基于生物信息學的息痛散治療痛風性關節(jié)炎的作用機制

南曉強，雷鵬，李娟娥

陜西省人民醫(yī)院中醫(yī)科，陜西西安 710068

前言

痛風是一種代謝性風濕疾病，由體內嘌呤代謝紊亂引起的高尿酸血癥，進而導致尿酸沉積在關節(jié)腔或軟組織中［1］。痛風性關節(jié)炎是一種由關節(jié)和關節(jié)周圍組織中MSU晶體沉淀引起的炎癥性疾病，其主要特征是一個或多個關節(jié)突然發(fā)作劇烈疼痛和腫脹，關節(jié)活動受限、功能障礙和反復發(fā)作［2］。起初發(fā)作頻次較低，但隨著疾病的發(fā)展，會變得愈加頻繁，因而成為痛風患者健康相關生活質量下降的主要原因［3-4］。鑒于過去20多年來痛風發(fā)病率的大幅上升，痛風性關節(jié)炎成為一個主要、日益嚴重的公共衛(wèi)生問題［5］。其治療復雜而昂貴，部分原因是由于此病常出現(xiàn)心血管疾病、慢性腎臟疾病和糖尿病等合并癥［6］。美國風濕病學會（ACR）和歐洲抗風濕聯(lián)盟（EULAR）推薦治療痛風性關節(jié)炎的口服藥物秋水仙堿、非甾體抗炎藥（NSAIDs）、糖皮質激素和白介素1（IL-1）阻斷劑［7-8］。然而，對這些口服藥劑的起效時間往往需要12～24 h，而且可能需經過幾天到1 周的時間才能完全達到治療效應［9］。故目前對于痛風性關節(jié)炎的治療仍缺乏理想的藥物。值得注意的是，近年來，全球因痛風性關節(jié)炎而住院的人數(shù)明顯增加，這與類風濕性關節(jié)炎患者入院人數(shù)減少形成鮮明對比［10］。

網絡藥理學有效整合了生物信息學及系統(tǒng)藥理學等技術，為中醫(yī)藥作用機制的研究提供了新思路和方法，通過藥物、成分、靶點和信號通路等揭示多分子藥物協(xié)同作用于人體的機制［11］，與中醫(yī)學的整體觀不謀而合。息痛散是本課題組在痛風性關節(jié)炎“痰熱瘀毒”發(fā)病觀指導下組方并經臨床使用多年的有效驗方，臨床應用療效顯著，前期實驗亦證明該方可明顯減輕痛風性關節(jié)炎模型大鼠關節(jié)足跖腫脹度，改善大鼠步態(tài)學評分，降低血清炎性因子IL-1β、TNF-α 水平［12-13］，但其具體作用機制仍需進一步闡明。本研究從網絡藥理學角度探究息痛散治療痛風性關節(jié)炎的分子機制，為后續(xù)基礎實驗提供思路，以期指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 息痛散中活性成分和作用靶點的收集篩選

以“蒼術”、“黃柏”、“牛膝”、“桃仁”為關鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索對應的成分，根據(jù)吸收、分布、代謝、排泄（Absorption，Distribution,Metabolism,Excretion,ADME）的藥動學特性參數(shù)篩選活性成分［14］。其中以口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%、藥物相似性（Drug Likeness,DL）≥0.18為篩選條件［15］。以“全蝎”、“忍冬藤”、“石膏”為關鍵詞，通過在TCMID數(shù)據(jù)庫上搜集其成分。將所得到的成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進行靶點提取。

1.2 息痛散中活性成分潛在作用靶點預測和基因名注釋

基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫，將息痛散中活性成分依次配對潛在的靶點，采用UniProt 數(shù)據(jù)庫中UniProtKB搜索功能（http://www.uniprot.org/）通過輸入蛋白名稱并限定物種為“human”，將檢索得到的所有蛋白標準化并將其校正為官方名稱，即為息痛散活性成分的預測作用靶點。

1.3 痛風性關節(jié)炎靶點的收集

使用GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，以“Gouty arthritis”為關鍵詞檢索痛風性關節(jié)炎相關基因。在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）gene 數(shù)據(jù)庫，以“Gouty arthritis”關鍵詞，選擇物種為“Homo sapiens”，獲得痛風性關節(jié)炎的基因。結果合并去重后則為痛風性關節(jié)炎相關基因。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡的構建

