基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探析健脾丸治療慢性胃炎的作用機(jī)制

盧啟明，胡小英

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣東廣州 510405

前言

慢性胃炎是有害因子長(zhǎng)期反復(fù)作用于胃黏膜引起損傷的結(jié)果［1］，隨著年齡的增加，慢性胃炎的患病率逐漸上升［2］，目前，我國(guó)基于內(nèi)鏡診斷的慢性胃炎患病率接近90%［3］。慢性胃炎屬于中醫(yī)“胃痛”、“痞滿(mǎn)”、“呃逆”等范疇［4］，中醫(yī)治療慢性胃炎有一定的療效［5-9］，臨床上具有廣闊的前景。健脾丸出自《醫(yī)方集解》中“消導(dǎo)之劑”，由白術(shù)、陳皮、麥芽、山楂、太子參、枳實(shí)組成，具有健脾和胃，消積導(dǎo)滯之功，主治“脾虛血弱、飲食不消”。在臨床上運(yùn)用此方進(jìn)行加減治療慢性胃炎具有較好療效［10］，然而其作用機(jī)制尚不明確，且傳統(tǒng)的研究方法難以全面闡述中藥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療疾病的作用機(jī)制。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)分析健脾丸治療慢性胃炎的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)并為后期實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 健脾丸藥物的成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

本研究首先通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）（http://tcmspw. com/tcmsp. php）以“Herb name”為檢索詞分別檢索白術(shù)、陳皮、麥芽、太子參、枳實(shí)的有效化學(xué)成分。根據(jù)成分毒藥動(dòng)力學(xué)（ADME）中的參數(shù)進(jìn)行篩選，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（Drug Likeness, DL）≥0.18 為基準(zhǔn)，篩選出對(duì)應(yīng)中藥材的主要活性成分，并對(duì)主要活性成分進(jìn)行靶蛋白預(yù)測(cè)，通過(guò)Universal Protein 數(shù)據(jù)庫(kù)（UniProt）（https://www.uniprot.org/）將靶蛋白轉(zhuǎn)換成與之對(duì)應(yīng)的靶基因。通過(guò)化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)［11］（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）檢索與山楂相關(guān)的化學(xué)成分，利用其CAS 號(hào)在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載結(jié)構(gòu)文件，將對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)（http://www.swissadme.ch/）并運(yùn)行，根據(jù)成分毒藥動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行篩選，以Pharmacokinetics 中GI absorption 結(jié)果為High，并且Druglikeness 中的 Ghose、Egan、Veber、Lipinski、Muegge 存在3 項(xiàng)或以上結(jié)果為“Yes”作為基準(zhǔn)，篩選出關(guān)于健脾丸組方之一的山楂的主要活性成分，在SwissTargetPrediction平臺(tái)（http://www.swisstargetprediction.ch/）中導(dǎo)入結(jié)構(gòu)文件進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。最后將配對(duì)好的成分、靶基因一起導(dǎo)入Cytoscape（3.7.2）軟件中，構(gòu)建健脾丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析。

1.2 慢性胃炎靶標(biāo)基因的檢索

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. genecards.org/）中輸入“chronic gastritis”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，選擇“export to excel”選項(xiàng)將靶標(biāo)基因?qū)С鰹镋xcel格式，選取Relevance score≥中位數(shù)的靶標(biāo)基因，獲得慢性胃炎的主要靶標(biāo)基因。

1.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

將健脾丸的靶基因?qū)隨TRING 平臺(tái)（https://string-db.org/），構(gòu)建健脾丸各個(gè)靶點(diǎn)間相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（Protein Protein Interaction network，PPI network）。將慢性胃炎的靶標(biāo)基因?qū)隨TRING 平臺(tái)，構(gòu)建慢性胃炎靶點(diǎn)PPI network。將健脾丸和慢性胃炎的PPI network 導(dǎo)入Cytoscape 軟件處理分析并取交集，得到健脾丸治療慢性胃炎核心靶點(diǎn)的PPI network。

1.4 KEGG 通路的富集分析以及構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)

將篩選出來(lái)的健脾丸的核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺(tái)（https://metascape.org/），選擇KEGG 富集分析（P<0.01），結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，選擇與慢性胃炎可能存在聯(lián)系的通路，將存在關(guān)聯(lián)性的成分以及靶點(diǎn)一起導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，構(gòu)建出健脾丸治療慢性胃炎的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。

