基于腸道菌群研究針刺水溝穴對持續(xù)植物狀態(tài)患者營養(yǎng)狀態(tài)的影響*

劉烜瑋,趙娜娜,肖 鵬,陳嘉敏,文 瓊,王玉龍

(1.深圳市大鵬新區(qū)南澳人民醫(yī)院,廣東 深圳 518121；2.深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院,廣東 深圳 518000；3.深圳大學醫(yī)學院,廣東 深圳 518035)

持續(xù)植物狀態(tài)(Persistent vegetative state，PVS)是指嚴重腦損傷導致的植物狀態(tài)持續(xù)1個月以上[1]。PVS患者完全喪失對自身及外界的認知功能，但保留自主功能，無任何自發(fā)語言及有目的的四肢活動[2]。皮質(zhì)下無意識活動，對于疼痛或有害刺激可出現(xiàn)痛苦表情或逃避反應(yīng)，但通常無定位反應(yīng)[3]。可有無意識的哭叫，有不規(guī)則的睡眠-醒覺周期[4]。PVS在中醫(yī)學中屬于尸厥病范圍[5]。隨著科技的發(fā)展，重癥監(jiān)護設(shè)備的研發(fā)和急救診療技術(shù)不斷提升，急癥病人的死亡率已明顯降低，但也因此出現(xiàn)了大量的PVS患者[6]。據(jù)其他國家統(tǒng)計，PVS發(fā)病率在0.03‰左右[7]，美國為0.19‰[8]，推測中國大約有15萬PVS患者。該病預(yù)后不良，意識、功能恢復(fù)較差，致殘率和致死率高[9]。國內(nèi)一項回顧性研究也發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)狀況差的PVS患者的死亡風險是營養(yǎng)狀況好的3.352倍；而持續(xù)腸內(nèi)營養(yǎng)治療不僅可以改善PVS患者的營養(yǎng)狀況，還能改善疾病預(yù)后[10]。擁有悠久歷史的中醫(yī)對PVS治療積累了豐富的治療經(jīng)驗，成為中西醫(yī)結(jié)合治療PVS危重癥的發(fā)展趨勢。水溝穴(別名人中穴)為督脈和手陽明大腸經(jīng)、足陽明胃經(jīng)的交會穴，具有醒腦開竅、清熱通陽、救逆止搐和舒筋利脊的作用[11]。腸道與大腦之間的雙向信息交流系統(tǒng)被稱為腸腦軸。近年來，越來越多的研究表明腸道菌群可以通過腸腦軸調(diào)節(jié)大腦的發(fā)育和功能，進而影響宿主的行為。因此，醫(yī)學科學家們提出了“微生物-腸-腦”(Microbiota-Gut-Brain，MGB)軸的概念[12]。“微生物-腸-腦”軸之間的溝通交流表明了來自腸道菌群的信號是如何影響大腦功能的以及大腦是如何影響腸道菌群的活性和胃腸道生理學的。這種雙向交流主要通過自主神經(jīng)系統(tǒng)和腸道神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌和神經(jīng)免疫機制來實現(xiàn)。因此，在“微生物-腸-腦”的雙向調(diào)節(jié)概念的指導下，本研究通過觀察針刺PVS患者水溝穴來研究對其營養(yǎng)狀況的影響，對于患者的預(yù)后判斷有積極的作用，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

選取2017年12月—2020年4月在本院植物人促醒科接受治療的PVS患者76例。其中，男性47例，女性29例，年齡18～80歲，平均年齡(48.32±7.57)歲。利用Excel隨機數(shù)字分組方法將76例患者隨機分為試驗組(n=38)與對照組(n=38)。兩組一般資料比較,年齡(P=0.810)、病程(P=0.171)、性別(P=0.813)比均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，兩組病因分別為腦出血、腦外傷、二氧化碳中毒和缺氧腦病(P=0.431)病因比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 納入標準

①符合PVS診斷標準；②年齡18～80歲；③愿意按照本研究要求只使用腸內(nèi)營養(yǎng)劑或自制勻漿配方進行營養(yǎng)支持治療；③BMI為18.5～23.9；④家屬或授權(quán)委托人同意參加本課題研究并在知情同意書上簽字。