使用Cytoscape 3.7.2 軟件的插件Bisogenet（Martin等,2010），利用相互作用蛋白數(shù)據(jù)庫（DIP?）、相互作用數(shù)據(jù)集生物總庫（BioGRID）、人類蛋白質參考數(shù)據(jù)庫（HPRD）、完整分子相互作用數(shù)據(jù)庫（IntAct）、分子相互作用數(shù)據(jù)庫（MINT）和生物分子相互作用網絡數(shù)據(jù)庫（BIND）獲得PPI 數(shù)據(jù)［16］，即獲得息痛散治療痛風性關節(jié)炎相關基團。將息痛散預測靶點及痛風性關節(jié)炎相關靶點的PPI網絡可視化，并應用CytoHubba插件篩選出核心子網絡［17］。

1.5 GO和KEGG富集度分析

獲得核心靶點后，使用R4.0.2 軟件的ClusterProfiler 包［18］對核心靶點進行基因本體（Gene Ontology, GO）和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析［19］，其中GO 分析依據(jù)功能的不同，可區(qū)分為生物過程（Biological Process, BP）、細胞成分（Cellular Component, CC）、分子功能（Molecular Function，MF）［20］。

1.6 分子對接

從1.4 節(jié)中的核心子網絡中選擇最重要的基因進行后續(xù)的分子對接分析。使用AutoDockTools-1.5.6 軟件構建關鍵靶點的分子對接模型，之后將其與息痛散治療痛風性關節(jié)炎的主要成分進行分子對接，然后分析對接結果以驗證網絡分析結果的可靠性。首先從蛋白質數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）中下載息痛散治療痛風性關節(jié)炎關鍵靶點的蛋白質晶體結構，并選擇分辨率小于3? 的蛋白質復合物和配體［21］，以保證對接的準確性。從Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov//）下載息痛散中關鍵化合物的結構，然后用AutoDockTools-1.5.6軟件進行加氫、去電。蛋白質結構被設定為剛性大分子后進行分子對接。

1.7 實驗驗證

1.7.1 痛風性關節(jié)炎模型的建立參照Coderre等［21］的方法制備大鼠痛風性關節(jié)炎模型。將32只健康SD大鼠隨機分為對照組、模型組、息痛散組及秋水仙堿組，每組8只，除對照組，其余3組小鼠經2.5%異氟烷麻醉后，以碘酒、乙醇局部消毒處理，用1 mL滅菌注射針在小鼠右側踝關節(jié)背側，從45°方向插入至脛骨肌腱內側，將含0.5 mg尿酸鈉溶液20 μL注入到關節(jié)腔，造模后各組小鼠踝關節(jié)均出現(xiàn)明顯腫脹，提示造模成功。對照組注射等量生理鹽水。參照人與小鼠體表面積換算法，及前期實驗基礎［12］，按成人每日服用息痛散劑量為中劑量，小鼠每日息痛散給藥劑量為15.3 mL/kg，秋水仙堿每日治療藥量為0.6 mg/kg，正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，2次/d，連續(xù)4 d。

1.7.2 觀察指標受試關節(jié)脫鈣處理后取組織，Western Blot法檢測踝關節(jié)滑膜組織PI3K、p-Akt蛋白表達。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學處理。所有檢測結果均為計量資料，以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 息痛散化學成分搜集結果

在TCMSP、TCMID 數(shù)據(jù)庫中檢索到息痛散所有化學成分共計936 個（截止時間為2021年5月28日），以OB≥30%、DL≥0.18為標準，檢索出146個主要活性成分；槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、黃柏黃酮II、異鼠李素等為息痛散中的主要活性成分。其中蒼術26 種，黃柏8 種，牛膝9 種，全蝎41 種，忍冬藤15種，石膏28種，桃仁19種，百部32種。共預測靶標2 129個；方中各藥味活性成分和預測靶標數(shù)量見表1。

表1 息痛散“化合物-有效成分-靶標”基本信息Tab.1 Basic information on"compound-active ingredienttarget"for Xitongsan

2.2 痛風性關節(jié)炎潛在靶點的預測

通過NCBI、GeneCards 等數(shù)據(jù)庫分別收集到痛風性關節(jié)炎潛在靶點48、346 個，剔除重復46 個，共收集到348個痛風性關節(jié)炎相關靶點。

