苦木注射液成分抑制SARS-CoV-2的研究*

趙廣健， 翟德設(shè)， 于日磊,2,3， 李以諾， 李 儷,2,3， 徐錫明,2,3， 初燕燕,2,3**

(1．中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003； 2．青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3．青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東 青島 266100； 4．廣東萬(wàn)年青制藥有限公司，廣東 汕頭 515064)

冠狀病毒(Coronavirus)是有包膜的線形正義單鏈 RNA病毒，可引起多種動(dòng)物的多系統(tǒng)感染，引起呼吸道、腸道、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。2019年12月，一種感染人類的新型冠狀病毒肆虐中國(guó)乃至全世界，目前認(rèn)為其主要傳播途徑為飛沫傳播，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將其命名為SARS-CoV-2，世界衛(wèi)生組織(WHO)將SARS-CoV-2引起嚴(yán)重的嚴(yán)重急性呼吸性肺炎命名為“COVID-19”(Corona Virus Disease 2019)[1]，感染者早期表現(xiàn)為急性呼吸道感染癥狀，一些迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、急性呼吸衰竭等。SARS-CoV-2較2002年的SARS冠狀病毒具有潛伏期長(zhǎng)、傳播速度更快、傳染性更強(qiáng)的特點(diǎn)[2]。

在感染過(guò)程中，冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的棘突蛋白(Spike蛋白)參與病毒和宿主細(xì)胞融合，宿主細(xì)胞蛋白酶可以將其分裂為S1和S2亞基，S1含有一個(gè)保守的受體結(jié)合域(RBD)，可與宿主細(xì)胞上的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2 (ACE2)結(jié)合，S2具有與細(xì)胞膜融合的活性[3-5]。SARS-CoV-2的棘突蛋白具有更加特異性的弗林蛋白酶(furin)裂解位點(diǎn)，這可能是其傳染力更強(qiáng)的原因之一[3]。病毒融合后，其復(fù)制主要由病毒的主要蛋白酶(Mpro，也稱3CLpro蛋白)控制[6-7]。病毒的另一個(gè)蛋白酶—木瓜樣蛋白酶(PLpro)，也在病毒復(fù)制中起關(guān)鍵作用，并可穩(wěn)定病毒和細(xì)胞的結(jié)合[8]，幫助冠狀病毒逃避宿主的先天免疫反應(yīng)[9]。冠狀病毒具有復(fù)雜的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1-16)結(jié)構(gòu)，如RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)，RdRp以單鏈RNA為模板合成互補(bǔ)RNA鏈，在病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起到了必不可少的作用[10]；nsp3具有二磷酸腺苷-核糖-1”-單磷酸酶(ADP-ribose-1″ -mono-phosphatase, ADRP)結(jié)構(gòu)域(亦稱X結(jié)構(gòu)域)，該結(jié)構(gòu)域是冠狀病毒特有的，并且介導(dǎo)ADRP活性的活性位點(diǎn)和底物結(jié)合區(qū)在序列上具有高度保守性[11]；nsp16是一個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶，可使mRNA甲基化來(lái)增加病毒mRNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，對(duì)于病毒蛋白的翻譯至關(guān)重要。研究表明，一些病毒的nsp16，如流行性腹瀉病毒，還有降低人體免疫力，促進(jìn)病毒增殖的作用[12]。無(wú)論是與病毒融合相關(guān)的棘突蛋白和ACE2受體，還是與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的Mpro、Plpro、RdRp、X結(jié)構(gòu)域和nsp16均是抗SARS-CoV-2的重要靶點(diǎn)。為了快速尋找抗SARS-CoV-2藥物，傳統(tǒng)中藥成為藥物研發(fā)工作者們的焦點(diǎn)。

苦木為常用中藥材，首載于《中國(guó)藥典》1977年版(除1985年版未收載外)，歷版藥典均有收載。苦木性寒昧苦，歸肺、大腸經(jīng)，具有清熱祛濕、解毒消腫的功效，用于治療風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛等。苦木的藥用部位為苦木科植物苦木(PicrasmaquassioidesBennet)的干燥枝葉，其主要化學(xué)成分為生物堿，β-咔巴啉類和鐵屎米酮類，還有苦木內(nèi)酯(苦味素)類、三萜和黃酮類等。藥理學(xué)研究表明萜類化合物具有抗HIV病毒活[13-14]，苦木內(nèi)酯類具有抗腫瘤[15-17]、抗炎[18-19]、抗寄生蟲[20]、抗病毒[21]等活性?？嗄镜目寡?、抗病毒作用在臨床上已有廣泛應(yīng)用，如苦木注射液被用于感冒、上呼吸道感染，療效確切，安全性高[22-23]。

為了尋找有效的抗新型冠狀病毒藥物，本文收集了廣東萬(wàn)年青制藥有限公司提供的苦木注射液(上市批準(zhǔn)號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z44021192)的主要化合物組分，并通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬探索了各主要成分與新型冠狀病毒7個(gè)靶點(diǎn)的相互作用，模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn)有5個(gè)化合物具有較好的抗SARS-CoV-2靶點(diǎn)的能力，或可用于進(jìn)一步開發(fā)為抗SARS-CoV-2藥物。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 化合物的準(zhǔn)備

