SETDB1在炎癥性腸病患者腸黏膜組織中的表達及臨床意義

王慧玲 趙靜 李剛

炎癥性腸病（Inflammatory bowel disease，IBD），主要包括克羅恩病（Crohn’s disease，CD）及潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC），是一種消化道的非特異性炎性病變，該病好發(fā)于15～30 歲的青壯年，病情遷延反復(fù)、難以治愈，致殘率高［1-2］，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，給患者家庭乃至社會帶來極大的經(jīng)濟負擔(dān)，已成為當(dāng)今國際消化學(xué)界的研究熱點和難點之一［3］。本研究前期研究顯示：腸黏膜屏障功能障礙可能是IBD 發(fā)病機制中的重要因素之一［4-5］。最近有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶1（SET domain bifurcated1，SETDBl）的缺失與腸道上皮細胞分化，屏障破壞，炎癥和死亡有關(guān)，SETDB1 的缺失會導(dǎo)致內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒沉默，DNA 損傷和腸上皮細胞死亡［6］。另有動物實驗證明，腸道干細胞中SETDB1 的丟失解除了對內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的抑制作用，不可逆轉(zhuǎn)地破壞了上皮屏障的穩(wěn)態(tài)，SETDB1 降低的小鼠可引起自發(fā)性終末回腸炎和結(jié)腸炎［7］。上述研究共同表明：SETDB1 可能在腸道上皮穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。但SETDB1 在IBD 患者中的具體表達及其與IBD 患者疾病活動度的關(guān)系，目前尚未見報道。本研究通過檢測SETDBl 的mRNA 及蛋白在IBD 患者腸黏膜組織中的表達情況，分析其與IBD患者疾病活動度的相關(guān)性，為IBD 的診療及IBD發(fā)病機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 IBD 患者標本的收集

收集河南省人民醫(yī)院2016年9月至2020年9月期間收治的門診及住院病例，分UC 組、CD 組和對照組（各50 例），并收集患者的相關(guān)炎癥指標。從IBD 病變活動部位取材，以健康體檢者的腸鏡活檢組織或單純結(jié)腸腺瘤患者肉眼和組織學(xué)表現(xiàn)均正常的結(jié)腸區(qū)域標本為對照，非炎癥部位腸黏膜（對照和IBD 患者）和炎癥部位腸黏膜（IBD 患者）各取4 塊組織；分別用于RNA，蛋白質(zhì)提取及石蠟包塊。本研究參與的患者均知情同意并簽署知情同意書，本實驗已通過院倫理委員會的審批。CD 和UC 的診斷參考之前的標準。CD 和UC疾病活動度分別以CD 活動指數(shù)CDAI 評分及UC活動指數(shù)Mayo 評分作為參考［8］。納入標準：①炎性腸病的診斷標準參考《炎性腸病診斷與治療的共識意見（2012年廣州）》中的標準［9］；②經(jīng)腸道鏡檢查、病理學(xué)活檢證實；排除標準：①惡性腫瘤；②腸道梗阻、穿孔；③嚴重出血、凝血功能障礙；④自身免疫性疾病；⑤其他腸道疾病。

1.2 主要試劑及儀器

RNA 提取試劑盒（DP440，天根生化，北京）；SETDB1 抗體（CST，美國），qRT-PCR 儀（ABI7500，美國）。 SETDB1 及內(nèi)參引物均由上海生工生物公司合成；SETDB1上游引物：5′-TCCTGTGAAGCCTGAAGGAC-3′，下游引物：5′-TTAGTTGATGGCAGGCACAC-3′；內(nèi) 參GAPDH 上游引物：5′-AAAATCAAGTGGGGCGATGC-3′，下游引物：5′-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3′。

1.3 Q-PCR 檢測

按照試劑盒說明書提取總的RNA，并檢測其濃度和純度，RNA 純度A260/A280在1.8～2.1 之間視為合格。逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃，30 min；94℃，2 min；循環(huán)次數(shù)1；RT-PCR 反應(yīng)：94℃，15 s；60℃，30 s；68℃，3 min；循環(huán)次數(shù)40。每個樣本重復(fù)3 個副孔。采用2-ΔΔCt法 計算SETDBI 的相對表達量。DAB 顯色；蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Image-Pro Plus 6 軟件分析每張照片中腸上皮細胞SETDBl 的平均光密度值，取5 張照片的平均值作為該病例腸上皮細胞中SETDB1 的平均光密度值。