2.3 息痛散治療痛風性關節(jié)炎潛在靶點PPI網絡構建

為揭示息痛散對痛風性關節(jié)炎的作用機制，將預測的息痛散靶點的PPI 網絡和痛風性關節(jié)炎相關靶點的PPI 網絡合并起來。如圖1a 所示，該網絡由4 545 個節(jié)點和112 787條邊組成。根據(jù)以往的研究，以所有節(jié)點的2 倍中位度值為截斷（George 等，2019），構建1 個針對息痛散治療痛風性關節(jié)炎的子網絡，其中包含115 44 個節(jié)點和50 808 條邊（圖1b）。再根據(jù)BC、CC、EC、LAC 和NC 的中位的中位截斷值進一步篩選158個核心靶點（圖1c），即息痛散治療痛風性關節(jié)炎的核心靶基因。

圖1 息痛散與痛風性關節(jié)炎交集靶點的PPI網絡Fig.1 PPI network for the intersection targets of Xitongsan and gouty arthritis

最終將PPI 網絡導入Cytoscape 進行進一步分析。通過使用CytoHubba 得到1 個由10 個靶基因組成的關鍵子網絡（圖2），以用于后續(xù)分子對接。

圖2 息痛散治療痛風性關節(jié)炎交集靶點的關鍵子網絡Fig.2 Key sub-network of intersection targets for the treatment of gouty arthritis with Xitongsan

2.4 息痛散干預痛風性關節(jié)炎的GO 富集分析和KEGG通路注釋分析

利用R4.0.2 軟件的ClusterProfiler 包對158 個息痛散干預痛風性關節(jié)炎的潛在靶點進行GO 功能富集分析。在GO 功能富集過程中共得到440 條結果，包括BP（181項）、CC（40項）和MF（56項）。以P≤0.01為篩選條件，獲得56 個條目。依據(jù)count值大小篩選出涉及BP、CC 和MF 的前10 條富集結果，如圖3所示。在BP 方面，包括RNA 聚合酶II啟動子轉錄的正調控、炎癥反應、藥物反應、凋亡過程的調控、脂多糖的細胞反應、免疫應答、DNA 模板轉錄正調控、細胞增殖正調控等；在CC 中，包括胞漿、細胞核、細胞質、胞外間隙、胞外小體、質膜、線粒體、細胞膜等。而在MF 方面，涉及與蛋白質結合、蛋白質均聚活性、與酶結合、細胞因子活性、蛋白質異二聚活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白激酶活性等。

圖3 息痛散治療痛風性關節(jié)炎GO基因功能富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of Xitongsan in the treatment of gouty arthritis

對158 個潛在治療靶點進行KEGG 通路分析，結果顯示118 條（P<0.01）富集分析結果與息痛散治療痛風性關節(jié)炎的作用機制相關，選取P值較小的20條通路并通過繪制相應氣泡圖，如圖4所示，Y 軸代表代表通路名稱，X 軸代表所占百分比，氣泡面積代表通路富集基因數(shù)，氣泡顏色代表P 值的大小。158個治療靶點主要富集在PI3K/Akt 信號通路、肝炎病毒、TNF 信號途徑等發(fā)揮抑制炎癥反應、調節(jié)免疫的作用。

圖4 息痛散治療痛風性關節(jié)炎KEGG通路富集的氣泡圖Fig.4 KEGG enrichment bubble diagram of Xitongsan in the treatment of gouty arthritis

2.5 分子對接

選取PPI 網絡中排名前3 的靶蛋白（NTRK1、APP、TP53）與圖1中degree值前3的活性成分槲皮素（quercetin）、β - 谷甾醇（beta-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol），利用AutoDock Vina 軟件進行分子對接，結果見表2、圖5。從圖5可看到靶蛋白與分子的具體結合位點，黃色虛線為兩者之間的氫鍵作用力，這是促使分子結合到活性位點的主要作用力。

圖5 槲皮素和NTRK1（a）、APP（b）、TP53（c）的分子對接Fig.5 Molecular docking of quercetin with NTRK1(a),APP(b)and TP53(c)

表2 分子對接結果?G（kcal?mol-1）Tab.2 Molecular docking results ?G(kcal?mol-1)

2.6 息痛散對痛風性關節(jié)炎大鼠踝關節(jié)滑膜組織PI3K、p-Akt及mTOR蛋白表達的影響

由圖6可知，與空白對照組比較，模型對照組大鼠踝關節(jié)滑膜組織PI3K、p-Akt 及mTOR 蛋白表達水平明顯上調（P<0.05）。經息痛散和秋水仙堿干預后，與模型對照組比較，PI3K、p-Akt 及mTOR 蛋白表達水平顯著上調（P<0.05）。息痛散和秋水仙堿組之間差異無統(tǒng)計學意義。