根據(jù)廣東萬(wàn)年青制藥有限公司提供的化合物結(jié)構(gòu)(見圖1)，采用Schr?dinger2019軟件包的ligprep模塊將小分子化合物轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)。在OPLS3力場(chǎng)下，為小分子化合物加上氫和電荷，用Epik軟件預(yù)測(cè)化合物在pH為7.0時(shí)的質(zhì)子化狀態(tài)。

1.2 靶點(diǎn)的準(zhǔn)備

從青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的2019-nCoV藥物靶標(biāo)結(jié)構(gòu)信息共享平臺(tái)(http://ncovtarget.qnlm.ac/web/mg/hm)中下載相應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，靶點(diǎn)分子的預(yù)處理則用Protein Preparation Wizard進(jìn)行。為靶標(biāo)分子加上氫和電荷后，刪除不必要的水分子，氨基酸的質(zhì)子化狀態(tài)用PROPKA軟件預(yù)測(cè)。在OPLS3力場(chǎng)下，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化。

1.3 分子對(duì)接與自由能計(jì)算

用Glide軟件進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接過(guò)程選用標(biāo)準(zhǔn)精度(SP)，每個(gè)小分子最終保留3個(gè)優(yōu)勢(shì)構(gòu)象用于結(jié)合自由能計(jì)算。靶標(biāo)與小分子的結(jié)合自由能用Prime的MMGBSA方法進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算過(guò)程中設(shè)定結(jié)合口袋周圍4 ?范圍內(nèi)的氨基酸為柔性。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的準(zhǔn)備

本次收集到苦木化合物28個(gè)，結(jié)構(gòu)主要為β-咔巴啉類和鐵屎米酮類(見圖1)。對(duì)于手性不明確的化合物，我們考慮了其所有可能的手性狀態(tài)，共計(jì)生成41個(gè)化合物三維結(jié)構(gòu)。

圖1 苦木注射液的主要化合物成分

2.2 對(duì)接結(jié)果打分和結(jié)合自由能

通過(guò)Glide軟件將化合物分別對(duì)接到7個(gè)抗冠狀病毒靶點(diǎn)的結(jié)合口袋中?？紤]到蛋白質(zhì)的柔性，計(jì)算各化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合自由能時(shí)，使結(jié)合口袋周圍4 ?內(nèi)的氨基酸側(cè)鏈為柔性。由于RdRp為金屬蛋白，化合物與RdRp的結(jié)合主要為配位相互作用，而結(jié)合自由能主要考慮的是非鍵相互作用，因此，本研究中沒(méi)有計(jì)算RdRp與化合物的結(jié)合自由能。對(duì)接結(jié)果表明，所研究的化合物均不能與Spike蛋白較好的結(jié)合，對(duì)接打分(S)值普遍高(>-4)，因此，本研究沒(méi)有計(jì)算該靶點(diǎn)與化合物的結(jié)合自由能(ΔG, kcal/mol)。通過(guò)該研究，我們發(fā)現(xiàn)了5個(gè)苦木組分KM-5、KM-16、KM-17、KM-19和KM-27具有結(jié)合Mpro、PLpro、X結(jié)構(gòu)域以及ACE2中的一個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)的作用，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與RdRp、Spike蛋白和nsp16結(jié)合較好的組分(見表1)。同時(shí)用MolAICal (https://molaical.github.io/)預(yù)測(cè)了化合物PAINS，結(jié)果表明所有化合物均沒(méi)有PAINS問(wèn)題。

從表1可以看出，KM-27和KM-5具有強(qiáng)X結(jié)構(gòu)域結(jié)合能力，其對(duì)接打分分別為-7.94和-7.01，結(jié)合自由能分別為-64.67和-51.93。KM-16和KM-17也可以與X結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其結(jié)合自由能分別為-44.38和-45.96，較KM-27的結(jié)合強(qiáng)度要弱很多。KM-27與X結(jié)構(gòu)域的結(jié)合是所有化合物中最強(qiáng)的，母核上的酚羥基作為氫鍵受體和SER156的主鏈氨基上的氫形成一條氫鍵，同時(shí)作為氫鍵供體和ASN155的支鏈羰基形成一條氫鍵，母核上的醇羥基和LEU125形成一條氫鍵，支鏈上的酚羥基作為氫鍵受體和ASN155形成一條氫鍵，作為氫鍵供體和ASP21形成一條氫鍵，支鏈上的甲氧基作為氫鍵受體和ALA22形成一條氫鍵；母核與支鏈分別與PRO124、ILE48存在疏水作用(見圖2(A))。KM-5在X結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)與KM-27的不同，KM-5主要通過(guò)羧基與ALA49、GLY45的主鏈氨基形成氫鍵，KM-5還通過(guò)兩個(gè)甲氧基和酚羥基作為氫鍵受體與SER127、GLY129和ILE130的主鏈氨基形成氫鍵，脂肪鏈上的羥基作為氫鍵受體ASN39的支鏈氨基形成一條氫鍵；芳香環(huán)與ALA37、ILE130和PHE131形成疏水相互作用。這些有利的相互作用使KM-5可以與X結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合。