1.3 排除標準

①2周內(nèi)曾應(yīng)用抗生素、益生菌制劑進行治療；②并發(fā)嚴重的內(nèi)分泌和代謝性疾?。虎鄄l(fā)嚴重的肝腎功能障礙；④并發(fā)嚴重心肺功能不全；⑤并發(fā)消化道潰瘍、出血和嚴重腹瀉不能應(yīng)用腸內(nèi)營養(yǎng)制劑；⑥并發(fā)風濕免疫疾??；⑦并發(fā)惡性腫瘤。

2 治療方案

2.1 試驗組治療方法

2.1.1 常規(guī)治療 包括基礎(chǔ)病治療及藥物促醒治療，基礎(chǔ)病治療包括降壓、降糖、抗血小板凝集、抗凝及他汀類藥物治療；促醒治療包括溴隱亭、多巴絲肼和金剛烷胺等治療。

2.1.2 康復(fù)訓練 包括運動治療(被動)、吞咽功能訓練(被動)、中頻脈沖電治療和氣壓治療等。

2.1.3 營養(yǎng)治療 取含有ω-3PUFAs腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液(enteral nutritional suspension，TPF，能全力，紐迪希亞制藥有限公司)，熱量按每天25～30 kcal/kg提供。

2.1.4 針刺治療 水溝穴屬于督脈，位于人中溝的上1/3與中1/3的交點處。操作：患者取仰臥位，采用75%酒精消毒皮膚后，選用一次性使用的無菌不銹鋼毫針(規(guī)格為0.30 mm×25 mm)進行針刺。方法向上斜刺15 mm，1次/d，每次留針30 min，期間每10 min行針1次，行針方法采用均勻提插捻轉(zhuǎn)行針法，捻轉(zhuǎn)角度180°，提插幅度在上下1 mm，頻率均為60 r/min。

2.2 對照組治療方法

常規(guī)治療+康復(fù)治療+營養(yǎng)治療，均同試驗組。療程均為1個月。

3 觀察指標

3.1 腸道菌群及代謝產(chǎn)物檢測

本研究關(guān)于樣品收集方面采取治療前后收集所有受試者糞便樣本。提取樣本腸道菌群DNA。16S rRNA基因V3-V4區(qū)PCR擴增及Mseiq文庫構(gòu)建測序：參照儀器說明書，采用雙端PE300策略測序，并利用儀器自帶軟件進行圖像分析和數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化過程。

3.2 腸道菌群基因數(shù)據(jù)分析

采用QIIME軟件計算Alpha多樣性指數(shù)包括Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。

3.3 腸道菌群代謝產(chǎn)物定量檢測

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)進行定量糞便代謝產(chǎn)物檢測。

3.4 營養(yǎng)狀態(tài)評估

于治療前后檢測所有受試者血清白蛋白、前白蛋白及血紅蛋白水平。所有受試者于治療前后及隨訪的第30 d、90 d行營養(yǎng)風險篩查表(nutrition risk screening 2002，NRS2002)，歐洲腸外腸內(nèi)營養(yǎng)學會(ESPEN)于2002年在德國慕尼黑年會的大會主題報告，2003年在《臨床營養(yǎng)》雜志發(fā)表，ESPEN“指南”推薦)評定。因PVS患者無法稱量體質(zhì)量，以清晨空腹血清白蛋白<30 g/L認定為存在營養(yǎng)不良風險(營養(yǎng)風險評估為3分)。

4 統(tǒng)計學處理

5 結(jié)果

5.1 Mesiq測序結(jié)果

試驗組coverage指數(shù)(0.998 5±0.002 2)，對照組coverage指數(shù)(0.997 9±0.001 9)，兩組coverage指數(shù)均>0.99，表明樣本中序列未被測出的概率較低，測序結(jié)果可反映糞便樣本的真實情況。腸道菌群Alpha多樣性分析：治療前兩組Alpha多樣性比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后試驗組和對照組Chao指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)與本組治療前比較均顯著增高(P<0.05)，Simpson指數(shù)顯著降低(P<0.05)。且試驗組糞便菌群Chao指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，試驗組Simpson指數(shù)顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組治療前后腸道菌群多樣性比較