圖6 息痛散對痛風性關節(jié)炎大鼠中踝關節(jié)滑膜組織PI3K、p-Akt及mTOR蛋白的影響Fig.6 Effects of Xitongsan on PI3K,p-Akt and mTOR proteins in synovial tissue of ankle joint in rats with gouty arthritis

3 討論

痛風性關節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹病”范疇［22］，主要與素體稟賦不足，或調攝不慎，長期嗜欲膏粱厚味，日久導致脾胃運化失常，濕熱內蘊有關，患者的癥狀往往呈現(xiàn)持續(xù)反復波動的特點。祖國醫(yī)學經過數(shù)千年的發(fā)展，在治療痛風方面有悠久的歷史和豐富的臨床經驗，尤其在臨床治療方面，效果肯定且毒副作用相對較少，在該病的治療中顯示出優(yōu)勢。因此，結合中醫(yī)理論，積極尋找開發(fā)抗痛風和改善炎癥作用的中草藥制劑具有重要的意義。

本研究共篩選出息痛散化合物936 個，活性成分146 個，潛在作用靶點2 129 個，通過PPI 與痛風性關節(jié)炎重合靶點158個，說明息痛散治療痛風性關節(jié)炎具有多成分、多靶點的特點。

通過篩選息痛散中的主要有效成分并構建成分與作用靶點互作網絡及藥物-化合物-作用靶點與痛風性關節(jié)炎互作網絡，根據(jù)主要活性成分的關聯(lián)度，明確核心化合物主要有槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、黃柏黃酮II、異鼠李素等，其中大部分化合物具有抗炎和調節(jié)免疫的作用。其中槲皮素度值最大，靶點數(shù)最多，槲皮素是一種廣泛存在于水果、蔬菜、植物中的黃酮類化合物，具有良好的抗炎和免疫調節(jié)等藥理學作用，據(jù)報道槲皮素等幾種黃酮可減少病毒誘導的噬菌斑和RNA 復制，而對宿主細胞的細胞毒性作用可忽略不計［23］。吳柳等［24］通過實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過上調PI3K/AKT/mTOR 通路降低膿毒癥小鼠心肌組織炎癥和氧化應激反應，從而減輕心肌損傷。此外國內學者亦指出槲皮素對多種細菌及病毒具有抑制作用，阻斷其進入細胞內，并對病毒的血凝素蛋白存在較高的親和力，從而抑制溶血反應，減少炎癥反應［25-26］。植物甾醇是一類具有天然生物活性的甾體化合物，曾被譽為“生命鑰匙”參與細胞內各種生命活動，其中含量最豐富的為β-谷甾醇、豆甾醇等。多項研究表明β-谷甾醇具有免疫調節(jié)、抗炎的作用［27］。Paniaguaperez 等［28］通過研究β-谷甾醇對小鼠胸膜炎、足腫脹、耳水腫、髓過氧化物酶活性的作用，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇作用后小鼠足腫脹、耳水腫被抑制70%以上，胸膜炎滲出液減少46%、中性粒細胞數(shù)減少32%，提示β-谷甾醇具抗炎作用。Liao等［29］發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可通過抑制巨噬細胞中炎癥小體NLRP3 的激活而抑制MAPK 信號通路的活化，導致細胞中的TNF-α、IL-6、IL-8 等炎癥因子生成顯著減少，從而起到抗炎作用。國外學者發(fā)現(xiàn)富含β-谷甾醇的西班牙飼料添加劑可使豬外周血單核細胞數(shù)量增加，樹突狀細胞激活，進而調節(jié)免疫反應［30］。此外豆甾醇［31］、山奈酚［32］、異鼠李素［33］作為息痛散的有效成分，可通過抑制體內補體系統(tǒng)的激活而發(fā)揮抗炎作用。由上可知，息痛散中篩選出的活性化合物主要有免疫調節(jié)、抗炎等作用，因此可能對痛風性關節(jié)炎病毒引發(fā)的炎癥反應有一定干預效應。

通過Cytoscape3.7.2軟件構建息痛散治療痛風性關節(jié)炎的PPI網絡，發(fā)現(xiàn)其關鍵靶點為NTRK1、APP、TP53、CUL3、CDK2、MCM2、XPO1、ESR1、UBC、EGFR、TNF、IL6、TP53、ALB、MAPK3。大致可分為3 類，即炎癥因子、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）及其他。炎癥因子主要有TNF、IL-6、IL-10、CXCL8、IL1B、趨化因子2（CCL2）等。研究表明痛風性關節(jié)炎患者在初期血清中多種相關細胞因子升高，包括IL-1、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10 及TNF-α 等［34］。此外，相比輕癥患者，重癥患者血漿中IL-2、IL-7、IL-10、GCSF、IP10、MCP1、MIP1A 和TNF-α 等相關細胞因子升高［35］。國內學者觀察到痛風性關節(jié)炎患者體內亦出現(xiàn)了IL-6、TNF-α、TNF-γ 等細胞因子顯著升高，IL-6、TNF-α細胞因子拮抗劑等具有治療潛力［36-37］。