表1 苦木注射液中化合物的分子對(duì)接和結(jié)合自由能計(jì)算結(jié)果

(藍(lán)色實(shí)線代表氫鍵，灰色虛線表示疏水相互作用。The blue solid lines represent hydrogen bonds, the gray dotted lines represent hydrophobic interactions．)

除了結(jié)合X結(jié)構(gòu)域，KM-27還表現(xiàn)出最強(qiáng)的Mpro和PLpro結(jié)合作用，其結(jié)合自由能分別為-51.17和-49.53，并對(duì)ACE2有弱結(jié)合能力。KM-16、KM-17和KM-19也具有良好的PLpro結(jié)合能力，結(jié)合自由能分別為-44.61、-43.25和-45.97。其中KM-17和KM-19對(duì)Mpro有良好的結(jié)合能力，結(jié)合自由能分別為 -48.11和-42.84。KM-27對(duì)多靶點(diǎn)均表現(xiàn)出優(yōu)異的結(jié)合能力可能是源于其具有3個(gè)手性中心，具有更大的化學(xué)空間。分別選取KM-27與Mpro和PLpro結(jié)合最佳的消旋體化合物進(jìn)行結(jié)合模式分析，發(fā)現(xiàn)KM-27與Mpro和PLpro均具有較好的相互作用。母核上的酚羥基作為氫鍵受體與供體與Mpro的GLU166主鏈氨基與羰基分別形成一條氫鍵；母核上的兩個(gè)醇羥基作為氫鍵受體分別與HIS41、TYR54形成一條氫鍵；支鏈上的酚羥基作為氫鍵供體和LEU141形成一條氫鍵，作為氫鍵受體和SER144形成一條氫鍵；支鏈上的甲氧基作為氫鍵受體和GLY143主鏈氨基形成氫鍵作用；母核芳香環(huán)與MET165、GLN189產(chǎn)生疏水作用(見圖3(A))。KM-27母核上的一個(gè)醇羥基作為氫鍵受體與PLpro的ASP165、ARG167分別形成一條氫鍵，另一個(gè)酚羥基作為氫鍵受體與TYR274形成氫鍵，與ALA247形成水橋；支鏈上的甲氧基作為氫鍵受體與GLN270支鏈上的氨基形成氫鍵作用；母核芳香環(huán)與TYR269形成π-π相互作用，與TYR265、PRO249存在疏水作用；支鏈芳香環(huán)與TYR269、TYR265存在疏水作用；母核上的酚羥基與ASN268、TYR269形成水橋(見圖3(B))。

(藍(lán)色實(shí)線代表氫鍵，灰色虛線表示疏水相互作用，綠色虛線表示π-π相互作用，白色小球表示芳香環(huán)的中心或水橋的橋原子，白色實(shí)線表示水橋。The blue solid lines represent hydrogen bonds, the gray dotted lines represent hydrophobic interactions, the green dotted line represents π-π interaction, and the white balls represent the center of aromatic rings or bridge atoms of the water bridges, and solid white lines represent the water bridges.)

KM-19除了與Mpro和PLpro結(jié)合外，可能與ACE2具有較好的結(jié)合，其結(jié)合自由能為-47.79。KM-19與ACE2的結(jié)合模式顯示，KM-19的并環(huán)與PHE274形成了良好的π-π相互作用，與THR445存在疏水作用，環(huán)外羰基作為氫鍵受體與ARG518形成一條氫鍵，羥基作為氫鍵受體和供體與ARG273形成兩條氫鍵作用(見圖4)。

(藍(lán)色實(shí)線代表氫鍵，灰色虛線表示疏水相互作用，綠色虛線表示π-π相互作用，白色小球表示芳香環(huán)的中心。The blue solid lines represent hydrogen bonds, the gray dotted line represents hydrophobic interactions, the green dotted lines represent π-π interactions, and the white balls represent the center of aromatic rings.)

4 結(jié)語(yǔ)

鑒于2019-CoV肆虐，苦木注射液是一種有效的抗流感病毒藥物，本研究旨在探討苦木注射液是否具有抗冠狀病毒的作用。我們尋找了28種苦木注射液中的化合物，通過(guò)分子對(duì)接和結(jié)合自由能計(jì)算，發(fā)現(xiàn)5個(gè)化學(xué)組分可以靶向抗冠狀病毒靶點(diǎn)Mpro、PLpro、X結(jié)構(gòu)域和ACE2中的一個(gè)或多個(gè)。篩選結(jié)果表明苦木注射液具有一定的抗冠狀病毒作用，這5個(gè)化學(xué)組分或可進(jìn)一步研究或開發(fā)為抗新型冠狀病毒藥物。