冰片增強(qiáng)依達(dá)拉奉對腦缺血再灌注損傷大鼠抗氧化作用研究

王文生·王月，陳 悅，賈紅娥，郭冬梅

（1.烏魯木齊市中醫(yī)院南門醫(yī)院心腦病科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院老年病科，烏魯木齊 830001）

缺血性腦卒中（ischemia stroke，IS）是臨床常見的腦血管系統(tǒng)疾病[1]。目前常以溶栓聯(lián)合神經(jīng)保護(hù)藥物治療，但溶栓可能會導(dǎo)致失語、半身不遂[2]。依達(dá)拉奉（edaravone）是一種氧自由基清除劑，在缺血性腦卒中治療中應(yīng)用廣泛[3]。部分患者使用依達(dá)拉奉后仍存在神經(jīng)功能損傷[4]。中醫(yī)理論中腦缺血病機(jī)為“血行緩慢致瘀，瘀邪化熱致毒，毒邪傾體以致腦神逆亂”。因此，缺血性腦卒中早期治療應(yīng)“芳香開竅，祛瘀散熱”“祛除邪毒”[5]。且中西醫(yī)聯(lián)合是提高缺血性腦卒中患者治愈率的有效途徑。冰片（borneol）為龍腦香科植物龍腦，多用于中風(fēng)、痰熱、神昏竅閉等證，具有“引藥上行”“芳香走竄”的功效，常作為輔藥以促進(jìn)藥物吸收[6]。因此，冰片聯(lián)合依達(dá)拉奉治療能夠提高其抗氧化效果。本研究通過構(gòu)建腦缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）模型，探討冰片聯(lián)合依達(dá)拉奉對I/R 的影響，為冰片配伍依達(dá)拉奉用于治療缺血性腦卒中提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 冰片（艾片，borneol，左旋龍腦，含量≥86.0%，湖北俊輝藥業(yè)有限公司）；依達(dá)拉奉注射液（必存，江蘇先聲東元制藥有限公司，批號：80190401）；L3200 大鼠線栓（200～240 g，廣州佳靈生物技術(shù)公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，北京索萊寶公司）。MDA（malondialdehyde，丙二醛）試劑盒、SOD（superoxide dismutase，超氧歧化酶）試劑盒與GSH（glutathione，谷胱甘肽）試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)公司）；Anti-ZO-1（閉鎖小帶蛋白1）、Anti-Occludin（咬合蛋白）、Anti-Claudin-5（閉合蛋白5）、Anti-β-actin（β-肌動蛋白）抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司）。

1.2 動物分組與給藥 60 只SD 大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，清潔級，雄性，7～8 周齡，體質(zhì)量230～250 g，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)環(huán)境。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，腦缺血再灌注組，腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉組，腦缺血再灌注加冰片組，腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組，每組12 只。腦缺血再灌注模型構(gòu)建前3 天與構(gòu)建后2 h，腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉組與腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組尾靜脈給藥4 mL·kg-1依達(dá)拉奉，腦缺血再灌注加冰片組與腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組灌胃給藥15 mL·kg-1冰片溶劑。

1.3 I/R 模型構(gòu)建與神經(jīng)功能評估 麻醉大鼠，自頸部開口，分離出頸外動脈與頸內(nèi)動脈，將線栓插入頸總動脈，前進(jìn)至頸內(nèi)動脈約16～18 mm，固定線栓，縫合傷口。線栓插入2 h 后，取出線栓并結(jié)扎頸總動脈。假手術(shù)組僅麻醉后游離出頸總動脈。拔出線栓24 h 后，對各組大鼠神經(jīng)功能評估。評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，行為正常；1 分，缺血對側(cè)前肢無法伸展；2 分，缺血對側(cè)前肢無法伸展，僅能向一側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分，向一側(cè)轉(zhuǎn)圈時側(cè)推易跌倒；4 分，癱瘓。