現(xiàn)代藥理研究表明息痛散中的蒼術［38］、黃柏［39］、忍冬藤［40］中的相關化學成分可通過減少TNF-α 和白介素的產生和釋放，下調TNF-α/IL 對機體的炎癥反應，發(fā)揮對組織的保護作用。caspase-3 在細胞凋亡中起著不可替代的作用，一般認為caspase-3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶。研究表明槲皮素可降低炎癥小鼠模型caspase-3 水平，緩解炎癥所致病理學改變。MAPK1、MAPK8 和MAPK14 屬于MAPK 家族，涉及MAPK 信號通路中2 條途徑，均遵循3 級酶促級聯(lián)反應，在細胞因子、神經遞質等激活后具有調節(jié)細胞炎癥反應、腫瘤細胞增殖與分化的作用［41］。

GO功能富集分析得到GO條目440個（P<0.01），KEGG 通路富集分析篩選得到118 條（P<0.01）信號通路。GO 富集涉及調節(jié)炎癥反應、免疫應答、藥物反應及細胞凋亡等生物學過程。KEGG 通路富集分析顯示在靶點富集中多數(shù)通路與炎癥相關，包括乙型肝炎、百日咳、利什曼病、丙型肝炎等，預示著息痛散通過作用于相關靶點抗炎，從而達到治療痛風性關節(jié)炎的效果。GO 和KEGG 富集分析的結果主要集中于感染，并涉及TNF 信號通路、PI3K-Akt信號通路、HIF-1 信號通路以及T 細胞受體信號通路等。腫瘤壞死因子（TNF）家族的受體和配體在免疫應答過程中控制淋巴細胞激活和存活中起重要作用。特定TNF 受體（TNFR）家族成員在抗炎免疫中的作用取決于免疫反應的階段，并且可能隨炎癥類型而變化。炎癥過程中在CD8（+）T 細胞上突出表達的TNFR 家族的4 個成員，即4-1BB（CD137）、CD27、OX40（CD134）、GITR，在炎癥初期有促進CD8（+）T 細胞增殖的作用，因而產生大量的促炎因子，從而導致急性損傷［42-43］。Toll 樣受體位于NF-κB 通路上游，研究表明TLR1、TLR2、TLR4 和TLR7 與炎癥的發(fā)病機制有關［44］。

PI3K/Akt 通路是參與調節(jié)機體炎癥、壞死及凋亡等的重要信號通路［45］。本研究結果表明：模型組大鼠踝關節(jié)滑膜組織中PI3K、p-Akt、mTOR蛋白水平顯著增加，進而促進大量的炎性細胞因子表達，產生炎癥級聯(lián)反應。給予息痛散治療后，可顯著降低PI3K、p-Akt、mTOR 蛋白的表達，表明息痛散可下調PI3K/Akt信號通路，進而抑制下游炎癥因子的表達。

痛風性關節(jié)炎發(fā)病率正在逐年升高，但治療缺乏理想藥物。目前臨床使用的西藥治療此類疾病不良反應明顯且價格昂貴。近年來，運用傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，充分發(fā)揮中醫(yī)藥的獨特優(yōu)勢，積極尋找有效治療痛風性關節(jié)炎的中藥制劑［46］。息痛散中所含的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山奈酚、黃柏黃酮II、異鼠李素可能是其治療痛風性關節(jié)炎的主要活性成分，作用靶點為NTRK1、APP、TP53、CUL3、CDK2、MCM2、XPO1、ESR1、UBC、EGFR、TNF、IL6、TP53、ALB、MAPK3 等。功效涉及的信號通路包括PI3K/Akt 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等。本研究通過網絡藥理學、分子對接和基礎實驗相結合的方法，確認息痛散治療痛風性關節(jié)炎的活性成分、關鍵靶點和信號通路，并基于Western Blot 手段進行初步驗證。本研究為息痛散治療痛風性關節(jié)炎機制研究提供了理論依據(jù)和線索，為息痛散的臨床用藥及本課題組后續(xù)深入的研究提供重要理論依據(jù)和方向，其預測結果還待進一步實驗驗證。