1.5 分子對(duì)接

利用Cytoscape 軟件對(duì)健脾丸的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，從而篩選出其中的關(guān)鍵活性成分，利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載化合物3D 結(jié)構(gòu)文件，通過(guò)Openbable 軟件將其轉(zhuǎn)化為.pdb 格式，未能檢索到相應(yīng)3D 結(jié)構(gòu)的活性成分則依據(jù)2D 結(jié)構(gòu)，利用ChemDraw 軟件得到對(duì)應(yīng)的3D 結(jié)構(gòu)，通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）下載已驗(yàn)證的與慢性胃炎相關(guān)的BBC3、IL-17A［12-15］的蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入分子對(duì)接軟件Autodock Vina 中，操作健脾丸關(guān)鍵活性成分的結(jié)構(gòu)分子與BBC3、IL-17A 分子對(duì)接，得到多個(gè)構(gòu)象，將其中結(jié)合能絕對(duì)值最高的構(gòu)象導(dǎo)入Pymol 軟件中進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 健脾丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)平臺(tái)、化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)及SwissADME 平臺(tái)篩選出健脾丸的主要成分，通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)及SwissTargetPrediction 平臺(tái)對(duì)主要成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，剔除冗余的成分，得到主要活性成分共56 個(gè)，見(jiàn)表1。將成分、靶基因?qū)隒ytoscape軟件，構(gòu)建健脾丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1，通過(guò)Cytoscape 軟件對(duì)健脾丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，該網(wǎng)絡(luò)中共有465個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 090條邊，以Degree≥6倍中位數(shù)，篩選出共健脾丸的7 種關(guān)鍵活性成分，分別是12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol、Obacunone（黃柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表兒茶素）、luteolin( 木犀草素)、naringenin（柚皮素）、betasitosterol（beta-谷甾醇）。

圖1 健脾丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Component-target network diagram of Jianpiwan

表1 健脾丸主要活性成分Tab.1 Main active components of Jianpiwan

2.2 慢性胃炎靶標(biāo)基因及數(shù)據(jù)處理

通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“chronic gastritis”，共檢索到1 095 個(gè)靶點(diǎn)，根據(jù)“Relevance score”進(jìn)行排序，以Relevance score≥中位數(shù)選取靶標(biāo)基因共553個(gè)，部分基因見(jiàn)表2。

表2 慢性胃炎部分基因Tab.2 Partial genes of chronic gastritis

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點(diǎn)

通過(guò)STRING 平臺(tái)分別構(gòu)建健脾丸靶點(diǎn)PPI network 和慢性胃炎靶標(biāo)基因PPI network，導(dǎo)入Cytoscape 軟件利用“Merge”功能對(duì)兩個(gè)PPI network取交集，得到健脾丸治療慢性胃炎核心靶點(diǎn)的PPI network 并進(jìn)行分析，慢性胃炎核心靶點(diǎn)的PPI network 中共有節(jié)點(diǎn)88 個(gè)，邊1 372 條，見(jiàn)圖2。圖中靶點(diǎn)由小到大表示Degree 值由小變大，即該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相互作用的機(jī)會(huì)越多，邊由細(xì)到粗表示Combined score 由小變大，即靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系越強(qiáng)。

圖2 健脾丸治療慢性胃炎核心靶點(diǎn)Fig.2 Core targets of Jianpiwan in treating chronic gastritis

2.4 KEGG通路富集分析及構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

運(yùn)用Metascape 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)對(duì)健脾丸治療慢性胃炎的88 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 富集分析，得到KEGG 相關(guān)通路共295 條，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，與慢性胃炎相關(guān)的通路主要有17 條，使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）富集氣泡圖對(duì)17 條主要通路進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到圖3，圖中縱軸代表KEGG 分析的通路，橫軸代表每個(gè)通路的富集程度，點(diǎn)的大小代表88 個(gè)核心靶點(diǎn)中富集到該通路的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)，點(diǎn)的顏色由綠色到紅色代表P值由大到小。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，健脾丸治療慢性胃炎的關(guān)鍵信號(hào)通路主要是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、幽門(mén)螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、Th17細(xì)胞分化，提示健脾丸是通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路而起到治療慢性胃炎的效果，這也體現(xiàn)了中醫(yī)治療疾病的整體觀(guān)念。將篩選出的7 種關(guān)鍵活性成分、10 條關(guān)鍵信號(hào)通路及這些通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建健脾丸治療慢性胃炎的關(guān)鍵成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖4。

圖3 KEGG富集氣泡圖Fig.3 KEGG enrichment bubble diagram

圖4 健脾丸治療慢性胃炎的關(guān)鍵成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Key component-target-pathway network diagram of Jianpiwan in treating chronic gastritis