5.2 腸道菌群變化情況

治療前兩組擬桿菌屬(Bacteroides)、普氏菌屬(Prevotella)以及柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)等細菌相對豐度比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后試驗組Bacteroides、Prevotella、Faecalibacterium和梭菌屬(Clostridium)的相對豐度與治療前比較均顯著增高(P<0.05)，而腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonodaceae)和羅爾斯通菌屬(Ralstonia)的相對豐度均顯著下降(P<0.05)。治療后對照組Bacteroides、Prevotella、Faecalibacterium、Clostridium的相對豐度與治療前比較均顯著增高(P<0.05)，Enterobacteriaceae、Pseudomonodaceae、Ralstonia的相對豐度均顯著下降(P<0.05)。治療后試驗組腸道菌群的相對豐度與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組治療前后腸道菌群變化

5.3 腸道菌群代謝產(chǎn)物

糞便樣本中短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)主要為乙酸、丙酸、丁酸和戊酸。比較四種化合物的峰面積，乙酸含量最高，戊酸含量最低。治療前兩組腸道菌群代謝產(chǎn)物乙酸、丙酸、丁酸和戊酸比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后試驗組乙酸、丁酸和戊酸含量與治療前比較均顯著增高(P<0.05)，丙酸含量顯著降低(P<0.05)。治療后對照組乙酸、丁酸和戊酸含量與治療前比較有所增高，丙酸含量有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后試驗組與對照組比較，腸道菌群代謝產(chǎn)物差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組治療前后腸道菌群代謝產(chǎn)物峰面積百分比比較

5.4 營養(yǎng)評估

治療前兩組血清白蛋白、前白蛋白及血紅蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后兩組上述血清營養(yǎng)指標與本組治療前比較均顯著增高(P<0.05)，且試驗組顯著高于對照組(P<0.05)。見表4。治療前兩組NRS2002評分比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且兩組NRS2002評分均>3分，應(yīng)進行營養(yǎng)支持。治療后試驗組NRS2002評分與治療前比較顯著降低(P<0.05)，而對照組NRS2002評分與治療前比較有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，試驗組NRS2002評分與對照組比較顯著降低(P<0.05)。隨訪第30天時，兩組NRS2002評分與本組治療前、治療后比較均顯著降低(P<0.05)，且試驗組顯著低于對照組(P<0.05)。隨訪第90天時，兩組NRS2002評分與本組治療前、治療后及隨訪第30 d比較均顯著降低(P<0.05)，且試驗組顯著低于對照組(P<0.05)。見表5。

表4 兩組治療前后血清營養(yǎng)指標比較

表5 兩組NRS2002評分比較

6 討論

腸道微生物群是一個龐大的微生物群體，構(gòu)成了機體腸道微生態(tài)系統(tǒng)，直接影響著機體健康。腸道為微生物群提供棲息地及其所需營養(yǎng)物質(zhì)，下調(diào)免疫反應(yīng)以形成免疫耐受，促進其在腸道內(nèi)定植?！拔⑸?腸-腦”軸是一個把宿主腸道與大腦活動結(jié)合起來的雙向應(yīng)答系統(tǒng)，并為腸道菌群及其代謝產(chǎn)物提供了一個進入大腦的潛在途徑[13]。近年來，基于“微生物-腸-腦”軸理論，“從腦治腸”的研究逐漸增多，且療效頗佳，但關(guān)于針灸相關(guān)的臨床研究卻相對欠缺。中醫(yī)臟腑理論認為腦與腸之間關(guān)系密切，胃腸系統(tǒng)的異常會影響腦功能并誘發(fā)癡呆、健忘和神機異常等多種腦病，反之腦功能的異常也可影響胃腸的正常吸收營養(yǎng)的功能。故通過調(diào)節(jié)腦功能來治療胃腸功能紊亂或低下具有中醫(yī)理論依據(jù)[10]。水溝穴(別名人中穴)為督脈和手陽明大腸經(jīng)、足陽明胃經(jīng)的交會穴，具有醒腦開竅、清熱通陽、救逆止搐和舒筋利脊的作用[14]。中醫(yī)理論中，針灸水溝穴可通過調(diào)節(jié)腸道微生物群治療肥胖、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征、心血管病及腦病等多種疾病。研究發(fā)現(xiàn)，合理的營養(yǎng)支持是保證植物狀態(tài)患者改善負氮平衡，增進機體免疫功能，促進患者康復(fù)的基礎(chǔ)[9]。有研究顯示，針刺療法可以通過調(diào)節(jié)參與SCFAs和中鏈脂肪酸生成的菌群豐度以及與機體炎癥反應(yīng)相關(guān)的菌群結(jié)構(gòu)等方式改善2型糖尿病患者腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂[15]。