1.4 腦梗死評估 取大鼠分離出全腦組織并冷凍成塊，切成5 片約2 mm 厚切片，浸沒于2 % TTC 溶劑中，避光孵育30 min，37 ℃。4% 多聚甲醛固定，按順序排列后拍照分析。

1.5 腦水腫評估 取大鼠全腦組織，電子秤稱重，記為濕重。干燥去濕，6 h 后稱重，記為干重。腦水腫程度=[（濕重-干重）/濕重]×100 %。

1.6 血腦屏障完整性評估 取大鼠，皮下注射4 mL/kg伊文思藍(lán)溶液。2 h 后處死，取缺血側(cè)腦組織，加入2 mL 甲酰胺勻漿，離心（12 000 r·min-1，20 min），取上清液。在620 nm 波長下檢測各個樣品孔OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各組樣品蛋白含量。

1.7 氧化因子、炎性細(xì)胞因子檢測 取大鼠缺血側(cè)組織，加入PBS混合勻漿。12 000 r·min-1離心后取上清液，用于氧化因子或炎性細(xì)胞因子的檢測。具體檢測流程根據(jù)試劑盒說明書步驟開展。

1.8 血腦屏障相關(guān)蛋白檢測 取大鼠缺血側(cè)基底層組織，加入裂解液勻漿，離心取上清液，加入上樣緩沖液，沸水浴變性。開展Western blot，并濕法轉(zhuǎn)移凝膠上蛋白至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉。使用一抗稀釋液浸沒PVDF 條帶孵育過夜，再以二抗稀釋液孵育。顯影儀下顯影獲得蛋白條帶，以β-actin 作為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析。實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析（One way Anova），各組數(shù)據(jù)兩兩比較采用Tukey檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（，n =12） 分

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（，n =12） 分

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05

2.2 各組大鼠腦梗死體積占比比較 假手術(shù)組染色顯示為紅色，即無任何梗死區(qū)域；腦缺血再灌注組中缺血側(cè)組織染色幾乎全部為白色。見表2，圖1。

表2 各組大鼠腦梗死體積占比比較（，n =12）

表2 各組大鼠腦梗死體積占比比較（，n =12）

注：與腦缺血再灌注組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)域染色

2.3 各組大鼠腦水腫程度比較 見表3。

表3 各組大鼠腦水腫程度比較（，n =12）

表3 各組大鼠腦水腫程度比較（，n =12）

注：與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較 見表4。

表4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較（，n =12）

表4 各組大鼠腦中氧化因子與抗氧化因子水平比較（，n =12）

注：與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.5 各組大鼠腦中炎性細(xì)胞因子水平比較 見表5。

表5 各組大鼠腦中炎性細(xì)胞因子水平比較（，n =12）

表5 各組大鼠腦中炎性細(xì)胞因子水平比較（，n =12）

注：與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01；與腦缺血再灌注組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

2.6 各組大鼠腦組織中緊密連接蛋白表達(dá)與量化統(tǒng)計比較 見圖3。與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組中ZO-1、Occludin 與Claudin-5 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與腦缺血再灌注組相比，腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉組與腦缺血再灌注加冰片組ZO-1、Occludin 與Claudin-5 表達(dá)增加（P＜0.05）。腦缺血再灌注加依達(dá)拉奉加冰片組ZO-1、Occludin與Claudin-5表達(dá)水平增加更明顯（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腦組織中緊密連接蛋白表達(dá)與量化統(tǒng)計比較

3 討論

目前，靜脈溶栓與神經(jīng)保護(hù)藥物聯(lián)合使用是缺血性腦卒中主要治療方式[7]，可幫助患者血流再通，但部分患者也會出現(xiàn)再灌注損傷[8]。本研究通過線栓法構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注模型。結(jié)果顯示，腦缺血再灌注造成大鼠神經(jīng)功能異常，腦組織中出現(xiàn)梗死區(qū)域。與此同時，構(gòu)建模型的各組大鼠出現(xiàn)不同程度的水腫，以腦缺血再灌注組最為明顯。此外，腦缺血再灌注導(dǎo)致大鼠腦組織中氧化因子、炎性細(xì)胞因子水平增加，抗氧化因子水平降低。以上結(jié)果提示本研究中腦缺血再灌注模型構(gòu)建成功。