2.5 分子對(duì)接

利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載健脾丸Obacunone（黃柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表兒茶素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）、betasitosterol（beta- 谷甾醇）的化合物結(jié)構(gòu)，使用Openbable 軟件將化合物結(jié)構(gòu)信息轉(zhuǎn)化為.pdb 格式，利用ChemDraw 軟件畫(huà)出12-senecioyl-2E,8E,10Eatractylentriol的結(jié)構(gòu)，以.pdb 格式輸出。將關(guān)鍵活性成分的蛋白結(jié)構(gòu)與BBC3、IL-17A 的蛋白結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Autodock Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，將結(jié)合能絕對(duì)值最高的構(gòu)象導(dǎo)入Pymol軟件進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見(jiàn)表3和圖5。圖5中紫色條狀物為蛋白質(zhì)，綠色棍狀物為關(guān)鍵活性成分，淺藍(lán)色棍狀物為蛋白質(zhì)與關(guān)鍵活性成分相結(jié)合的結(jié)構(gòu)，黃色虛線(xiàn)為結(jié)合鍵，深藍(lán)色球狀物為水分子。

圖5 健脾丸部分關(guān)鍵活性成分與BBC3、IL-17A分子對(duì)接圖Fig.5 Molecular docking diagram of some core active components of Jianpiwan with BBC3 and IL-17A

表3 健脾丸關(guān)鍵活性成分與BBC3、IL-17A分子對(duì)接結(jié)合能（kcal?mol-1）Tab.3 Molecular docking binding energy of core active components of Jianpiwan with BBC3 and IL-17A(kcal?mol-1)

3 討論

本研究根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論及分子對(duì)接技術(shù)，聯(lián)合多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用數(shù)據(jù)分析、高通量篩選、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析等技術(shù)，對(duì)健脾丸治療慢性胃炎多成分、多靶點(diǎn)、多途徑進(jìn)行科學(xué)有效的預(yù)測(cè)及分析，探討健脾丸治療慢性胃炎的作用機(jī)制。

根據(jù)健脾丸成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，健脾丸的主要活性成分共 56 個(gè)，其中 12-senecioyl-2E, 8E, 10Eatractylentriol、Obacunone（黃柏酮）、quercetin（槲皮素）、epicatechin（表兒茶素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）的Degree 值最高，并且通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)，均對(duì)慢性胃炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白具有較好的親和力。其中，木犀草素、柚皮素、黃柏酮、槲皮素、beta-谷甾醇均可通過(guò)多個(gè)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，能夠不同程度地抑制慢性胃炎的進(jìn)展，特別是慢性萎縮性胃炎向胃癌的進(jìn)一步惡化，并且可以通過(guò)多個(gè)途徑抑制癌細(xì)胞［16-22］。如Pu 等［23］和Lu 等［24］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞中木草犀素可以通過(guò)AKT、ERK、P13K 和p38等多個(gè)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)一系列miRNAs 表達(dá)，表明其具有作為人類(lèi)胃癌治療藥物的潛力。有研究指出黃柏酮和柚皮素還具有抗炎作用，并且柚皮素還能在一定程度上緩解炎癥引起的疼痛，另外，黃柏酮還具有調(diào)節(jié)消化道微生物群的作用，并能抵抗某些消化道病毒［25-28］。槲皮素除了可以調(diào)節(jié)胃細(xì)胞的增殖和凋亡的平衡，還可以保護(hù)胃上皮細(xì)胞免受氯化物的損傷并調(diào)節(jié)胃平滑肌舒張功能，因此在治療慢性胃炎和功能性胃消化不良及其他輕微胃肌肉運(yùn)動(dòng)障礙方面均具有潛在的價(jià)值［29-30］。Rozza等［31］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)表兒茶素可以加強(qiáng)胃黏膜屏障，并能一定程度地中和胃液，從而起到保護(hù)胃黏膜的作用。