1.4 Western Blotting

提取組織總蛋白和蛋白濃度的測定。按照BCA 蛋白測定試劑盒說明進行濃度檢測，分裝后保存于-80℃冰箱備用。按照所測蛋白濃度，計算含20 μg 蛋白的體積即為上樣量，100℃加熱3～5 min 后，煮完后即可上樣；80 V 等壓電泳30 min 后轉(zhuǎn)為120 V 繼續(xù)電泳1～2 h 至溴酚蘭到達分離膠的底部；電泳結(jié)束后，小心取出膠放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡20 min；TBST 洗3 次×5 min；加入二抗（1∶1 000 緩沖封閉液稀釋），搖床上室溫振蕩孵育1.5 h；TBST 洗3 次×5 min；化學(xué)發(fā)光、顯影。結(jié)果分析：膠片用EPSON 掃描儀掃描，F(xiàn)luorchemTM 8900 圖像分析軟件定量分析靶蛋白及內(nèi)參照GAPDH 條帶的含量，求其比值進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析；計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；用非參數(shù)相關(guān)的Spearman 秩相關(guān)系數(shù)（r）評估兩個變量之間的相關(guān)性；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SETDB1 的mRNA 及蛋白的表達結(jié)果

SETDB1的mRNA 在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量分別為：（2.54±1.33）、（2.88±1.25），均低于正常對照組（3.74±1.88），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；SETDB1 的蛋白在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量分別為：（0.37±0.03）、（0.37±0.05），均低于正常對照組（0.69±0.08），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 SETDB1 的免疫組化表達結(jié)果

SETDBI 在CD 及UC 患者腸黏膜組織標本中的相對表達量的IOD 評分分別為：（18±5.1）×103、（37.7±12.5）×103，均明顯低于正常對照組（85.8±11.2）×103，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.3 SETDB1 的表達與IBD 患者疾病活動度的相關(guān)性分析

CD 及UC 患者腸黏膜組織中SETDB1 的表達與其疾病活動度評估指標CDAI 及Mayo 評分具有一定的相關(guān)性。見圖3。

3 討論

IBD 是一種腸道慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機制尚不清楚。多數(shù)研究認為，其發(fā)病原因與腸道自身免疫系統(tǒng)、感染因素、環(huán)境因素、遺傳因素等均有一定的相關(guān)性［10-11］。其中，免疫失衡及腸道黏膜屏障功能障礙是IBD 發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。因此，維持機體的免疫平衡［12］及腸道黏膜的屏障功能完整［13］是IBD 治療的關(guān)鍵所在。流行病學(xué)研究顯示：IBD 的發(fā)病率在西方國家逐漸趨于穩(wěn)定，但是在發(fā)展中國家仍呈逐年增高的趨勢［14］，已成為消化專業(yè)研究的熱點和難點之一［15］。因此，進一步闡明研究IBD 發(fā)病相關(guān)機制，是一項十分重要且亟待解決的任務(wù)，具有重要的臨床價值及意義。

SETDB1，也稱為ESET 或KMT1E，是一種含有SET 結(jié)構(gòu)域的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT），屬于Suvar3-9 家族，可以通過三甲基化H3K9 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。SETDBl 蛋白早期發(fā)現(xiàn)是Huntington 病治療的靶點［16］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SETDBl 蛋白的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著十分密切的關(guān)系。胰腺導(dǎo)管腺癌中，SETDB1 通過調(diào)節(jié)p53 的表達來抑制細胞凋亡［17］；SETDB1 可通過驅(qū)動結(jié)直腸癌細胞從G0/G1 期進入S 期從而促進癌細胞的增殖［18］；在非小細胞癌中，超氧化物歧化酶1（SOD1）通過miR-409-3p/SOD1/SETDB1 表觀遺傳調(diào)控前饋環(huán)促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移［19］。SETDB1 在IBD 發(fā)病中的作用目前研究較少，僅有個別研究顯示：小鼠腸道上皮細胞SETDB1 的缺失與腸道上皮細胞分化，屏障破壞，炎癥和死亡有關(guān)，SETDB1 在維持腸上皮屏障穩(wěn)態(tài)中可能發(fā)揮著重要作用［6］。

本研究提示SETDB1 可能在IBD 的發(fā)病中扮演著重要角色，為IBD 發(fā)病機制的相關(guān)研究提供了新的方向和靶點。但SETDB1 在IBD 發(fā)病中的具體作用機制尚需進一步的研究。中山大學(xué)附屬郭建平教授團隊研究發(fā)現(xiàn)SETDB1 介導(dǎo)的AKT 的甲基化與PI3K 介導(dǎo)的AKT 的磷酸化相互作用，SETDB1 與PI3K協(xié)同調(diào)控AKT的活化［20］。mTORC1 是PI3K/AKT 信號通路下游的主要靶基因，且mTOR 抑制劑他克莫司在UC 誘導(dǎo)緩解和維持治療方面均具有顯著的治療效果［21］。上述研究提示，SETDB1 可能通過PI3K/AKT-mTOR 通路在IBD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但具體作用機制仍需進一步探究。