang D等[24]在小鼠腹瀉模型中可觀察AQP4 mRNA及其蛋白水平的下降。Sakai H等[25]報(bào)道，5-氟尿嘧啶導(dǎo)致的腹瀉小鼠結(jié)腸中，AQP4、AQP8基因表達(dá)水平顯著降低。由此可見，AQP3和AQP4表達(dá)的下調(diào)可導(dǎo)致結(jié)腸水的轉(zhuǎn)運(yùn)從吸收狀態(tài)變?yōu)榉置跔顟B(tài)，從而引起嚴(yán)重腹瀉。

本研究對(duì)乳糖誘導(dǎo)的消化不良慢性腹瀉SD模型大鼠進(jìn)行不同療程的溫針灸。檢測(cè)其結(jié)腸黏膜AQP3和AQP4蛋白及其mRNA發(fā)現(xiàn)，空白組和溫針灸組大鼠AQP3和AQP4蛋白及對(duì)應(yīng)的mRNA表達(dá)高于模型組，且溫針灸2個(gè)療程組高于溫針灸1個(gè)療程組。說明腹瀉大鼠結(jié)腸黏膜AQP3和AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)降低，而溫針灸可顯著上調(diào)腹瀉大鼠的AQP3和AQP4蛋白和mRNA水平，且2個(gè)療程較1個(gè)療程提高更明顯。對(duì)于提高近端結(jié)腸對(duì)水的吸收、改善腹瀉和脫水癥狀有較好的療效。另外，溫針灸2個(gè)療程組的AQP3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于溫針灸1個(gè)療程組，而AQP4蛋白、AQP3 mRNA和AQP4 mRNA在兩個(gè)療程中差異不顯著，說明AQP3蛋白對(duì)于溫針灸療程敏感度高于AQP4蛋白，且不同療程對(duì)于AQP3 mRNA和AQP4 mRNA的表達(dá)影響不顯著。

腹瀉導(dǎo)致腸道組織水腫，除細(xì)胞和組織腫脹外，其導(dǎo)致的細(xì)胞外體液的聚集，也是炎癥反應(yīng)和內(nèi)環(huán)境紊亂的表現(xiàn)[26]。大量研究表明，在炎癥反應(yīng)中，均存在水通道蛋白的失調(diào)[27-28]。本研究結(jié)果顯示，溫針灸1個(gè)療程組和溫針灸2個(gè)療程組大鼠結(jié)腸組織的TNF-α、IL-6和IL-8較模型組表達(dá)降低，IL-10表達(dá)升高，說明溫針灸可明顯改善腹瀉大鼠結(jié)腸組織的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，溫針灸2個(gè)療程組IL-6的表達(dá)明顯低于空白組，IL-10的表達(dá)明顯高于空白組，說明溫針灸不僅可改善腹瀉，還可將部分炎性因子水平降至正常個(gè)體以下，可對(duì)機(jī)體起到治療和保健作用。AQP3和AQP4免疫陽性免疫組化染色呈棕褐色，分布于胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。本研究使用光密度值表示免疫細(xì)胞陽性數(shù)量，發(fā)現(xiàn)溫針灸不同療程組AQP3和AQP4光密度值均顯著高于模型組和空白組，說明溫針灸有助于提高慢性腹瀉大鼠和正常大鼠結(jié)腸黏膜的水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，對(duì)于腹瀉和營(yíng)養(yǎng)吸收具有治療和改善作用。

綜上所述，溫針灸可通過上調(diào)消化不良慢性腹瀉SD大鼠結(jié)腸黏膜AQP3、AQP4 mRNA和蛋白表達(dá)，達(dá)到止瀉的治療效果。同時(shí)，上調(diào)其炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8水平，下調(diào)IL-10水平，降低正常機(jī)體結(jié)腸黏膜炎癥水平，增強(qiáng)大鼠免疫力，增加結(jié)腸黏膜的營(yíng)養(yǎng)吸收，對(duì)機(jī)體具有保健作用。