在健脾丸治療慢性胃炎核心靶點(diǎn)PPI network中，Degree 值最高的3 個(gè)靶點(diǎn)分別是IL-6、VEGFA、TP53，為潛在的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。IL-6 是機(jī)體炎癥反應(yīng)急性期的誘導(dǎo)成分之一，對(duì)B細(xì)胞的分化以及輔助T 細(xì)胞的發(fā)育均必不可少［32］。在幽門(mén)螺旋桿菌感染的慢性胃炎患者中，機(jī)體受到幽門(mén)螺旋桿菌的刺激后可促使IL-6 基因表達(dá)，并且其表達(dá)水平與慢性胃炎的分級(jí)具有相關(guān)性［33-34］。VEGFA 是一種具有重要促血管生成活性的因子，通過(guò)維護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)，可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮張力，維持血管的正常功能［35］。VEGFA 具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡等作用。陳聰英等［36］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)VEGFA 在健康人、胃炎患者、胃潰瘍患者和胃癌患者的陽(yáng)性表達(dá)率分別為37.6%、52.38%、78.33%、90.38%（P<0.05），可見(jiàn)VEGFA 的表達(dá)水與胃相關(guān)疾病的進(jìn)展具有較大的相關(guān)性。TP53分子是迄今為止在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最重要的抑癌基因，根據(jù)機(jī)體的生理情況而產(chǎn)生不同功能。當(dāng)細(xì)胞處于正常狀態(tài)時(shí)，TP53蛋白不干擾正常細(xì)胞運(yùn)行；當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，TP53蛋白降解被阻斷，TP53水平升高，迅速激活并啟動(dòng)對(duì)細(xì)胞的修復(fù)功能；當(dāng)細(xì)胞DNA 損傷嚴(yán)重而不能完全修復(fù)時(shí)，TP53 蛋白將抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促使其凋亡［37］。有報(bào)道指出在胃癌發(fā)展早期，TP53的改變就發(fā)生了，甚至可能在非腫瘤性黏膜病變中也存在，并且其改變的頻率隨著疾病進(jìn)展逐漸增加［38］。

通過(guò)富集分析及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，健脾丸治療慢性胃炎的關(guān)鍵信號(hào)通路主要有細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、C 型凝集素受體信號(hào)通路等多個(gè)通路。其中，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路排第一。細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的死亡過(guò)程［39］，通過(guò)基因編程消除受損或多余的細(xì)胞，以獲得更大利益，是在多細(xì)胞生物中常規(guī)進(jìn)行的正常生理過(guò)程［40］。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的信號(hào)通過(guò)多個(gè)途徑傳遞，最終促使負(fù)責(zé)細(xì)胞壞死的半胱天冬酶激活而發(fā)揮作用［41］。慢性萎縮性胃炎的發(fā)展過(guò)程中就會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的顯著增加，由Fas 和Fas 配體相互作用引起胃腺細(xì)胞凋亡［42］。也有報(bào)道指出，IL-17A 在此過(guò)程中起主要作用，促進(jìn)胃壁細(xì)胞的凋亡進(jìn)而引起胃黏膜的萎縮［43］。研究顯示在正常的胃黏膜中，被覆上皮和腺上皮僅檢測(cè)到少量的凋亡細(xì)胞，而在幽門(mén)螺旋桿菌胃炎的胃竇和胃體的被覆上皮以及胃竇的腺上皮中凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增高，在其胃體的腺上皮中，凋亡細(xì)胞的數(shù)量再次增加［44］，這說(shuō)明胃黏膜細(xì)胞的缺失與細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)傳導(dǎo)涉及NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPK 等多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途經(jīng)的激活，從而促使NF-κB 激活。有研究指出將年齡作為一個(gè)因素，可能通過(guò)AGE/RAGE/NF-κB 通路下調(diào)平滑肌收縮蛋白的表達(dá)，從而導(dǎo)致胃動(dòng)力障礙［45］。C型凝集素受體信號(hào)通路是由C 型凝集素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，C 型凝集素受體是一個(gè)大型蛋白質(zhì)家族，當(dāng)其與配體結(jié)合后，刺激細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子及趨化因子產(chǎn)生，介導(dǎo)先天性及適應(yīng)性免疫。但在幽門(mén)螺旋桿菌感染患者中，幽門(mén)螺旋桿菌的代謝產(chǎn)物可以通過(guò)C 型凝集素受體信號(hào)通路進(jìn)一步加重胃炎［46］。此外，通過(guò)KEGG 富集分析還提示PI3K-Akt 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路等多個(gè)通路均與慢性胃炎有一定聯(lián)系，這也體現(xiàn)了中醫(yī)是從整體觀(guān)出發(fā)，通過(guò)多個(gè)途徑而達(dá)到治病的目的。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)健脾丸治療慢性胃炎的多個(gè)成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多條通路及其之間的相互關(guān)系及作用進(jìn)行分析，然而考慮到本研究主要依托網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，并且研究過(guò)程中尚未考慮到藥物的劑量、劑型、煎煮、服用方法等問(wèn)題，本研究仍處于理論探討水平，需進(jìn)一步行實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)進(jìn)一步論證。