中醫(yī)認(rèn)為，缺血性腦卒中屬于“血瘀證”，其特點為阻血滯氣、傷神損絡(luò)，治療原則為活血化瘀，若清竅阻滯，則氣血失于上行，水津失于輸布，痰瘀邪毒蘊結(jié)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大腦具有高能耗的特性，對缺血缺氧更敏感[9]。腦缺血再灌注會介導(dǎo)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物[10]。如MDA 屬于氧化應(yīng)激最終產(chǎn)物，會造成蛋白質(zhì)、核酸等大分子的交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，與中醫(yī)理論中的邪毒一致。SOD 與GSH 是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基兩種主要活性成分，組織內(nèi)MDA、GSH 水平與SOD 活性可反映氧自由基損傷程度[11]。在氧化因子的攻擊下，血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞會出現(xiàn)不同程度損傷，細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度破壞，以緊密連接中ZO-1 蛋白、跨膜蛋白中Occludin 蛋白、Claudin 蛋白表達(dá)降低為特征[12]。在內(nèi)皮細(xì)胞損傷情況下，微血管與腦實質(zhì)器官會出現(xiàn)損傷，血腦屏障的開放程度增加，外周水分子進(jìn)入造成腦水腫[13]。中樞炎性細(xì)胞因子在應(yīng)激條件下的過度釋放進(jìn)一步加大血腦屏障開放程度，造成神經(jīng)元壞死，出現(xiàn)局部的梗死區(qū)域[14]。生理條件下，體內(nèi)會通過抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)清除多余的活性氧，避免MDA過量產(chǎn)生。但腦缺血再灌注過程中，機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能無法完全抵御氧化應(yīng)激的過度激活，因此需要外源性藥物輔助治療。

依達(dá)拉奉是一種氧自由基清除劑，研究顯示依達(dá)拉奉基于Nrf2/HO-1 信號通路，誘導(dǎo)Akt 的激活，發(fā)揮抗氧化抗炎作用[15]。本研究中，依達(dá)拉奉降低了氧化因子MDA 水平，增加了抗氧化因子SOD 與GSH水平，降低了炎性細(xì)胞因子水平。然而，在大鼠腦組織梗死體積、腦缺血和神經(jīng)功能的宏觀指標(biāo)中，依達(dá)拉奉無法完全逆轉(zhuǎn)腦缺血再灌注造成的損傷。因此，腦缺血再灌注治療需要聯(lián)合給藥促進(jìn)依達(dá)拉奉發(fā)揮抗氧化功能。

中醫(yī)常用配伍藥物為冰片，具有“獨行則勢弱，佐使則有功”的特性?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，冰片不僅能穿過血腦屏障，而且能改變血腦屏障通透性，促進(jìn)其他藥物透過血腦屏障。本研究中，冰片介導(dǎo)了腦組織中炎性細(xì)胞因子部分降低，對氧化應(yīng)激因子具有一定抑制作用，但作用不明顯。在依達(dá)拉奉配伍冰片的應(yīng)用中，腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激因子、炎性細(xì)胞因子水平明顯降低，抗氧化應(yīng)激因子明顯提高。在大鼠宏觀指標(biāo)中，與腦缺血再灌注組相比明顯改善。

綜上所述，冰片具有“通諸竅、散郁火”功能，用于腦缺血治療具有部分療效。冰片增強(qiáng)了依達(dá)拉奉抗氧化作用，提高了神經(jīng)保護(hù)作用。這種配伍方式符合“相須相使”的配伍原則，值得在溶栓后抗腦缺血再灌注損傷治療中應(yīng)用。