PVS患者認知功能喪失，無吞咽能力，且患者昏迷時間較長，呈高分解、代謝狀態(tài)，存在負氮平衡。營養(yǎng)不良會導致患者免疫力低下，易造成感染、胸腔積液和壓瘡等并發(fā)癥，生存極為困難。有研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)不良是PVS患者感染的危險因素，是PVS患者預(yù)后不良的獨立危險因素[16]。也有學者指出，存在肺部感染的PVS患者的死亡風險是無肺部感染的3倍左右[17]，營養(yǎng)狀況差者的死亡風險是營養(yǎng)狀況良者的4倍左右[18]。因此，及時給予患者營養(yǎng)支持對于促進患者預(yù)后及延長患者生存期具有重要意義。

中醫(yī)理論認為PVS患者多為患者久病多虛，臟腑功能衰退，氣血津液不足，而導致腦充氧失常，故在醒腦開竅的同時扶正補虛，以標本兼治?！鹅`樞·邪客》曰：“營氣者，泌其津液，注之于脈，化以為血以榮四末，內(nèi)注五臟六腑……”，故脾胃為氣血生化之源。同時，由于痰、瘀和毒邪阻蔽清竅，氣血難以上輸于腦竅，使腦中氣血不足。氣血是生命運動的物質(zhì)基礎(chǔ)和先決條件，故治療應(yīng)從脾胃功能為切入點，調(diào)節(jié)從腸道菌群的治法理論可行。有研究報道，實施腸內(nèi)營養(yǎng)支持的PVS患者，極大地改善了營養(yǎng)狀況，且顯著降低了并發(fā)癥發(fā)生率，提高了生存率[19]。也有研究顯示，通過2周腸內(nèi)營養(yǎng)支持，PVS患者的營養(yǎng)學指標，包括血糖、血清總蛋白等較治療前均有顯著改善[20]。本研究結(jié)果顯示，治療后兩組血清白蛋白、前白蛋白及血紅蛋白水平與本組治療前比較均顯著增高，且試驗組上述血清營養(yǎng)指標顯著高于對照組。

有研究顯示，應(yīng)用NRS2002能篩查出存在營養(yǎng)風險的患者，給予有營養(yǎng)風險的患者營養(yǎng)支持后，可改善臨床結(jié)局，如縮短住院時間、降低并發(fā)癥發(fā)生率和減少再次入院次數(shù)等[21]。本研究顯示，治療前兩組NRS2002評分均>3分，說明兩組患者均存在營養(yǎng)風險。治療后試驗組與對照組NRS2002評分與本組治療前比較均降低，但試驗組降低更為顯著。隨訪第30天、90天時，兩組NRS2002評分與本組治療前比較均顯著降低，且試驗組顯著低于對照組，表明采用針刺水溝穴聯(lián)合腸內(nèi)營養(yǎng)治療能顯著改善PVS患者營養(yǎng)狀況。

近年來，關(guān)于腦與腸兩者之間存在雙向調(diào)節(jié)關(guān)系的大量臨床研究集中在促醒，本研究基于脾胃理論，從中醫(yī)學脾的功能來理解腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，重視氣血生化之源，調(diào)節(jié)腸道微生物，進而對患者的營養(yǎng)狀態(tài)起到正向的調(diào)節(jié)作用，本研究方法操作簡單，可復(fù)制性強，容易控制變量，為臨床制定針刺治療方案提供一定的參考價值。

但本試驗同時存在一些遺憾，主要是未能引入腦功能觀察及評價指標，如比較基于靜息態(tài)功能磁共振(resting-state functional magnetic resonance imaging，rs-fMRI)技術(shù)的比率低頻振幅(fractional amplitude of low frequency fluctuation，fALFF)、局部一致性(Regional homogeneity，ReHo)、腦灰質(zhì)和白質(zhì)體積，以分析兩種治療方法治療前后的腦功能差異、試驗前后血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)測定以及PVS量表/昏迷恢復(fù)量表-修訂版(Coma recovery scale-revised，CRS-R)的比較等。因此，下一步將開展相關(guān)研究，引入以上觀察及評價指標，進一步探討和闡釋針刺水溝穴是否可以通過“微生物-腸-腦”改善PVS患者的腦功能及意識狀態(tài)，進一步為PVS患者促醒治療提供有效的治療方案。